王海波 郭俊云 田雪蓮

（1. 曲靖師范學(xué)院 云南高原生物資源保護(hù)與利用研究中心 云南省高校云貴高原動(dòng)植物遺傳多樣性及生態(tài)適應(yīng)性進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，曲靖655011；2. 曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院，曲靖 655011）

能源植物小桐子是目前世界上最主要的生物柴油植物之一，我國在“十五”、“十一五”、“十二五”能源發(fā)展綱要中都把發(fā)展小桐子產(chǎn)業(yè)列為可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃的重點(diǎn)［1]。小桐子（Jatropha curcasL.）屬大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生落葉半肉質(zhì)小喬木或大灌木［2]。原產(chǎn)中南美洲地區(qū)，目前在我國滇、黔、川、桂、閩、粵及瓊等省份有較多野生資源分布［3]。其種子含油量高，且流動(dòng)性與石化油摻和性好，在閃點(diǎn)、凝固點(diǎn)、含硫量等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)上達(dá)到了歐四標(biāo)準(zhǔn)，成為未來最有可能替代化石能源的潛力樹種，具有廣闊的開發(fā)與利用前景。

蔗糖非發(fā)酵-1型相關(guān)蛋白激酶家族（Sucrose non-fermenting-1 related protein kinase，SnRK）屬絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）類蛋白激酶超家族（Protein kinase Superfamily），通過共價(jià)修飾調(diào)節(jié)（Covalent modification）廣泛參與植物細(xì)胞分裂、物質(zhì)代謝、基因表達(dá)調(diào)控及生物與非生物抗逆響應(yīng)等過程［4]。根據(jù)蛋白質(zhì)序列聚類結(jié)果將SnRK家族分為SnRK1、SnRK2、SnRK3三個(gè)亞家族［5]。其中，SnRK1與酵母SNF1（Sucose non-fermenting 1）和哺乳動(dòng)物AMPK（AMP-activated protein kinase）在結(jié)構(gòu)與功能上同源性較高，共同組成SNF1蛋白激酶家族［6]，負(fù)責(zé)感知并響應(yīng)胞內(nèi)低糖/低能量狀態(tài)（Energysensing protein kinase family）。根據(jù)氨基酸序列的相似性與表達(dá)模式，SnRK1可進(jìn)一步分為SnRK1a與SnRK1b兩類［7]，其中，SnRK1a在所有植物中均有表達(dá)，而SnRK1b僅存在于單子葉植物中，且具有種子高表達(dá)特異性［5]。在植物中，SnRK1存在于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中間部位，本身受到上游因子磷酸化調(diào)節(jié)，又可以通過磷酸化調(diào)節(jié)下游諸多關(guān)鍵蛋白，如α-淀粉酶（α-amylase，α-AMS）［8]、磷酸蔗糖合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）［5]、6-磷酸海藻糖合成酶（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）［9]、3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰CoA還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase，HMGR）［10]、硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）［11]、天冬酰胺合成酶（Asparagine synthetase1，ASN1/DIN6）、脯氨酸脫氫酶（Proline dehydrogenase，ProDH）［12]等，從而廣泛參與糖代謝及糖信號(hào)應(yīng)答反應(yīng)（響應(yīng)高蔗糖/低葡萄糖信號(hào)）［13]、蔗糖合成、淀粉合成與降解［14]、生長發(fā)育［5]及逆境應(yīng)答［15-16]等生理生化過程。

SnRK1蛋白激酶是由α、β、γ三個(gè)亞基組成的異源三聚體，其中催化亞基α具有保守的激酶結(jié)構(gòu)域及核心序列。第一個(gè)被克隆的SnRK1 α亞基基因來自黑麥胚乳cDNA文庫，其編碼57.7kD的蛋白質(zhì)［17]，而對(duì)于小桐子SnRK1蛋白激酶α亞基基因的鑒定、克隆及表達(dá)研究還未見報(bào)道。本研究基于小桐子基因組信息鑒定到1個(gè)小桐子SnRK1蛋白激酶α亞基基因，與擬南芥AKIN10同源［18-22]，克隆到了該基因的全長cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、器官與低溫脅迫差異表達(dá)及原核表達(dá)分析，為研究小桐子SnRK1蛋白激酶在糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能及抗逆性形成的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用小桐子種子采自云南省元謀縣干熱河谷地區(qū)。選取飽滿的小桐子種子，用1.0%CuSO4消毒20 min，無菌水漂洗5次，置于三角瓶中于26℃培養(yǎng)箱中吸漲24 h，之后無菌水中漂洗3次，播于用無菌水濕潤濾紙的托盤中，于相對(duì)濕度75%、溫度26℃、16/8 h光周期的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。將發(fā)芽的種子種植于消毒的培養(yǎng)土中并于同上條件的恒溫培養(yǎng)箱中生長15 d至第2片真葉展開，每天用無菌水澆灌培養(yǎng)土。將生長15 d的小桐子幼苗置于相對(duì)濕度75%、溫度12℃、16/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，分別取低溫脅迫0.5、3、12 h與對(duì)照（CK，正常培養(yǎng)）的第二片真葉、莖及根，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 小桐子JcSnRK1α基因的克隆 SnRK1α與酵母SNF1和哺乳動(dòng)物AMPK同源。從GenBank下 載 酵 母 SNF1（AAA35058.1）、 人 類 AMPK（AAB32732.1）、植物中同源基因擬南芥AKIN1.3（NP_198760.1）、AKIN10（AAA32736.1）、AKIN11（BAB01993.1）、水 稻 OSK1（BAA36298.1）、OSK24（BACA56589.1）、 黑 麥（AAA33921.1） 及 煙 草（BAA05649.1）的SnRK1α蛋白序列，以上述序列為種子序列，利用NCBI Blast程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastP相似性檢索（閾值E＜1e-40，序列相似性＞50%），得到候選的小桐子SnRK1α蛋白質(zhì)序列XP_012084751.1，同時(shí)，下載其對(duì)應(yīng)基因序列（NW_012124717.1）與 mRNA 序列（XM_01222936.1）。以mRNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物（JcSnRK1α_C），上游：5'-CTCTTTGAGCTCGATTGTGTCCATC-3'；下 游：5'-GAAGGACAGTTATTTACACCGTG-3'，菌 落 PCR 驗(yàn) 證 引 物（JcSnRK1α_T）， 上 游 ：5'-CCTGGTCATCATGAAGG-3'；下游：5'-CCGACGT CGACAAGGACTCGGAGTTGTGCAAGAAAAG-3'，并送深圳華大基因公司合成。

利用TriZol法提取小桐子對(duì)照與不同低溫處理下的葉片、莖及根的總RNA，并利用DNase I（TaKaRa公司）消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取1.5 μg總RNA，以Random primer為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司）合成第一鏈cDNA。以莖cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD FX Neo DNA Polymerase（TOYOBO公司）及JcSnRK1α_C引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，68℃后延伸5 min。電泳檢測正確的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL，加1 μL Taq DNA Polymerase（TaKaRa公司），72℃反應(yīng) 25 min進(jìn)行加A處理，利用Gel Extraction Kit（OMEGA公司）回收目的基因條帶。將回收基因片段與克隆載體pMD18-T連接，命名為pMD18-T-JcSnRK1α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂LB抗性平板（包含50 mg/L Amp），過夜生長，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。利用引物JcSnRK1α_T進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證的陽性克隆，送深圳華大基因公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.2 小桐子JcSnRK1α基因的序列分析 利用ExPaSy提供的在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)得到的小桐子JcSnRK1α蛋白序列進(jìn)行氨基酸數(shù)目、理論分子量、等電點(diǎn)等基本參數(shù)的分析。將獲得的小桐子JcSnRK1αcDNA與基因序列利用軟件Splign進(jìn)行比對(duì)以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)，并利用GSDS（Gene Structure Display Server，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用GenBank CDD（Conserved domains）在線分析工具對(duì)JcSnRK1α進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。根據(jù)JcSnRK1α的編碼區(qū)序列（Coding sequence，CDS）對(duì)小桐子基因組進(jìn)行Blastn相似性檢索，得到JcSnRK1α基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的調(diào)控序列，并通過PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)其順式作用元件進(jìn)行鑒定。將克隆到的小桐子JcSnRK1α基因的蛋白序列與其他物種SnRK1α同源序列利用ClustalX 2.0進(jìn)行序列相似性比對(duì)，然后用MEGA 6.0軟件通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 小桐子JcSnRK1α基因的表達(dá)分析 利用小桐子各組織及低溫處理材料的cDNA為模板，以18S rRNA為內(nèi)參基因進(jìn)行JcSnRK1α基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）表達(dá)分析。引物序列為：18S rRNA上游：5'-AGAAACGGCTACCACATC-3'、 下 游 ：5'-CCAAGGTCCAACTACGAG-3'，JcSnRK1α（JcSnRK1α_Q）上游 ：5'-GACAACCGATTCCGTGTT-3'、 下 游 ：5'-GAAGTCCAAGTGCCCATT-3'。20 μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品重復(fù)3次，儀器為LightCycler96（Roche公司）。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性10 s，53℃退火15 s，72℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)，之后增加溶解曲線程序：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，連續(xù)檢測信號(hào)。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。器官差異表達(dá)分析以葉片的表達(dá)量為基準(zhǔn)，低溫差異表達(dá)分析以對(duì)照（CK）的表達(dá)量為基準(zhǔn)。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物JcSnRK1α_E，上游：5'- CGGGATCCATGGATGGGTCAAATCACCGAAGC AG -3'（下劃線表示BamHI酶切位點(diǎn)）、下游：5'-CCGCTCGAGCTAAAGGACTCGGAGTTGTGC -3'（下劃線表示XhoI酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增小桐子JcSnRK1α基因的全長編碼框序列，擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切，切膠回收后利用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，獲得重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-JcSnRK1α，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB抗性平板（含50 mg/L的Amp），37℃過夜生長。經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切驗(yàn)證的陽性克隆，送深圳華大基因公司進(jìn)行測序。

將構(gòu)建的小桐子原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-JcSnRK1α轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株，同時(shí)轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1空載體作為對(duì)照，挑取陽性單克隆接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L的Amp），37℃ 200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。之后按體積比1：100接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L的Amp），37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前對(duì)照，4℃保存。加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，分別取誘導(dǎo)1、3、6、12 h的菌液于4℃保存?zhèn)溆?。將未誘導(dǎo)與誘導(dǎo)不同時(shí)間的菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清，在菌體沉淀中加入200 μL PBS緩沖液（pH值7.4）重懸浮，加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，冷卻至室溫，12 000 r/min離心5 min，取20 μL上清蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠），考馬斯亮藍(lán)染色檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 小桐子JcSnRK1α基因的克隆

以小桐子莖cDNA為模板，擴(kuò)增JcSnRK1α基因cDNA全長序列。測序結(jié)果（圖1）表明，克隆的小桐子JcSnRK1α基因全長1 700 bp。ORF finder分析表明其包含完整的開放閱讀框1 545 bp，編碼514個(gè)氨基酸殘基，結(jié)合基因序列分析顯示，在5'與3'端分別包含294 bp與407 bp的5'-UTR與3'-UTR非編碼區(qū)。

將cDNA序列與基因序列（NW_012124717.1）通過Splign進(jìn)行比對(duì)顯示（圖2-A），小桐子JcSnRK1α基因包含11個(gè)外顯子與10個(gè)內(nèi)含子，且3'端最后一個(gè)外顯子與3'-UTR區(qū)域重合。ProtParam計(jì)算結(jié)果表明，小桐子JcSnRK1α蛋白分子量為58.8 kD，理論等電點(diǎn)為8.57，包含較多的非極性氨基酸，其中Leu、Ile、Val的比例占24.5%。

2.2 小桐子JcSnRK1α基因的結(jié)構(gòu)特征分析

進(jìn)一步通過GenBank CDD程序?qū)π⊥┳覬cSnRK1α氨基酸序列進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，確定其屬于小桐子SnRK1蛋白的α亞基，從N端到C端依次鑒定到激酶結(jié)構(gòu)域（Kinase domain）、自抑制調(diào)控結(jié)構(gòu)域（Ubiquitin-associated domain，UBA）及激酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域 1（Kinase associated domain1，KA1）/β-亞基結(jié)合結(jié)構(gòu)域（β-subunit interaction action，β-SID）（圖 2-B）。

將其激酶結(jié)構(gòu)域與其他物種進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除酵母（Saccharomyces cerevisiae）以外，都包含約250 aa氨基酸殘基，序列相似性達(dá)到60%以上，其中，在激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)部，還鑒定到ATP結(jié)合基序（分布于30-160 aa之間）與保守的磷酸化T-loop區(qū)域（分布于160-190 aa之間）（圖3）?？寺〉男⊥┳覵nRK1α激酶結(jié)構(gòu)域位于16-271位（長度256 bp），T-loop區(qū)域位于160-186位（核心Thr175殘基），同時(shí)，ATP結(jié)合基序中的保守Lys殘基對(duì)于SnRK1α結(jié)合ATP也是必需的，本研究鑒定的小桐子SnRK1α中保守的Lys殘基位于48位。另外，UBA結(jié)構(gòu)域與KA1結(jié)構(gòu)域分別位于293-333位與390-511位，與擬南芥KIN10的各結(jié)構(gòu)域位置基本一致。

SnRK1α與酵母SNF1、哺乳動(dòng)物AMPK同屬于SNF1家族激酶，進(jìn)一步將小桐子SnRK1的T-loop區(qū)域與其他物種進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖4）顯示，同屬雙子葉植物的擬南芥、煙草及小桐子其T-loop區(qū)域序列完全相同，而單子葉植物的水稻與黑麥存在2個(gè)氨基酸殘基的差異，SNF1家族的人類AMPK與酵母SNF1單獨(dú)聚類為一個(gè)分支，酵母SNF1在進(jìn)化上更為古老，且與其他物種的序列差異性最大，但所有物種T-loop區(qū)域中的保守Thr殘基及其兩側(cè)氨基酸完全一致，是SnRK1α家族蛋白受上游信號(hào)調(diào)控所必需的。

圖1 小桐子JcSnRK1α基因的cDNA與推導(dǎo)的氨基酸序列

圖2 小桐子JcSnRK1α的基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域及順式作用元件分析

SnRK1α是與低能量逆境相關(guān)的基因，對(duì)小桐子JcSnRK1α基因上游1 500 bp的調(diào)控序列通過PlantCARE在線程序進(jìn)行順式作用元件的分析，發(fā)現(xiàn)了基因啟動(dòng)子、增強(qiáng)子區(qū)域常見的作用元件，如輔助RNA聚合酶II結(jié)合的位點(diǎn)TATA-box，以及控制轉(zhuǎn)錄起始頻率并增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的位點(diǎn)CAAT-box。另外，還鑒定到不同的防御與非生物脅迫逆境響應(yīng)元件如創(chuàng)傷（WUN-motif，AAATTTCCT）、高溫（HSE，AAAAAATTC）、低溫（LTR，CCGAAA）及干旱MYB元件（MBS，TAACTG）等，以及赤霉素應(yīng)答元件（GARE-motif，AAACAGA）、類黃酮合成基因（Flavonoid biosynthetic gene）響應(yīng)元件（MBSI，AAAAAACG/CGTTA）（圖 2-C），說明小桐子JcSnRK1α基因的表達(dá)受多重信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。

圖3 小桐子JcSnRK1α及同源蛋白激酶結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)

圖4 小桐子JcSnRK1α及同源蛋白T-loop區(qū)域序列比對(duì)，箭頭表示保守的Thr殘基

2.3 小桐子JcSnRK1α基因的差異表達(dá)分析

在小桐子JcSnRK1α基因的啟動(dòng)子序列中鑒定到了低溫、高溫、干旱及創(chuàng)傷等非生物脅迫逆境響應(yīng)元件（圖2-C），通過qRT-PCR技術(shù)對(duì)JcSnRK1α基因在小桐子不同器官與低溫脅迫處理下的表達(dá)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果（圖5-A）表明，JcSnRK1α基因在小桐子各器官中都有表達(dá)，但存在表達(dá)特異性，其中，在莖中表達(dá)量較高（較葉片中高31.05倍），其次為根，而在葉片中表達(dá)量較低。

低溫脅迫條件下，小桐子JcSnRK1α基因在莖與根中表現(xiàn)出相似的表達(dá)變化趨勢，與對(duì)照相比，在莖中，在低溫脅迫3 h達(dá)到最大表達(dá)量，較對(duì)照提高2.04倍（P＜0.01），之后表達(dá)量迅速下降，且低于對(duì)照的表達(dá)水平（圖5-B）；而在根中，在低溫脅迫0.5 h出現(xiàn)表達(dá)峰值，較對(duì)照提高3.16倍（P＜0.01），之后表達(dá)量逐漸下調(diào)，且在低溫脅迫12 h時(shí)回到對(duì)照表達(dá)水平（圖5-C），說明JcSnRK1α基因在根中更快速響應(yīng)低溫脅迫。

2.4 小桐子JcSnRK1α原核表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)

將大腸桿菌Rosetta菌株、轉(zhuǎn)pGEX-4T-1空載體與pGEX-4T-1-JcSnRK1α重組載體的菌液裂解后進(jìn)行SDS-PAGE表達(dá)蛋白的電泳分析。結(jié)果（圖6）表明，大腸桿菌Rosetta菌株（CK-1）、轉(zhuǎn)pGEX-4T-1空載體（CK-2）及轉(zhuǎn)pGEX-4T-1-JcSnRK1α重組載體未誘導(dǎo)（0 h）的菌株都未出現(xiàn)相應(yīng)分子量的條帶。而經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)1、3、6、12 h的菌株都出現(xiàn)1條約84.8 kD的蛋白條帶（pGEX-4T-1載體的表達(dá)標(biāo)簽為26.0 kD，小桐子JcSnRK1α蛋白預(yù)測分子量為58.8 kD），與理論融合蛋白的分子量一致，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，蛋白表達(dá)量逐漸增加，表明JcSnRK1α基因已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖5 小桐子JcSnRK1α基因的器官與低溫脅迫差異表達(dá)分析

圖6 小桐子JcSnRK1α基因表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳

3 討論

SnRK1的活性主要受到細(xì)胞能量水平的調(diào)節(jié)，但其是否像AMPK一樣受到AMP的激活，還不太清楚［11]。而6-磷酸海藻糖（Trehalose-6-phosphate，T6P）是SnRK1的抑制劑，海藻糖的代謝與SnRK1感應(yīng)低糖信號(hào)之間有重要的聯(lián)系［23]，并且T6P還需要其他介導(dǎo)因子參與完成SnRK1的抑制過程［24]，另外，其他報(bào)道顯示，SnRK1的活性還受到Ca2+［25]、6-磷酸葡萄糖（Glucose-6-phosphate）［26]，以及 GRIK1/2（Geminivirus Rap Interacting kinase 1/2）的調(diào)節(jié)［27]，其中 GRIKs被認(rèn)為是磷酸化 SnRK1α T-loop中保守Thr殘基的核心蛋白激酶［19]。而在小桐子的SnRK1α基因啟動(dòng)子中還鑒定到類黃酮合成基因響應(yīng)相關(guān)順式作用元件（圖2C），表明其還受到類黃酮類化合物的調(diào)節(jié)。

植物中SnRK1是糖代謝網(wǎng)絡(luò)、依賴或不依賴miRNA的能量代謝［28-29]、糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，能夠調(diào)節(jié)編碼糖代謝關(guān)鍵基因的時(shí)空表達(dá)特性，同時(shí)也可通過磷酸化特定SAMS序 列（-HMRSAMSGLHLVKR-） 的Ser殘基調(diào)節(jié)一系列酶的活性［30]。本研究對(duì)小桐子全蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性檢索，也鑒定到包含SAMS序列的糖代謝相關(guān)酶，如D-3-磷酸甘油 酸 脫 氫 酶（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，XP_012068288.1）、焦磷酸：果糖 -6-磷酸 1-磷酸 轉(zhuǎn) 移 酶（Pyrophosphate：fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase，XP_012073552.1）、 木 糖 葡聚糖葡基轉(zhuǎn)移酶（Xyloglucan glycosyltransferase，XP_012085176.1），也證明SnRK1與小桐子的糖代謝信號(hào)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。

另外，SnRK1對(duì)植物發(fā)育與抗逆相關(guān)基因表達(dá)也有影響。反義表達(dá)SnRK1α的豌豆植株表現(xiàn)出了多種成熟缺陷，如淀粉含量降低、花粉粒變小以及敗育等［30-31]，Halford 等推測是由于轉(zhuǎn)化酶（Inverase）不能被激活，導(dǎo)致不能利用攝入的蔗糖，最終花粉粒因不能響應(yīng)“高蔗糖/低葡萄糖”能量狀態(tài)信號(hào)，從而在含有蔗糖的培養(yǎng)基上饑餓而敗育［5，7，32-33]，同時(shí)，在馬鈴薯中反義表達(dá)GAI83（SnRK1復(fù)合體的β亞基）的同源基因StubGAI83，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽敏感，并且影響主根的生長［15]，相反，在煙草中過表達(dá)SnRK1α基因可明顯提高煙草對(duì)病毒的抗性［16]。本研究在小桐子SnRK1α基因的啟動(dòng)子中也鑒定到大量的逆境響應(yīng)元件如低溫響應(yīng)元件，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了該基因參與小桐子的低溫脅迫響應(yīng)過程，與小桐子抗冷性的形成直接相關(guān)，但該基因在根中響應(yīng)低溫脅迫（0.5 h）顯著快于莖（3 h）中，且上調(diào)表達(dá)量也高于莖中，暗示SnRK1α基因在根中響應(yīng)低溫脅迫更加敏感，同時(shí)，在莖中，隨著低溫脅迫的持續(xù)，SnRK1α基因的表達(dá)量迅速下調(diào)，且顯著低于對(duì)照表達(dá)水平，推測該基因在莖中受到更多上游信號(hào)分子的表達(dá)調(diào)節(jié)作用。以上結(jié)果表明SnRK1處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心位置，受到上游信號(hào)分子如激酶的調(diào)節(jié)，同時(shí)通過磷酸化/去磷酸化共價(jià)修飾調(diào)節(jié)參與感知細(xì)胞能量狀態(tài)轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)放大過程、碳氮代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)與活性調(diào)節(jié)過程以及抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等，為小桐子SnRK1α基因在其他生物與非生物逆境脅迫下的差異表達(dá)分析與異源轉(zhuǎn)化功能驗(yàn)證等后續(xù)研究工作奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆到小桐子JcSnRK1α基因1 700 bp cDNA，包含完整開放閱讀框1 545 bp，編碼514個(gè)氨基酸。從N端到C端具備激酶結(jié)構(gòu)域、自抑制調(diào)控結(jié)構(gòu)域及激酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域。該基因啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到低溫等非生物脅迫應(yīng)答元件，參與小桐子抗冷性過程。表達(dá)分析顯示，JcSnRK1α在小桐子莖與根中表達(dá)量較高，且都屬于低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)基因。另外，構(gòu)建該基因的原核表達(dá)載體并成功誘導(dǎo)表達(dá)，得到84.8 kDa的融合蛋白條帶。