吉米拉木·加馬力 美合日班·阿不力米提 古海尼沙·買買提艾尼瓦爾·吐米爾

（新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046）

自然環(huán)境中銅和鋅元素對生物起著雙重作用。鋅是各種藻類生長代謝的重要微量元素［1-2]，但是高濃度的鋅離子通過抑制細胞分裂、影響光合作用等方式抑制藻類的生長，從而使得葉綠素含量下降［1]。鋅離子在水溶液中的濃度達到1.0-1.4 mg/L時，導致藻類的直接死亡［3]。低濃度銅是藻類代謝過程中必不可少的，但高濃度銅對藻類具有毒害性。銅對細胞代謝具有極強的抑制作用，故在生產生活中常把硫酸銅配成殺藻劑，有效控制水環(huán)境藻類的大量生長［4]。

隨著農業(yè)、工業(yè)等的不斷發(fā)展，汞、鎘、鉛、鎳、銅、鋅等重金屬污染對水生態(tài)環(huán)境、生物生存及人類健康造成威脅，已成為人類面臨解決的迫切難題之一。如今，多種生物體包括細菌、真菌、酵母、藻類以及大型植物等作為生物吸附劑，被用來吸附水環(huán)境中的重金屬。與其他生物吸附劑相比，藻類對諸多重金屬具有很好的吸附能力，資源豐富，不僅是水體重金屬污染檢測劑，更重要的作用是作為生物吸附劑，可以廣泛地應用在已被重金屬污染并且其他的生物都很難以生存的水體的改造。1949年Ruchhoft等首次提出了“生物吸附”的概念［5]；1988年，Gekeler等［6]研究指出，藻類能夠通過合成螯合肽復合物與重金屬結合，并發(fā)現(xiàn)小球藻合成的螯合肽復合物可以結合Cu、Pb、Zn、Ag和Hg等多種重金屬；2001年，浩云濤等［7]通過分離篩選得到的具高重金屬抗性橢圓小球藻（Chlorellae elipsoidea）來研究其對不同濃度的Cu2+、Cd2+、Ni2+和Zn2+的吸收富集能力，結果發(fā)現(xiàn)，小球藻對4種重金屬有較高的去除能力，去除率分別達到40.93%、98.33%、97.62%和86.88%；2010年，吳海一等研究指出：鼠尾藻對Zn2+和Cd2+的富集能力較強，修復重金屬污染的海洋水環(huán)境時，尤其是鋅的污染，可以利用鼠尾藻［8]。2011年，薛培英等［9]以黑藻為吸附劑，對重金屬進行吸附研究，結果顯示黑藻對Cu2+的最大吸附容量為42.86 mg/g，去除率達70%；2011年，Zakhama等［10]研究報道，石莼對Cu2+、Pb2+、Cd2+和Ni2+的吸附量分別為112 mg/g、230 mg/g、127 mg/g和 67 mg/g，石莼能有效地去除水環(huán)境中部分重金屬離子。在國內，2015 年熱依拉等［11]研究指出，不同濃度（1-4 mmol/L）Cu2+處理對地卷共生藻細胞結構無明顯的影響，在所有處理條件下，地卷共生藻細胞壁、細胞膜均完整，且大多數(shù)共生藻細胞處于分裂狀態(tài)。有些地卷共生藻及其內生真菌可能本身就具有對Cu2+、Zn2+等重金屬離子的耐性，在地衣共生藻抗重金屬Cu2+、Zn2+脅迫中與共生菌可能同等重要［12-15]。

為了深入了解地卷共生藻響應重金屬Cu2+、Zn2+脅迫的耐受性吸附特性和地衣共生藻在水體重金屬污染修復中是否存在一定的優(yōu)勢，本研究以2種地衣共生藻為研究對象，在 Cu2+、Zn2+脅迫下，研究地衣共生藻對Cu2+、Zn2+的吸附性，為進一步探討地衣共生內藻在水體中重金屬污染生物修復中的實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從兩種地衣體即平盤軟地卷（Peltigera elisabethae），犬地卷（Peltigera canina）內分離培養(yǎng)的地衣共生藻（2種桿裂絲藻）分別命名為：B和P.E。

地衣標本：2014 年 10 月采集于烏魯木齊米泉林場哈熊溝，海拔高度為 1 960-2 100 m，-20℃保存。

1.2 方法

以分離純化的兩種地衣共生藻（B、P.E）為實驗材料，配制含重金屬BG-11液體培養(yǎng)基及藻株懸浮液，Cu2+（20、40、60、80、100 mg/L），Zn2+（100、200、300、400、500 mg/L）對2種地衣共生藻進行培養(yǎng)12 d，隔3 d對各種指標（細胞活率，重金屬吸附特性）進行一次測定。

1.2.1 相關實驗指標的測定 細胞存活率的測定：采用伊文斯藍染色法計算細胞存活率［16]，進一步用半數(shù)致死濃度計算方法［17]來計算并分析細胞半致死濃度（LC50）。

Cu2+、Zn2+的吸附特性：配制含重金屬BG-11液體培養(yǎng)基及藻株懸浮液，對5種地衣體藻進行培養(yǎng)6 d，并通過離心（8 000 r/min，10 min），去除上清液用于測定培養(yǎng)液重金屬含量。將收集的藻體用5 mL 的 20 mmol/L Na2-EDTA 反復沖洗 10 min，然后用 5 mL的去離子水沖洗10 min，2次沖洗的溶液混合在一起用吸附于細胞表面的重金屬含量測定。采用BCO分光光度法測定銅含量［18]，雙硫腙分光光度法測定鋅含量［19]。，并按照公式計算藻細胞對重金屬的去除率：Q=（C0- C1-C2）/C0×100%。

公式中：Q為藻細胞對重金屬的去除率，C0為培養(yǎng)液中的重金屬初始濃度，C1為培養(yǎng)期結束后培養(yǎng)液中的重金屬含量，C2為細胞表面沖洗取得重金屬含量。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理 采用 Excel 2010 及 SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理與方差分析和多重比較（0.05 和 0.01水平）。

2 結果

2.1 Cu2+脅迫對2種地衣共生藻細胞活率的影響

通過伊文思藍染色劑檢測地衣共生藻的死亡，死亡細胞著色深藍色，而活細胞不著色（綠色），可明顯地區(qū)別活細胞和死亡細胞，是一種簡便、直觀的檢測方法（圖1）。

圖1 兩種地衣共生藻伊文斯蘭染色結果圖（10×40）

如圖2所示，在不同濃度脅迫下（0-100 mg/L），2種地衣共生藻（B、P.E），隨著 Cu2+濃度的提高及培養(yǎng)時間的延長（0，3，6，9，12 d），2種地衣共生藻B與P.E細胞存活率均逐步下降（P＜0.01），但具有一定的差異。

較低的Cu2+脅迫下（≤60 mg/L時），2種地衣共生藻均保留著較高的細胞活力，培養(yǎng)至12d時，仍然存活一半多的細胞，Cu2+脅迫對2種地衣共生藻的毒性作用較低；隨著Cu2+濃度的加劇，共生藻細胞的活力明顯梯度式降低，當Cu2+脅迫100 mg/L時，地衣共生藻P.E培養(yǎng)至第6d，56.66%的藻細胞可存活，但是培養(yǎng)至9 d、12 d時，藻細胞基本都死亡（32.48%、10.43%）；地衣共生藻B培養(yǎng)初期（3 d）細胞活力較明顯的下降，達12d時，只有 6.43%細胞可存活，幾乎沒有生存的細胞。結果表明，較高濃度Cu2+脅迫（80-100 mg/L），對2種地衣共生藻的影響均較顯著，但是各濃度脅迫下，地衣共生藻P.E的細胞活力均高于B，對Cu2+脅迫有較高的耐性。

圖2 不同濃度Cu2+脅迫對2種藻細胞活率的影響

2.2 Zn2+脅迫對兩種地衣共生藻細胞活率的影響

如圖3所示，不同濃度的Zn2+（0-500 mg/L）脅迫下，2種共生藻B和P.E的細胞存活率與隨著脅迫濃度及培養(yǎng)時間呈反相關，即隨著脅迫濃度的提高及培養(yǎng)時間的延長呈逐步下降趨勢（P＜0.01），但變化趨勢存在一定的差異。

較低濃度Zn2+（≤200 mg/L）脅迫下，2種地衣共生藻細胞均保留著較高的活力，并且較穩(wěn)定（細胞活力＞80%）；當Zn2+濃度300 mg/L培養(yǎng)第12天時，地衣共生藻B細胞存活率為61.49%，仍然保留著較高的細胞活力，P.E 的細胞活率分為49.99%（接近50%）；較高濃度的Zn2+脅迫（＞300 mg/L）對兩種藻的影響較大，均出現(xiàn)明顯的梯度式下降；當Zn2+濃度500 mg/L培養(yǎng)第12天時，2種共生藻B和P.E的細胞存活率分別為38.25%和26.47%，細胞基本死亡。

計算半致死濃度（LC50）來確定對重金屬的耐受性是一種可靠并且方便快捷的方法。為了比較2種地卷共生藻對Cu2+、Zn2+的耐受性，基于2種重金屬脅迫對細胞存活率的影響，進一步計算并分析3種地衣共生藻在不同濃度Cu2+、Zn2+脅迫下的半致死濃度。結果（表1）表明，Cu2+、Zn2+脅迫下，2種地衣共生藻半致死濃度均隨著培養(yǎng)時間的延長而逐步下降（P＜0.01）；不同重金屬脅迫下，2種地衣共生藻對Zn2+的LC50均高于Cu2+，說明2種地衣共生藻對Zn2+的耐性均高于Cu2+；在Cu2+脅迫下，地衣共生藻P.E各培養(yǎng)時期的LC50均高于B，地衣共生藻P.E對銅的耐受性高于B；Zn2+脅迫時，前段培養(yǎng)時間（3-9 d），地衣共生藻P.E對Zn2+脅迫有較高的耐性，但培養(yǎng)12 d時，半致死濃度急劇下降并低于B，時間對衣共生藻P.E的影響較大。

圖3 不同濃度Zn2+脅迫對2種藻細胞活率的影響

2.3 兩種地衣共生藻對Cu2+吸附特性研究

雙環(huán)己酮草酰二腙（BCO）溶液中Cu2+濃度在波長（λ610nm）處與吸光度有良好的線性關系，以Cu2+濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準工作曲線，其標準方程為y=0.0955x-0.0065，相關系數(shù)為0.9995。

細胞內（表2），在不同濃度Cu2+脅迫下，2種地衣共生藻所吸附的銅含量與Cu2+脅迫濃度呈正相關，并隨著時間的延長而逐步增加（P＜0.01），但吸附量有所差異；各濃度Cu2+脅迫下（0-120 mg/L），地衣共生藻P.E在不同時間內所吸附的銅含量均高于B。

表1 兩種地衣共生藻在Cu2+，Zn2+脅迫的半致死濃度（LC50）（mg·L-1）

表2 不同Cu2+濃度脅迫下2種地衣共生藻細胞內銅含量的變化

細胞外（表3），在不同濃度Cu2+脅迫下，藻培養(yǎng)液的銅含量變化有所差異卻不同；當Cu2+脅迫下培養(yǎng)3 d時，2種地衣共生藻B和P.E培養(yǎng)液的銅含量隨著脅迫濃度的提高呈先增加后下降趨勢（P＜0.01），當Cu2+濃度100 mg/L時，兩種地衣共生藻對培養(yǎng)液Cu2+的去除率分別為88.61%和92.35%；培養(yǎng)第6天時，隨著脅迫濃度的提高而增加（P＜0.01），但對Cu2+去除率有所下降，當Cu2+濃度100 mg/L時，B和P.E對Cu2+去除率為85.67%，84.23%。

表3 不同Cu2+濃度脅迫下2種地衣共生藻培養(yǎng)液銅含量的變化

2.4 兩種地衣共生藻對Zn2+吸附特性研究

雙硫腙-吐溫80溶液中波長（λ525nm）處的吸光度與Zn2+濃度具有良好的線性關系，其標準方程為y=0.0516x-0.0015，相關系數(shù)為0.9979。

細胞內（表4），不同濃度的Zn2+脅迫下，隨著脅迫濃度的提高，2種地衣共生藻細胞所吸附的鋅含量逐步增加（P＜0.01）；各濃度Zn2+脅迫下（0-500 mg/L），地衣共生藻P.E在不同時間內所吸附的銅含量均高于B，但地衣共生藻B所吸附的鋅含量隨著時間的延長而增加，地衣共生藻P.E則相反，隨培養(yǎng)時間的延長而下降，時間對衣共生藻P.E的影響較大。

細胞外（表5），Zn2+脅迫下培養(yǎng)3d時，隨著脅迫濃度的增加，培養(yǎng)液鋅含量及2種地衣共生藻對Zn2+的去除率逐步增加（P＜0.01），去除率分別為95.11%，95.05%，幾乎相等；隨著培養(yǎng)時間的延長（6d時），Zn2+濃度≤300 mg/L時，培養(yǎng)液的鋅含量逐步增加，≥400 mg/L時差異不顯著（P＞0.05），當Zn2+濃度 500 mg/L，B和P.E對Zn2+的去除率為95.10%，92.23%，隨著時間的延長地衣共生藻P.E對Zn2+吸附量有所下降，與地衣共生藻B幾乎相等。

表4 不同Zn2+濃度脅迫下2種地衣共生藻細胞內鋅含量的變化

表5 不同Zn2+濃度脅迫下2種地衣共生藻培養(yǎng)液鋅含量的變化

3 討論

近年來有很多研究者利用水生生物來測定污染物在水中對生命體的毒性，而利用自由生長藻類來研究污染物的毒性及污染物的吸附性。藻中所含重金屬的水平反映了藻類對水環(huán)境中重金屬的生物利用率和對重金屬的耐受性及吸附能力［20]。藻類與重金屬離子有極強的親和性，大多數(shù)研究聚焦于藻類對重金屬離子的吸附特性［21-26]，其機理包括絡合、螯合、離子交換、轉化、吸收和微沉淀等；金屬陽離子可被細胞表面的負電荷位點所吸附細胞原生質膜外有明顯的細胞壁，其在微生物吸附重金屬離子的過程中起著重要作用，它是阻止金屬離子進入細胞產生毒害的第一道屏障，并且不同藻類相對于不同重金屬離子具有不同的耐性及吸附性。許多研究表明一些來自地衣體的藻類對重金屬具有較高的耐受性及吸附特性。例如，2003年，Ba?kor 等發(fā)現(xiàn)分離培養(yǎng)的地衣共生藻在4 mmol/L Cu2+脅迫下仍能正常生長，對銅具有較高的耐性［27]；álvarez等［28]也發(fā)現(xiàn)，分離培養(yǎng)的地衣共生藻Trebouxia在100 μmol/L Pb2+脅迫下，對鉛有較高的吸附性。

為了探討來自地衣體的藻類對不同重金屬的耐受性及吸附特性，本研究以來自不同地卷屬地衣的兩種共生綠藻為研究對象，在不同濃度的銅和鋅脅迫下處理不同時間，研究吸附于地衣共生藻細胞內外所吸收的銅、鋅含量與細胞活力的影響，以確定2種地衣共生藻對銅和鋅的耐受性與其銅吸附性差異及相關性。研究結果表明，2種地衣共生藻雖然屬于同一個屬，但對不同重金屬的耐性及吸附性是有差異的；Cu2+對2種地衣共生藻的毒性作用高于Zn2+，對Zn2+的吸附性均高于 Cu2+，并且當不同濃度的Cu2+、Zn2+脅迫（3 d，6 d）時，地衣共生藻P.E的細胞活力及吸附率均高于B；可見地衣共生藻細胞活力與吸附性是有聯(lián)系的，并呈正相關性。因此，研究2種地衣共生藻吸附于細胞內和細胞外Cu2+、Zn2+含量的變化及吸附能力的差異，可為解釋地衣共生藻在響應重金屬Cu2+、Zn2+脅迫時各自的作用或協(xié)同作用及其機制提供可參考的寶貴參考資料。

4 結論

（1）Cu2+、Zn2+是植物生長的必需元素，但在高脅迫濃度下，2種地衣共生藻對Zn2+耐受性及吸附性明顯高于Cu2+，而且2種地衣共生藻對重金屬的耐受性與對重金屬的吸附性呈正相關性。

（2）來自菌藻共生的特殊生物-地卷屬地衣的2種共生藻，相比一些自由生長藻類對銅和鋅具有較高的耐受性和吸附特性，在水體重金屬污染修復中是存在一定的優(yōu)勢，可進一步做一個良好的生物吸附劑材料。因此，本研究結果加深探討環(huán)境重金屬Cu2+、Zn2+污染的生物修復中地衣共生藻作為候選生物資源應用的可行性。