凌翓 紀(jì)明華 段海燕 史吉平，3 孫俊松，3

（1. 中國科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 上?？萍即髮W(xué)，上海 201210）

乙醇酸是一種水溶性α-羥基酸（AHA），通常被添加到乳液聚合物、溶劑、油墨或涂料中改善制劑的流動(dòng)性并增加其光澤度。因此常用于表面處理，是家用清潔液中常用的活性成分，同時(shí)在紡織工業(yè)中作為染色劑和鞣劑被廣泛使用［1]。乙醇酸也是護(hù)膚品工業(yè)中最廣泛使用的α-羥基酸之一，其分子很小，可以輕易地穿透皮膚、刺激膠原蛋白的再生，且相比于其他AHA，乙醇酸對于加速衰老皮膚脫落的功效更加顯著［2-3]。此外，乙醇酸還可在食品加工中作為調(diào)味劑和防腐劑［4]。

乙醇酸的工業(yè)制備主要是利用甲醛羰基化的合成路徑，使用合成氣進(jìn)行催化，這種方式成本較低［5]。也可以通過氯乙酸與氫氧化鈉反應(yīng)后的再次酸化去氯制備乙醇酸［6]。其他方式包括草酸加氫等也可制備［7]，但價(jià)格較高。此外，包括大腸桿菌等在內(nèi)的多種微生物存在著氧化木糖獲得2-酮-3-脫氧-D-木糖酸，再經(jīng)過醛縮酶催化后生成乙醇酸的Dahms Pathway（圖 1）［8]。

枯草芽孢桿菌是一種獲得了GRAS認(rèn)證地位的、可用于食品工業(yè)的安全生產(chǎn)菌株，具有高分泌胞外蛋白、不含脂多糖等諸多優(yōu)良特性，被大量用于工業(yè)蛋白的生產(chǎn)［9]。此外，這類生產(chǎn)菌株?duì)I養(yǎng)代謝譜廣，代謝產(chǎn)物較豐富，近年來也被用于多種化學(xué)品的生物制造，尤其是用于食品及化妝品市場的有機(jī)物的合成［10]。雖然枯草芽孢桿菌可以利用木糖為碳源，卻缺少將木糖氧化為木糖酸，再合成乙醇酸的天然途徑。為了能夠獲得一株可以生產(chǎn)乙醇酸的食品安全菌，本研究將來自大腸桿菌的Dahms Pathway引入枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)重組菌株可以結(jié)合自身的醛縮酶同工酶，僅在過表達(dá)YjhG后就可以將木糖酸高效地轉(zhuǎn)化為乙醇酸。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株、質(zhì)粒信息以及PCR所用的模板及引物序列等信息如表1所列，其中枯草芽孢桿菌A164S為實(shí)驗(yàn)室改造的實(shí)驗(yàn)菌株［11]。

表1 菌株，質(zhì)粒和引物

基因組DNA提取試劑盒、PCR清潔試劑盒、質(zhì)粒小劑量提取試劑盒等，購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶，康為世紀(jì)生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BamH I，賽默飛世爾科技公司；堿性磷酸酶CIAP，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Phanta高保真DNA聚合酶、一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司。

S1000TMPCR擴(kuò)增儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限責(zé)任公司；Tanon EPS30電泳槽及Gel DocTM XR+全自動(dòng)凝膠成像儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限責(zé)任公司；NANODROP 2000c微量分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司；高效液相色譜儀，日本島津制作所株式會(huì)社；高速冷凍離心機(jī)，艾本德生命科學(xué)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱及恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的搖瓶培養(yǎng)均使用LB培養(yǎng)基：10 g/L 氯化鈉，10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸取物；枯草芽孢桿菌A164S誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為含1%（W/V）木糖的LB培養(yǎng)基；發(fā)酵產(chǎn)乙醇酸的培養(yǎng)基為添加了30 g/L木糖酸的LB培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)需要時(shí)，添加的氨芐青霉素（Amp）濃度為100 μg/mL，芽孢桿菌培養(yǎng)時(shí)所用的氯霉素（Cm）濃度為 7.5 μg/mL。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 以大腸桿菌E. coliW3110為模板，以引物對YjhGeco-F和YjhGeco-R進(jìn)行高保真PCR得到目標(biāo)yjhG基因產(chǎn)物，以引物對YjhHeco-F和YjhGeco-R進(jìn)行高保真PCR得到目標(biāo)yjhH-yjhG雙基因產(chǎn)物（引物序列見表1），將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔并測定濃度。用BamH I快切酶將質(zhì)粒pMK4-PxylA-comK 線性化并切除comKDNA 片段［11]，在37℃中反應(yīng)3 h后加入1 μL堿性磷酸酶，繼續(xù)反應(yīng)1 h后進(jìn)行清潔并測定濃度。將清潔后的質(zhì)粒和片段通過一步克隆試劑盒進(jìn)行連接，之后立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子經(jīng)colony PCR驗(yàn)證后，提取質(zhì)粒DNA，通過DNA測序驗(yàn)證了質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。

1.2.3 大腸桿菌感受態(tài)的制備及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 大腸桿菌E. coliDH5α感受態(tài)的制作采用氯化鈣法，置于-80℃冰柜保存。將轉(zhuǎn)化所需的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞置于冰上解凍，取10 μL重組產(chǎn)物加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻，冰上放置30 min。放入42℃水浴中熱激90 s，立即置于冰上冷卻1-2 min。加入700 μL無抗LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200 r/min培養(yǎng)1 h。將Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基平板在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。取出轉(zhuǎn)化細(xì)胞，500 r/min離心5 min后棄掉400 μL上清，用剩余培養(yǎng)基重懸菌體后用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16 h。長出單菌落后，挑取菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證并印章，引物為質(zhì)粒上的特有片段。

1.2.4 枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備及誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 將單克隆菌株B. subtilisA164S轉(zhuǎn)接到3 mL液體LB試管中，過夜培養(yǎng)8-12 h。吸取62 μL的木糖溶液0.5 g/mL加入到一支新鮮的3 mL液體LB試管中，37℃預(yù)熱。加入0.3 mL的過夜培養(yǎng)A164S菌液，在37℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng)3 h，即得到枯草芽孢桿菌A164S的轉(zhuǎn)化感受態(tài)。用2.0 mL的無菌EP管進(jìn)行分裝，每管加入菌液0.5 mL。每管感受態(tài)細(xì)胞加入1.0 μg質(zhì)粒，混勻后在37℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng)1.5 h。將氯霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱。取出轉(zhuǎn)化細(xì)胞，500 r/min離心5 min后棄掉300 μL上清，用剩余培養(yǎng)基重懸菌體后用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16 h。當(dāng)平板上長出陽性轉(zhuǎn)化子后，挑取單克隆，通過colony PCR驗(yàn)證質(zhì)粒的存在。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)入已構(gòu)建成功質(zhì)粒的A164S菌株轉(zhuǎn)接入搖瓶進(jìn)行發(fā)酵。在平板上挑取經(jīng)過驗(yàn)證的單克隆，轉(zhuǎn)接到3 mL帶有氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)8-12 h。將LB培養(yǎng)基分裝到250 mL的三角瓶中，每個(gè)瓶子裝50 mL。將已滅菌的木糖酸加入LB培養(yǎng)基，使終濃度為20 g/L。將過夜培養(yǎng)的菌液全部轉(zhuǎn)接到三角瓶，在37℃ 200 r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)OD600約0.4時(shí)加入0.5 g/mL的木糖溶液500 mL。

1.2.6 高效液相色譜檢測 標(biāo)準(zhǔn)樣品測定及發(fā)酵液組分測定均采用高效液相色譜法，色譜柱為HPX-87H，流動(dòng)相為0.005 mol /L的稀硫酸溶液，流速為 0.8 mL/min，柱溫箱溫度為60℃，進(jìn)樣體積為20 μL，使用視差檢測器和紫外檢測器進(jìn)行檢測。

精密稱取木糖酸標(biāo)準(zhǔn)品約0.1 g（精確至0.1 mg），用去離子水溶解制成1 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，濃度為100 g/L，4℃冰箱內(nèi)保存。取適量木糖酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，稀釋成（g/L）：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，按上述色譜條件采集10張色譜圖，以木糖酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積y對標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度x（g/L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密稱取乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)品約0.1 g（精確至0.1 mg），用去離子水溶解制成1 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，濃度為100 g/L，4℃冰箱內(nèi)保存。取適量乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，稀釋成（g/L）：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，按上述色譜條件采集10張色譜圖，以乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積y對標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度x（g/L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

每隔一定時(shí)間將發(fā)酵所用三角瓶從搖床中取出，在超凈工作臺(tái)中吸取1 mL發(fā)酵液到1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心10 min后將上清收集到干凈的1.5 mL EP管。將發(fā)酵液稀釋10倍，用1 mL針管吸取約300 μL后，通過0.22 μm親水針式濾器加入襯管中，制成液相樣品，按上述色譜條件進(jìn)行色譜圖采集。

2 結(jié)果

2.1 代謝途徑分析及質(zhì)粒構(gòu)建

枯草芽孢桿菌可以利用木糖作為碳源，經(jīng)磷酸化后由5-磷酸核酮糖進(jìn)入五糖磷酸途徑（Pentose Phosphate Pathway），但沒有直接氧化木糖產(chǎn)生乙醇酸的代謝途徑，如圖1所示。而大腸桿菌中存在這個(gè)代謝途徑，因此，本研究選取來自大腸桿菌Dahms Pathway的兩個(gè)酶，在枯草芽孢桿菌中作過表達(dá)。

如圖2所示，來自大腸桿菌的yjhH以及yjhG構(gòu)成一個(gè)操縱子，因此可以由一次PCR完成對兩個(gè)基因的同時(shí)克隆。質(zhì)粒pMK4-comK經(jīng)BamH I線性化后，通過一步克隆試劑盒與DNA片段連接，得到質(zhì)粒pMK4-yjhHG。質(zhì)粒pMK4-yjhG則用來只表達(dá)YjhG，兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄均由可誘導(dǎo)的木糖啟動(dòng)子PxylA完成。質(zhì)粒構(gòu)建完成后，經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)入高轉(zhuǎn)化效率的枯草芽孢桿菌A164S，分別得到轉(zhuǎn)化子A164S-HG和A164S-G。

圖1 枯草芽孢桿菌的木糖及引入的木糖酸代謝途徑示意圖

將重組菌培養(yǎng)后，利用質(zhì)粒提取試劑盒從重組細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，再利用BamH I進(jìn)行酶切，分別得到一條約7 000 bp的質(zhì)粒條帶以及一條約1 000 bp（yjhG）的條帶和約2 000 bp（yjhH）的DNA條帶，如圖3所示。

2.2 代謝底物及產(chǎn)物的鑒定及標(biāo)準(zhǔn)品定量

如圖1所示，yjhG編碼的蛋白是木糖酸脫水酶，它的催化產(chǎn)物是2-酮-3-脫氧-D-木酮酸，該化學(xué)中間體在醛縮酶（YjhH）的作用下，生成乙醇醛及丙酮酸。為了測定導(dǎo)入了Dahms Pathway的重組枯草芽孢桿菌的生物活性，以未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的枯草芽孢桿菌A164S作為對照，在發(fā)酵預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子A164S-HG和A164S-G的發(fā)酵液中檢測到了底物木糖酸的消耗及新產(chǎn)物的產(chǎn)生，通過與乙醇酸及其他可能產(chǎn)物（乙醇醛、乙二醇）標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖進(jìn)行比對，確定產(chǎn)物成分為乙醇酸，如圖4所示。

為了檢測新產(chǎn)物的濃度，進(jìn)行了乙醇酸標(biāo)準(zhǔn)濃度的測定（圖5-A），乙醇酸的濃度和形成的紫外吸收峰面積之間的線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.998（圖5-B）。

2.3 YjhG以及YjhHG在枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)

3個(gè)不同的轉(zhuǎn)化子A164S、A164S-HG或A164S-G，被平行接入加入5 g/L木糖和30 g/L的木糖酸的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵過程中每隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行OD600測定和發(fā)酵液組分測定。

OD600測定結(jié)果如圖6-A所示，A164S-G轉(zhuǎn)化子的生長情況略優(yōu)于A164S-HG。通過對色譜圖中相應(yīng)物質(zhì)的峰面積進(jìn)行分析后，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線可分別得到這兩種重組菌木糖酸的消耗量和乙醇酸的產(chǎn)生量，如圖6-B所示。重組枯草芽孢桿菌A164S-G的乙醇酸最高可生成約1.5 g/L的乙醇酸，消耗的木糖酸約為5.3 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到42.54%，其乙醇酸的產(chǎn)量反而大大高于同時(shí)表達(dá)YjhG和YjhH的轉(zhuǎn)化子A164S-HG。

圖2 質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化示意圖

圖3 質(zhì)粒構(gòu)建及酶切驗(yàn)證電泳圖

圖4 代謝產(chǎn)物鑒定色譜圖

圖5 乙醇酸標(biāo)樣濃度的確定

3 討論

隨著對微生物代謝途徑的深入了解，利用來自生物質(zhì)原料的廉價(jià)木糖組分進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的研究進(jìn)展飛速［12]。木糖可以用于酒精生產(chǎn)，或直接被轉(zhuǎn)化為一些重要的化學(xué)原料，如木糖醇或木糖酸［13]。而木糖酸不僅是一種重要的水泥工業(yè)原料，也是一些微生物進(jìn)一步代謝利用的底物，但枯草芽孢桿菌并不能代謝木糖酸，讓這種食品工業(yè)重要微生物獲得利用木糖酸進(jìn)行代謝的能力具有重要意義。通過KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫對多種微生物的代謝途徑的分析，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、陰溝腸桿菌等微生物均具有水解木糖酸的能力。因此，本文構(gòu)建了基于木糖酸脫水酶（YjhG）及2-酮3-脫氧-D-木糖酸醛縮酶（YjhH）的代謝支路（圖1），該支路也稱為Dahms Pathway［8]。將大腸桿菌YjhH蛋白的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌168存在兩個(gè)同源性較高的蛋白。將這些蛋白進(jìn)行比對分析后，如圖7所示，原來注釋為4-羥基四氫吡啶合酶DapA蛋白與YjhH的同源性為31%；而原來注釋為5-脫氫-4-脫氧葡糖二酸脫水酶的KdgD蛋白與YjhH的同源性為27%。因此，為了確定枯草芽孢桿菌是否具有自身的2-酮3-脫氧-D-木糖酸醛縮酶活性，本研究除了共表達(dá)YjhG/YjhH之外，還單獨(dú)表達(dá)了YjhG。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與枯草芽孢桿菌168高度同源的菌株A164S在單獨(dú)表達(dá)YjhG后就可以獲得來自于2-酮-3-脫氧-D-木糖酸裂解后的終產(chǎn)物-乙醇酸，這說明A164S含有YjhH的同工酶。

圖6 重組枯草芽孢桿菌代謝木糖酸的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7 大腸桿菌YjhH與枯草芽孢桿菌168同源蛋白的比對分析

此外，2-酮-3-脫氧-D-木糖酸裂解的直接產(chǎn)物為乙醛酸及丙酮酸，丙酮酸將被代謝利用，而乙醛酸為高活性化合物，微生物通常會(huì)利用菌體內(nèi)非特異的氧化酶或還原酶將其轉(zhuǎn)化為乙醇酸或乙二醇。而在本研究中，無論是過表達(dá)了YjhG還是YjhH/YjhG的重組菌的發(fā)酵液中均檢測不到乙二醇（圖1示意圖中的可能產(chǎn)物）。這可能由于枯草芽孢桿菌為好氧型微生物，乙醇醛還原酶的表達(dá)量很低所致［14]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)雙基因YjhHG的重組菌的乙醇酸產(chǎn)率低于單獨(dú)表達(dá)YjhG的重組菌，這可能是由于來自大腸桿菌的原始的核糖體識(shí)別位點(diǎn)（RBS）在枯草芽孢桿菌中效率不高所造成的。如圖1中的基因間序列所示，來自大腸桿菌的原始RBS序列（圖1）缺乏枯草芽孢桿菌RBS的典型特征序列（GGAGG）［15]。后續(xù)研究若要提高木糖酸的轉(zhuǎn)化效率，除了可以進(jìn)行RBS的優(yōu)化，還可以對YjhG和YjhH進(jìn)行分別表達(dá)。此外，雙基因表達(dá)（YjhHG）的轉(zhuǎn)化效率低于單獨(dú)表達(dá)YjhG的效率，且重組菌的木糖酸的利用率相當(dāng)?shù)停ǖ陀?0%），說明微生物自身含YjhH的同工酶，同時(shí)也表明YjhG可能是木糖酸氧化過程中的限速酶。因此，未來除了要通過分子生物學(xué)手段進(jìn)一步提高YjhG的表達(dá)量，還需要開展YjhG的酶學(xué)特征及工程改造研究。此外，還有必要引入來自其他微生物，如新月莖桿菌的Weimberg pathway［16-17]，進(jìn)一步豐富重組枯草芽孢桿菌的代謝途徑，并獲得直接利用木糖氧化生成木糖酸的能力。綜上所述，本研究證實(shí)了重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)食品安全級(jí)乙醇酸生產(chǎn)的可行性，為進(jìn)一步開發(fā)乙醇酸工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

以枯草芽孢桿菌為研究對象，通過質(zhì)粒過表達(dá)來自大腸桿菌的Dahms Pathway。對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵研究后表明，在枯草芽孢桿菌中單獨(dú)表達(dá)YjhG就可以讓宿主細(xì)胞獲得利用木糖酸的能力，在搖瓶培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵轉(zhuǎn)化生成乙醇酸的產(chǎn)量達(dá)到約1.5 g/L，轉(zhuǎn)化率約為42.54%；發(fā)酵產(chǎn)物中只發(fā)現(xiàn)乙醇酸的生成，沒有乙二醇，表明構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌在好氧培養(yǎng)時(shí)有利于乙醇酸的合成及后續(xù)的產(chǎn)物純化。研究發(fā)現(xiàn)，木糖酸的利用率還比較低，因此，后續(xù)有必要開展Dahms Pathway的過表達(dá)優(yōu)化研究，以提高乙醇酸的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率。