李諦音 何永興 韓建庭 李坤 王志平 李妙慧

（1. 蘭州大學第二醫(yī)院泌尿外科 甘肅省泌尿系疾病研究重點實驗室，蘭州730030；2. 蘭州大學生命科學學院細胞活動與逆境適應教育部重點實驗室，蘭州730000；3. 四川大學華西臨床醫(yī)學院，成都610041）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，Pf）是一種革蘭氏陰性可動桿菌，廣泛分布于土壤、水等自然環(huán)境中［1]；其最適生長溫度和最適生長pH分別為4-32℃和4-8，具有廣泛適應性、營養(yǎng)多樣性和代謝復雜性的特點［2]。一方面，Pf是生防菌株的重要一員并參與生物降解與工業(yè)生物轉化［3]，其產(chǎn)生的豐富次級代謝產(chǎn)物，如2，4-二乙?；g三苯酚、吩嗪和藤黃綠菌素等［4-5]，及多樣的代謝機制已被廣泛研究。另一方面，Pf對環(huán)境中多種有害化合物的響應機制也備受關注，尤其是多樣的抗生素抗性基因，很可能成為基因水平轉移的儲庫［6-7]。

研究表明，Pf對多種抗生素的耐受性常由外排系統(tǒng)介導。外排泵是一種膜轉運蛋白，廣泛存在于許多微生物基因組中，它不僅參與正常物質運輸和代謝，還能轉運抗生素、重金屬、有機溶劑、去污劑等毒性分子，調節(jié)微生物對不同環(huán)境的適應能力［8]。EmhABC是熒光假單胞菌2P24中最主要的RND（Resistance nodulation division）家族外排泵，其基因缺失菌株對氨芐西林、卡那霉素、慶大霉素等多種毒物的耐受性大幅下降［9]，可見EmhABC能夠顯著影響細菌對外界有毒物質的抵抗能力，但目前對EmhABC的調控機制并不清楚。本研究中，我們鑒定了熒光假單胞菌2P24中一個新的OmpR家族轉錄因子RstA，證實RstA能夠直接調控外排泵基因emhABC的表達并影響細菌多重耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 野生型熒光假單胞菌2P24菌株由中國農(nóng)業(yè)大學張立群教授惠贈；大腸桿菌DH5α、Wm3064及BL31（DE3）感受態(tài)細胞購自美國Novagen；表達載體pET28b、敲除載體pK18mobsacB及報告基因載體pRG970由本實驗室保存；本研究中所使用的引物見表1。

表1 PCR擴增所用引物

1.1.2 試劑與儀器 細菌基因組提取試劑盒、質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，Taq MIX購自北京佳蘭生物科技有限公司，T4連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI、定量PCR相關制品購自大連寶生物工程有限公司，氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、洛美沙星、氨芐霉素、四環(huán)素、強力霉素、IPTG購自百靈威科技有限公司，美羅培南、BSA購自索來寶生物，o-nitrophenol、咪唑購自美國Sigma-Aldrich。DU530 UV/Vis 分光光度計購自美國Beckman Coulter，NanoDrop2000購自美國Thermo Fisher，凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 共適應性分析 Cofitness Browser Database（http：//fit.genomics.lbl.gov/cgi-bin/myFrontPage.cgi）由美國加州大學伯克利分校研究組建立，通過構建隨機轉座子插入突變體庫并聯(lián)合全基因組測序（Random Bar Code Transposon-site Sequencing，RBTnSeq），評估了32株來自不同種屬菌株突變體對多種生長環(huán)境的適應度。每個菌株內(nèi)都涉及上千種基因缺失突變；生長條件設置包括94種碳源、45種氮源及34-55種抗生素或金屬離子。具體評估過程如下：將某菌種所有轉座子突變株的混合體在某一生長條件下培養(yǎng)4-8代后，采用DNA Barcode Sequencing技術對比所有突變體培養(yǎng)前后各自標記基因的豐度，并以培養(yǎng)前后該基因突變體豐度比值的對數(shù)表征菌株適應度（Strain fitness）；基因適應度Gene fitness為不同菌株適應度的加權平均值，并通過計算t值評估每個基因的菌株適應度值的一致性（|t|＜4時無參考意義），即：

在Cofitness Database中，參數(shù)Fitness即指上文中的Gene fitness，F(xiàn)itness＜0表示某基因對某特定生長條件的適應很重要，F(xiàn)itness＞ 0則表示某基因對增殖有害，突變體具有生長優(yōu)勢。一般當Fitness＜-2或＞ 2時表示對生長影響明顯。而數(shù)據(jù)庫中的Cofitness值則指同一細菌中一對基因的所有適應度值具有Pearson相關性，即具有相似的適應度模式。通常，Cofitness值＞ 0.75，提示兩基因可能在相同的通路中發(fā)揮作用；Cofitness值＞ 0.6，且它們的直系同源物Cofitness值也＞0.6，即保守共適應性（Conserved Cofitness），則亦證實緊密功能關系［10-11]。本研究中分別BLAST EmhA、EmhB、EmhC蛋白序列后分析其共適應蛋白及共適應條件。熒光假單胞菌2P24基因組數(shù)據(jù)取自NCBI，同源序列比對采用軟件MEGA7.0完成。

1.2.2rstA基因缺失菌株的構建 本研究中采用兩步同源重組法構建基因缺失菌株［9]，即以熒光假單胞菌2P24基因組為模板，分別用引物rstAkoUF/rstAkoU-R和rstAkoD-F/rstAkoD-R擴增出rstA上下游同源臂，并利用重疊延伸PCR技術融合［12]，隨后采用同源重組的方法將該片段構入pK18mobsacB質粒。重組質粒先轉化入大腸桿菌Wm3064感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后經(jīng)接合轉入熒光假單胞菌2P24中，經(jīng)Kan、Amp各50 μg/mL 的雙抗 King’s B（KB）培 養(yǎng) 基［13]（ 蛋 白 胨 20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，K2HPO41.97 g/L，丙三醇10 mL/L）28℃過夜培養(yǎng)后，篩選出載體rstA刪除序列與基因組序列發(fā)生第一次同源重組成功的菌株并采用引物RstA-F/RstA-R加以驗證，隨后該菌株于無抗KB培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)8 h后利用10%蔗糖無抗KB平板篩選，獲得第二次同源重組成功的菌株，經(jīng)引物RstA-F/RstA-R驗證得到rstA基因缺失菌株。

1.2.3 抗生素最小抑制濃度測定 將熒光假單胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株以1∶100接種至新鮮KB無抗培養(yǎng)基，28℃過夜培養(yǎng)后測定OD600，以1 OD600≈ 109CFU/mL計數(shù)并稀釋。準備無菌96孔板，采用2倍稀釋法準備不同濃度的抗生素培養(yǎng)基，取100 μL分別加入96孔板第1至第12孔，之后于每孔中加入100 μL稀釋后菌液，確保每孔約104-105個細胞，每種抗生素設置三次平行試驗，每板設置一個陰性對照組，即以雙蒸水代替抗生素，其余操作步驟均相同。將平板置于28℃搖床培養(yǎng)16-18 h后用酶標儀測定每孔的吸光值OD570，獲得抗生素對細菌的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）［14]。

1.2.4emhA及emhC轉錄水平檢測 熒光假單胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株以1∶100接種至新鮮無抗KB培養(yǎng)基，于28℃搖至OD600= 0.3。按RNA提取試劑盒說明提取總RNA，確定RNA濃度及純度后按反轉錄試劑盒說明獲得cDNA并于-20℃保存。設計靶基因emhA（引物AQ-F/ AQ-R）、emhC（引物CQ-F/CQ-R）及參照基因16S rRNA（引物16s-F/16s-R）的qRT-PCR引物，以cDNA為模板，采用Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒完成qRT-PCR。最后以ΔΔCT法進行目的基因表達量分析。

1.2.5 β-半乳糖苷酶實驗 在pRG970半乳糖苷酶表達基因上游融合emhABC基因的調控序列（引物emhAlacZr-F/emhAlacZr-R）［15]，將構建的 pRG970-pemhABC報告質粒經(jīng)供體菌（大腸桿菌WM3064感受態(tài)細胞）接合轉入熒光假單胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株。上述質粒轉入成功的菌株以1∶100接種至新鮮無抗KB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至OD600= 0.6后檢測β-半乳糖苷酶活性［16]。

1.2.6rstA基因的克隆 以熒光假單胞菌2P24基因組為模板，采用引物RstA-F/RstA-R擴增出rstA全基因序列，將該擴增產(chǎn)物與表達載體pET28b分別使用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI進行同步雙酶切，凝膠回收后T4連接酶連接并轉化至大腸桿菌DH5α，挑選雙酶切驗證成功的重組表達載體pET28b-rstA送至金唯智測序。

1.2.7 RstA蛋白的表達與純化 將重組質粒轉化到表達宿主BL21（DE3），并轉接于50 mL含Kan（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)物按1∶50轉接到1 L含Kan（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，16℃誘導表達20 h后通過離心收集菌體（8000×g，10 min），而后用30 mL懸浮液（20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L咪唑，400 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸菌體并超聲破碎，經(jīng)4℃，12 000×g，30 min離心得上清液并采用Ni-NTA親和柱純化目標蛋白，掛載的His-RstA蛋白由洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L咪唑，400 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗脫后采用超濾法進行溶液置換，使咪唑濃度低于5 mM，最終將蛋白濃度濃縮至4 mg/mL凍存于-80℃待用。

1.2.8 凝膠阻滯實驗 利用引物FAM-emhAp-F/FAM-emhAp-R擴增emhA基因啟動子區(qū)域，并用NanoDrop2000測定其濃度，將純化后的DNA片段（0.225 pmol/L）與不同濃度純化后的His-RstA蛋白在EMSA結合緩沖液中混合，反應的體系為20 μL，于常溫下孵育30 min后加入5 μL上樣緩沖液，通過6%的非變性PAGE電泳檢測結合活性［17]。

2 結果

2.1 轉錄因子RstA與外排泵EmhABC共適應性分析

采用Cofitness Browser Database 數(shù)據(jù)平臺對EmhABC的共適應蛋白進行預測分析。分別對熒光假單胞菌外排泵EmhABC不同組件EmhA、EmhB、EmhC在該數(shù)據(jù)庫中BLAST后，選擇匹配度高且注釋顯示同為RND外排泵家族的Pf6N2E2_2823（98.1%identity）、Pf6N2E2_2824（98.9%）、Pf6N2E2_2825（99.4%）作為emhABC的功能同源蛋白［11]（表2），分別預測其共適應蛋白后結果顯示：Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825三者之間互為最強共適應關系，Cofitness值及Conserved值均大于0.9；同時，三者共適應物列表中均可見Pf6N2E2_463（注釋為轉錄因子蛋白RstA），共適應強度排名分別為9#、9#、11#（圖 1-A），Cofitness值分別為 0.5、0.53、0.53，且Conserved值均大于0.6。同時在Pf6N2E2_463共適應物列表中Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825分 別 位 于 列 表 的 11#、7#、8#位，Cofitness值及Conserved值同上。對比Pf6N2E2_463 與 Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825在多種生長條件的適應度（Fitness）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)它們的基因缺失突變株對多種有害物質脅迫環(huán)境的適應度下降，其中夫西地酸、四環(huán)素、洛美沙星、壯觀霉素及氯霉素等是它們有著共同適應度改變的脅迫條件，F(xiàn)itness值均在-1 - -6之間（圖1-B）。

表2 EmhABC不同組件同源蛋白

2.2 熒光假單胞菌中rstA同源序列比對

以熒光假單胞菌2P24基因組為檢索對象，將Pf6N2E2_463基因序列BLAST后得到序列C0J56_12295，經(jīng)序列比對明確C0J56_12295（rstA）是Pf6N2E2_463在熒光假單胞菌2P24中的同源序列，序列匹配度（Identity）大于90%。rstA編碼序列全長702 bp，編碼多肽含有233個氨基酸。RstA蛋白預測分子量為26.30 kD，理論等電點為5.53。

2.3 rstA基因缺失菌株的鑒定

經(jīng)編碼框內(nèi)刪除的方式構建rstA基因缺失菌株（ΔrstA），框內(nèi)刪除后剩余序列約250 bp。如圖2（左）示單交換菌落篩選結果，即相比野生型熒光假單胞菌2P24菌株，以引物RstA-F/RstA-R 擴增后分別在700 bp和250 bp顯示條帶，說明pK18mobsacB載體上包含的rstA編碼框內(nèi)刪除后序列已同熒光假單胞菌2P24基因組發(fā)生第一次同源重組。隨后，經(jīng)10%蔗糖固體培養(yǎng)基篩選后得到發(fā)生第二次同源重組的菌株，如圖2（右）示雙交換菌落篩選結果，即由引物RstA-F/RstA-R擴增得到兩種長度的單一片段，其中若第二次同源重組后回復為野生型菌株，則條帶位于700 bp；若位于250 bp附近，則表明rstA編碼框內(nèi)刪除后序列已在基因組水平完全取代原序列，ΔrstA菌株構建成功。

2.4 RstA直接影響熒光假單胞菌多重耐藥性

抗生素最小抑制濃度（MIC）測定顯示，相較于熒光假單胞菌2P24野生型菌株，ΔrstA菌株對多種抗生素敏感性增加，其中氯霉素、卡那霉素及慶大霉素對ΔrstA的MIC值均降低4倍，強力霉素降低8倍；而氨芐霉素、四環(huán)素、洛美沙星和美羅培南對ΔrstA的MIC值下降不顯著，降低2倍或不變（表3）?？梢奟stA能夠直接影響熒光假單胞菌2P24對多種抗生素脅迫環(huán)境的耐受。

圖1 外排泵EmhABC與轉錄因子RstA的共適應分析

圖2 rstA基因缺失菌株的構建

表3 多種抗生素對三種菌株的MIC值（μg/mL）

2.5 RstA正向調節(jié)emhABC的表達

ΔrstA菌株中emhA與emhC基因的mRNA水平較野生型下降超過3倍（圖3）；同樣，β-半乳糖苷酶報告基因實驗也顯示，ΔrstA菌株中β-半乳糖苷酶的活性較野生型下降3倍（圖4）。該結果表明RstA對emhABC有正向調控作用。

2.6 RstA蛋白的表達與純化

構建pET28b-rstA重組質粒并轉化至表達宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導，如圖5可見27 kD處有一明顯條帶，說明目標蛋白His-RstA已成功表達。經(jīng)固定金屬離子親和色譜的方法對His標簽蛋白純化后得到如圖所示高純度His-RstA蛋白。

圖3 qRT-PCR檢測emhA、emhC基因轉錄水平

圖4 β-半乳糖苷酶實驗檢測emhABC表達水平

圖5 His-RstA蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

圖6 重組蛋白His-RstA與啟動子區(qū)域結合活性

2.7 凝膠阻滯實驗

凝膠阻滯實驗結果（圖6）顯示：隨著RstA蛋白濃度的升高，emhABC基因上游調控區(qū)內(nèi)長度為0.225 pmol/L DNA片段的遷移速率逐漸降低，當?shù)鞍踪|終濃度達到4 μmol/L時，反應體系中大部分DNA的遷移被阻滯，表明RstA能夠特異性地結合在emhABC啟動子區(qū)域。

3 討論

熒光假單胞菌2P24最早分離自山東省小麥根際周圍的土壤中［18]，目前大多研究主要針對其次級代謝產(chǎn)物2，4-二乙酰基間三苯酚的產(chǎn)生與調節(jié)［16，19]、群體感應效應對其在植物根際定植的影響［20]、抗生素合成調節(jié)［21]及三型分泌系統(tǒng)結構功能［22]等方面展開。EmhABC是目前報道熒光假單胞菌2P24中最重要的RND家族外排泵，張立群課題組研究發(fā)現(xiàn)，EmhABC不僅參與調控次級代謝產(chǎn)物2，4-二乙?；g三苯酚的產(chǎn)生，還顯著影響細菌對多種毒性小分子的耐受性［9]。為了進一步明確熒光假單胞菌2P24對該重要外排泵的調控機制，我們借助Cofitness Browser數(shù)據(jù)庫及序列比對，發(fā)現(xiàn)OmpR家族轉錄因子RstA同EmhABC存在共適應性，二者對多種抗生素脅迫環(huán)境的適應貢獻相似。因此，我們推測RstA很可能同EmhABC位于同一調控通路。為了證實這一猜想，我們首先構建了rstA基因缺失菌株，明確RstA直接影響熒光假單胞菌2P24對多種抗生素的耐藥性。之后，通過對emhA、emhC轉錄水平及emhABC表達水平的檢測，證實RstA能夠正向調控emhABC的表達，這也同共適應性預測結果及抗生素敏感性測定實驗的結果相一致。

OmpR家族成員均為DNA結合蛋白，屬于翼狀螺旋轉錄因子，其蛋白折疊模式很保守，即包含有與DNA大溝相互作用的識別螺旋，及與DNA小溝接觸的側環(huán)或“側翼”，常結合于靶基因啟動子區(qū)域發(fā)揮轉錄調控作用［23]。OmpR家族成員幾乎均為雙組分系統(tǒng)中的反應調節(jié)蛋白（Response regulator，RR）組分，常與同源的組氨酸激酶蛋白（Histidine kinase，HK）組分一起參與微生物對外界環(huán)境的感受和應答［24]。RR常經(jīng)磷酸化后發(fā)生構象改變而獲得功能活性，并進一步發(fā)揮調控作用［25]。據(jù)報道，OmpR家族RR常通過發(fā)生二聚體化結合在DNA啟動子區(qū)的串聯(lián)重復序列，進而發(fā)揮轉錄激活或抑制功能［26]。

根據(jù)NCBI中的功能預測注釋，RstA屬于RR，為了進一步明確RstA對emhABC的調控機制，我們表達純化出RstA蛋白，并通過凝膠阻滯實驗證實RstA能夠特異性地結合在emhABC上游啟動子區(qū)域，表明RstA能夠直接與emhABC啟動子區(qū)發(fā)生相互作用，但其中更為深入的作用機制，如二者的互作位點、RstA同源HK在其中扮演的角色及RstA的效應模式是否符合OmpR家族RR的常規(guī)工作模式等仍需深入研究。當然，RstA是否還參與調控其他生理功能也需要進一步探索。觀察ΔrstA與ΔemhABC相較于野生型對各抗生素的敏感性變化不難發(fā)現(xiàn)，二者的抗性變化譜存在一定差異，因此我們推斷RstA很可能還通過調控其他外排泵影響細菌的多重耐藥性。

4 結論

本研究以熒光假單胞菌2P24為研究對象，發(fā)現(xiàn)了一個新的OmpR家族轉錄因子RstA并對其進行功能鑒定。結果表明，RstA通過結合在emhABC上游啟動子區(qū)域正向調控emhABC的表達，并可能經(jīng)多個途徑影響熒光假單胞菌2P24的多重耐藥性。