周利明 盧鑫蕊 馬聲葳 房瑋

（華北理工大學生命科學學院，唐山 063210）

花粉管是一類研究細胞極性控制和生長的理想模式系統(tǒng)。作為雄配子體，花粉管通過極性生長快速通過雌蕊組織，將精細胞定向輸送到胚珠［1-2]。在這一過程中鈣離子發(fā)揮重要作用，生長中的花粉管頂端區(qū)域可以檢測到Ca2+濃度梯度（Ca2+濃度從頂端向下逐漸遞減）［3]。細胞外Ca2+的流入在很大程度上導(dǎo)致了花粉管生長過程中Ca2+梯度的形成，另外動用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中儲備的Ca2+，也有助于梯度的形成。人為干擾正常的Ca2+梯度可以導(dǎo)致花粉管生長的中止，去除干擾因素（重建正常的Ca2+梯度）可以恢復(fù)正常的花粉管極性生長［4]。利用花粉管模式系統(tǒng)研究鈣信號途徑，有助于進一步揭示植物細胞極性發(fā)育的調(diào)控機制，并對提高作物育性具備一定的現(xiàn)實意義。

Ca2+信號的傳遞有賴于下游的Ca2+傳感器，其中包括鈣依賴蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase，CPK）。以往的研究在矮牽牛花中鑒定出兩種CPK（PiCPK1和PiCPK2）。PiCPK1定位于質(zhì)膜，其過度表達導(dǎo)致花粉管頂端膨脹，并伴隨Ca2+濃度的過量堆積［5]。擬南芥基因組編碼34個CPK，其中CPK14與CPK32過量表達可以導(dǎo)致嚴重的花粉管去極化生長［6-7]。CPK17和CPK34功能缺失突變體的花粉管生長速率顯著降低，大多數(shù)都無法正確定位胚珠并使其受精［8]。CPK11和CPK24通過激活一個K+通道（SPIK1）來調(diào)節(jié)花粉管生長中的K+流入［9]。

ROP（Rho-related GTPase from plants）是植物中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)小G蛋白，控制著多種細胞類型的極性生長，包括花粉管、根毛和葉片鋪板細胞等［10-12]。ROP存在兩種形式：GTP結(jié)合的活性形式和GDP結(jié)合的非活性形式，兩者的轉(zhuǎn)變由多種上游因子嚴格調(diào)控。已發(fā)現(xiàn)的ROP上游調(diào)控因子包括GTP酶激活蛋白（GAP）、鳥苷解離抑制因子（GDI）和鳥苷交換因子（GEF）。GTP結(jié)合的活性ROP在GAP的作用下，可以有效地進行GTP的水解，從而產(chǎn)生GDP結(jié)合的無活性ROP。而GEF可以促進GDP與GTP的替換，將ROP恢復(fù)成GTP結(jié)合的活性態(tài)。只有質(zhì)膜上的ROP才可以被GEF激活，胞質(zhì)中的ROP與GDI結(jié)合，處于無活性狀態(tài)。因此，GDI和GAP是ROP的負調(diào)節(jié)因子，而GEF則被認為是ROP的正調(diào)節(jié)因子［11-13]。

煙草中的GAP1（NtGAP1）定位于亞頂端質(zhì)膜，其過量表達誘導(dǎo)生長遲緩的花粉管表型，導(dǎo)致尖端狹窄的短小花粉管。這些結(jié)果表明NtGAP1可以將ROP的活性限制在花粉管的頂端區(qū)域［14]。對于擬南芥中的GAP1（AtGAP1），其過量表達可以抑制花粉管生長中的ROP1活性。然而，敲除AtGAP1不會導(dǎo)致花粉管明顯的去極化生長表型，這表明AtGAP1可能在頂端ROP活性的調(diào)節(jié)機制中發(fā)揮次要作用［15]。目前，擬南芥中存在14個GEF，序列分析顯示它們都包括一段功能未知的保守結(jié)構(gòu)域（DUF315）。GEF1、GEF8、GEF9、GEF12 及 GEF14的過量表達可以造成不同程度的花粉管生長缺陷。其中，RopGEF1所誘導(dǎo)的花粉管去極化生長表型最為顯著［16]。

盡管花粉管極性發(fā)育的相關(guān)研究不斷深入，但小G蛋白ROP1調(diào)控花粉管頂端鈣梯度的機理仍需進一步的拓展。本研究通過構(gòu)建Ca2+傳感器CPK家族中CPK14的瞬時表達載體，并轉(zhuǎn)化煙草，統(tǒng)計花粉管的表型及定位分析，確定CPK14的生物學功能及與ROP1信號途徑的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）生態(tài)型為Columbia-0，培養(yǎng)于22℃的溫室內(nèi)（16 h光照/8 h黑暗）。煙草（Nicotiana tabacum）的培養(yǎng)溫度為28℃，光周期為12 h/12 h。載體構(gòu)建相關(guān)試劑（RNA提取試劑盒、高保真酶、限制性內(nèi)切酶及dNTP等）購于Takara。煙草瞬時表達相關(guān)試劑（金粉及易裂膜等）購于Bio-Rad公司（Bio-Rad，U.S.A.）。質(zhì)粒提純試劑盒（Plasmid Mini Kits）購于QIAGEN的產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建 以6周齡的擬南芥花朵為材料，通過總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。設(shè)計引物（上游引物：5'-GGATCCATGGTAGATTCTGACCCG-3'，下游引物：5'-GGATCCCCGACGTCGTATGTACTT-3'，下劃線處為BamHⅠ酶切位點）。以cDNA為模板，通過PCR擴增獲得CPK14片段，隨后連入T-vector并測序。測序正確的目的片段通過酶切連接至瞬時表達載體（pBLAT：GFP）。相對于全長CPK14，組成激活型CPK14（CA-CPK14）只保留了蛋白激酶區(qū)域（313個氨基酸殘基），缺少C端調(diào)控區(qū)域及鈣調(diào)素樣區(qū)域。CA-CPK14采用相似的載體構(gòu)建流程，最終連接至瞬時表達載體，用于基因槍的瞬時轉(zhuǎn)化試驗。

1.2.2 花粉管瞬時表達試驗 在每次試驗前收集成熟的煙草花粉，每組轉(zhuǎn)化試驗大約需要8朵煙草的花粉（懸浮于煙草花粉培養(yǎng)液中備用）。通過質(zhì)粒提純試劑盒（Plasmid mini kits）提取用于基因槍瞬時表達的質(zhì)粒，按照先前描述的粒子轟擊試驗程序進行相應(yīng)的操作［17]。轟擊完成的花粉粒于28℃培養(yǎng)3 h，然后進行相應(yīng)的花粉管表型及亞細胞定位觀察。

1.2.3 花粉管表型統(tǒng)計與定位分析 對于花粉管表型的分析，轉(zhuǎn)化成功的花粉管在熒光顯微鏡（BX51；Olympus）下進行觀察與拍攝（Olympus CCD攝像機，DP70）。獲得的試驗圖片通過蔡司LSM圖像瀏覽器（3.2版）的測量功能，測量花粉管的長度和最寬端部的直徑。每組轉(zhuǎn)化試驗設(shè)3次重復(fù)，并進行t檢驗。對于花粉管的亞細胞定位分析，轉(zhuǎn)化成功的花粉管在共聚焦激光掃描顯微鏡（蔡司LSM 510 meta，488 nm激發(fā)和505-530 nm發(fā)射）下進行相應(yīng)的觀察與拍攝。獲得的共聚焦圖像由蔡司LSM圖像瀏覽器（3.2版）進行分析。

2 結(jié)果

2.1 CPK14在花粉中高量表達

目前，擬南芥中已證實的鈣依賴蛋白激酶（CPK）有34個，本文重點關(guān)注那些在成熟花粉中優(yōu)先表達的CPK（推測其最有可能參與花粉管生長的調(diào)控途徑）。通過對genevestigator基因芯片數(shù)據(jù)進行表達圖譜分析，發(fā)現(xiàn)8個花粉高量表達CPK，分別是CPK14、CPK16、CPK17、CPK20、CPK24、CPK26、CPK32和CPK34（圖1）。這些CPK都是在成熟花粉粒中高度表達，但在其他組織中相對弱表達或完全不表達。通過花粉管瞬時表達體系，對花粉高量表達的CPK進行初步功能篩查。結(jié)果顯示，過量表達CPK14可以造成嚴重的花粉管生長缺陷，即長度縮短且寬度增加，形成一個腫大的花粉管頂端（圖2-圖 4）。

2.2 持續(xù)激活的CPK14抑制花粉管的萌發(fā)與生長

基于前期的CPK14相關(guān)研究成果，為了進一步探究CPK14在花粉管極性生長中的功能，構(gòu)建了組成激活型（Constitutively active，CA）的CPK14（CACPK14）。CA-CPK14缺少C端調(diào)控區(qū)域（鈣調(diào)素樣區(qū)和自抑制區(qū)），僅僅保留了蛋白激酶區(qū)。因此，CACPK14表現(xiàn)出不受Ca2+調(diào)控的持續(xù)激活特征。帶有綠色熒光蛋白（GFP）標簽的CA-CPK14通過基因槍技術(shù)在煙草花粉中進行瞬時表達，結(jié)果（圖2-圖4）顯示，CA-CPK14瞬時表達可以全面抑制花粉管的萌發(fā)與生長。一方面轉(zhuǎn)化CA-CPK14的花粉萌發(fā)率僅為43%，顯著低于89%的對照組萌發(fā)率；另一方面萌發(fā)出的花粉管表現(xiàn)出短小的表型，即花粉管的長度顯著縮短（對照組：386.63 μm；試驗組：42.64 μm），而頂端寬度與對照沒有顯著差異。

2.3 持續(xù)激活的CPK14抑制ROP1的活性

通過CA-CPK14與GFP-RIC4ΔC（活性ROP1的標記物）的共同表達試驗，從活性ROP1在花粉管頂端質(zhì)膜（PM）的分布和積累兩個方面，分析CACPK14的加入是否對ROP1的活性造成一定的影響。如圖5所示，單獨表達GFP-RIC4ΔC的花粉管中熒光信號主要集中在頂端的質(zhì)膜，而CA-CPK14的表達降低了GFP-RIC4ΔC的頂端質(zhì)膜定位，但增加了GFP-RIC4ΔC在胞質(zhì)中的積累（圖5-圖6）。

在熒光信號的分布范圍方面，將頂端最寬直徑以上的花粉管表面定義為頂端生長區(qū)域，熒光信號范圍與頂端生長區(qū)域的比值作為GFP-RIC4ΔC分布的量化指標。量化結(jié)果（圖7）顯示CA-CPK14對GFP-RIC4ΔC在花粉管的分布存在一定的抑制作用?；贑A-CPK14對GFP-RIC4ΔC熒光強度與分布的抑制作用，說明CPK14可以部分抑制ROP1在花粉管頂端質(zhì)膜上的活性。

3 討論

鈣依賴蛋白激酶CPK14在成熟花粉中高量表達，而在其他組織中較少表達（圖1），暗示了其在花粉萌發(fā)或生長中可能發(fā)揮重要作用?；诨驑屗矔r表達體系，單獨表達GFP空載的花粉管表現(xiàn)出典型的極性生長特征（細長而均勻的圓柱形花粉管），而CPK14過量表達可以引起花粉管生長極性的部分喪失，產(chǎn)生頂端膨大的花粉管表型（促進細胞膨脹）。另外持續(xù)激活型的CPK14（CA-CPK14）在花粉中瞬時表達可以抑制花粉的萌發(fā)及后續(xù)的極性生長，產(chǎn)生短小的花粉管表型（抑制細胞膨脹）。作為一類蛋白磷酸酶，CPK14過量表達與CA-CPK14瞬時表達都可能導(dǎo)致其下游底物的過度磷酸化，但實驗結(jié)果卻展現(xiàn)出相互對立的花粉管表型。這些結(jié)果暗示CPK14可能不是直接作用于花粉管生長相關(guān)的關(guān)鍵因子，而是通過中間組分間接調(diào)控這些生長因子。

圖 1 花粉高量表達CPK在各組織中的表達熱圖

圖2 CA-CPK14過量表達所造成的花粉管表型

圖3 CA-CPK14過量表達對花粉管長度的影響

圖4 CA-CPK14過量表達對花粉管寬度的影響

圖5 CA-CPK14的表達可以抑制GFP-RIC4ΔC在花粉管質(zhì)膜上的分布與強度

圖7 CA-CPK14對 GFP-RIC4ΔC定位分布影響的量化分析

本文提出一個理論模型用于揭示CPK14涉及的花粉管頂端生長機理（圖8）。其中，F(xiàn)代表調(diào)控花粉管極性生長的關(guān)鍵因子（Key factor），其活性的高低決定了花粉管極性生長的快慢。N與P分別是調(diào)控關(guān)鍵因子F活性的負調(diào)節(jié)子（Negative regulator）與正調(diào)節(jié)子（Positive regulator）。N與關(guān)鍵因子F可以在細胞質(zhì)中結(jié)合為復(fù)合體（N-F），以維持F的非激活狀態(tài)，抑制花粉管頂端膨脹。N的磷酸化導(dǎo)致N-F復(fù)合體解離，生長關(guān)鍵因子F得以釋放。P激活花粉管頂端質(zhì)膜的生長關(guān)鍵因子F（激活的F表示為F*），促進花粉管頂端膨脹。在這個模型中，N可以結(jié)合并抑制關(guān)鍵因子F的活性。當N被CPK14磷酸化會促進關(guān)鍵因子F的釋放。因此，過量的CPK14可以導(dǎo)致花粉管極性的部分喪失（花粉管頂端膨大）。

CPK的主要結(jié)構(gòu)區(qū)域有激酶區(qū)（Kinase domain）、鈣調(diào)素樣區(qū)（CaM-like domain）和自抑制區(qū)（Auto-inhibitor）。鈣調(diào)素樣區(qū)中存在4個Ca2+的結(jié)合位點（EF-hand結(jié)構(gòu)），Ca2+的結(jié)合可以釋放CPK的自抑制作用，發(fā)揮絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的活性［18-19]。因此，CPK既是Ca2+感受器（可逆結(jié)合Ca2+），也是一個效應(yīng)因子（激酶活性磷酸化下游靶蛋白）。CA-CPK14缺少自抑制區(qū)，僅保留激酶區(qū)域，表現(xiàn)出持續(xù)激活的激酶活性。CA-CPK14依照上述模型，同樣會導(dǎo)致負調(diào)節(jié)子N的磷酸化，釋放關(guān)鍵因子F，造成生長極性的喪失。然而，如圖2-圖4所示，CA-CPK14對花粉管的長度和萌發(fā)卻產(chǎn)生了顯著的抑制作用。正常生長中的花粉管頂端存在一個Ca2+濃度梯度（頂端Ca2+濃度最高），全長CPK14與CA-CPK14的關(guān)鍵區(qū)別在于C端Ca2+調(diào)控區(qū)域的有無，因此，含有Ca2+調(diào)控區(qū)域的全長CPK14受到頂端Ca2+梯度的嚴格調(diào)控，只有在頂端的生長區(qū)域發(fā)揮磷酸化作用，釋放關(guān)鍵因子F。而缺少Ca2+調(diào)控區(qū)域的CA-CPK14不受頂端Ca2+梯度的限制，在花粉管的各個區(qū)域都可釋放關(guān)鍵因子F，F(xiàn)分布到整個花粉管質(zhì)膜，而不是集中在頂端生長區(qū)。P作為F的正調(diào)節(jié)子，只在花粉管頂端質(zhì)膜的生長區(qū)發(fā)揮作用。由于F被稀釋到整個質(zhì)膜，導(dǎo)致頂端生長區(qū)（唯一存在P激活F的地方）F的相對減少，從而導(dǎo)致花粉管生長的抑制現(xiàn)象。

圖8 CPK14調(diào)控花粉管極性生長的模式圖

ROP類小G蛋白已被證實是花粉管生長的關(guān)鍵因子（相當于模型中的F），調(diào)控細胞極性的建立與維持［1-2，13，20]。CA-CPK14 的表型類似于 GAP1（ROP1的負調(diào)控因子）的表型。采用一個活性ROP1的標記物（GFP-RIC4ΔC，GFP-RIC4ΔC在花粉管頂端的熒光分布情況可以反映出有活性ROP1的分布情況［21]）。結(jié)果顯示CA-CPK14可以顯著抑制活性ROP1在花粉管頂端的分布，暗示CPK14可以通過ROP信號途徑發(fā)揮負反饋抑制的作用。CPK14可能通過磷酸化鳥苷解離抑制因子GDI（相當于模型中的N）導(dǎo)致ROP-GDI復(fù)合體的解離，釋放游離的ROP。富集到頂端質(zhì)膜的ROP進一步被鳥苷交換因子GEF（相當于模型中的P）激活，從而推動花粉管頂端生長。該研究初步揭示了擬南芥CPK14在花粉管極性生長中的功能，CPK14與ROP信號途徑的互作研究將進一步闡明CPK14的調(diào)控機理。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)8個花粉高量表達CPK，其中CPK14在花粉中表達極高，而在其他組織中幾乎不表達。CPK14的過量表達可以引起花粉管生長的極性喪失。組成激活型CPK14全面抑制花粉管的萌發(fā)與極性生長。