趙陽陽 郭雨瀟 張凌云

（北京林業(yè)大學 森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083）

文冠果（Xanthoceras sorbifoliaBunge）又名文冠花、文光花、僧燈毛道，隸屬無患子科（Sapindaceae）文冠果屬（XanthocerasBunge），單屬單種。一般為亞喬木或大灌木，遍布華北、華東及西北地區(qū)［1-2]。文冠果具有較強的適應性和抗逆能力，種子營養(yǎng)豐富、種仁含油率高，是一種珍貴的木本油料植物，有北方油茶之稱，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?]。目前對于文冠果的研究多集中在生長發(fā)育［4-6]、栽培管理［7-8]、油脂組成及提取［3，5，9-11]、生物柴油制備［12-13]和常規(guī)育種［14]等方面，也有一些基因克隆和功能分析［15-19]，關于果實生長發(fā)育過程中的分子機理研究很少。

轉錄組測序研究能夠從整體水平研究基因功能與基因結構并揭示特定生物學過程的分子機理，廣泛應用于分析生物和醫(yī)學研究等領域［20]。近年來，隨著高通量測序技術發(fā)展，測序時間和成本顯著降低，很多模式和非模式植物完成了轉錄組測序，文冠果的轉錄組測序也取得了很大進展。Liu 等［21]對文冠果芽、花、葉和種子的混合樣進行高通量轉錄組測序，構建了文冠果參考轉錄組。敖妍等［22]應用Illumina Hi-seqTM2000高通量測序技術對文冠果花芽進行了轉錄組分析來解析文冠果花芽形態(tài)分化的分子調(diào)控模式與機制。劉玉林等［23]在對7個省份16份文冠果葉片進行轉錄組測序的基礎上分析和篩選了轉錄組序列中的SSR標記，并設計開發(fā)ESTSSR標記，為文冠果的遺傳多樣性分析提供標記資源。申展等［24]運用SSR標記的方法，研究了全國14個地區(qū)具有代表性的138份文冠果種質資源的遺傳多樣性，并逐步構建出25份文冠果核心種質。文冠果果實為主要收獲部位，果實發(fā)育和營養(yǎng)物質積累決定了產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，是文冠果研究的重點，而文冠果果實發(fā)育過程分子機理尚不清楚。

本研究利用Illumina Hi-seqTM2000高通量測序平臺對兩個發(fā)育時期的文冠果果實進行轉錄組測序，可以全面了解文冠果果實基因表達情況，獲得大量基因序列，同時可以開發(fā)SSR分子標記，為后期文冠果品種鑒定和分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

文冠果果實采集于北京市圓明園內(nèi)長勢良好，無病蟲害的20年生實生樹。通過物候觀察，樣品采集時間分別為2017年盛花后20 d（1號樣）和60 d（2號樣），分別在樹體東南西北不同方位各采集3個果實，混勻，然后立即放入液氮中帶回實驗室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與文庫構建 兩個時期樣品均混合12個果實提取RNA來建庫測序，以消除個體誤差?？俁NA提取采用植物總RNA提取試劑盒（Omega，美國），NanoDropTM2000 分光光度計（Thermo Fisher，美國）和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度、濃度和完整性。檢驗合格的文冠果果實總RNA，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，加入Fragmentation Buffer 使其成為短片段，用六堿基隨機引物（random hexamers）合成cDNA第1鏈，然后加入緩沖液、dNTAs、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二鏈；再經(jīng)過QiuQuick PCR試劑盒（QIAGEN，德國）純化并加 EB 緩沖液洗脫之后做末端修復、加poly（A）并加測序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，最后進行PCR擴增構建測序文庫。

1.2.2 轉錄組測序與組裝 利用Illumina HiseqTM2000對文冠果果實測序文庫進行高通量測序。測序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng) base calling 轉化為序列數(shù)據(jù)raw reads，經(jīng)過平臺過濾除雜和冗余去除后得到高質量的clean reads，然后使用短reads 組裝軟件Trinity做轉錄組de novo組裝獲得Unigene。

1.2.3 Unigene功能注釋 使用BLAST 軟件將Unigene序列與NR（非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫）、Swiss-Prot（蛋白質序列數(shù)據(jù)庫）、GO（基因本體論數(shù)據(jù)庫）、COG/KOG（蛋白質原核/真核同源數(shù)據(jù)庫）、eggNOG（直系同源蛋白數(shù)據(jù)庫）、KEGG（京都基因與基因組百科全書）數(shù)據(jù)庫對比，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結果，預測完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER軟件與Pfam（蛋白質家族域數(shù)據(jù)庫）數(shù)據(jù)庫對比，獲得Unigene的注釋信息。

1.2.4 SSRs（Simple Sequence Repeats） 檢 索 與 分析 利用MISA軟件檢測文冠果果實轉錄組Unigene，搜索其中的SSRs并進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 測序結果及從頭組裝

堿基質量值（Quality score）是堿基識別（Base calling）出錯的概率的整體映射。堿基質量值越高表面堿基識別越可靠。文冠果果實發(fā)育早期樣本測得的Q30堿為89.51%，測得序列的GC含量占44.62%；發(fā)育后期樣本測得的Q30堿基百分比為89.60%，測得序列的GC含量占44.61%。經(jīng)過測序質量控制，共得到42 545 764個序列讀取片段（Reads）：其中包含了12.74 Gb核苷酸序列信息，各樣品Q30堿基百分比均不小于89.51%，說明轉錄組測序質量較高，可以進行下一步的數(shù)據(jù)組裝。

測序數(shù)據(jù)組裝共獲得157 244個轉錄本，序列信息達261 799 238 bp，N50為2 693 bp，平均長度為1 664.92 bp。所得轉錄本序列進一步組裝得到68 298個單基因簇（Unigene），序列信息總長度為59 281 489 bp，N50為 1 589 bp， 平 均 長 度 為867.98 bp。其中長度在300-500 bp的Unigene占比最高，為21.15%，長度在1 kb以上的Unigene占比24.49%（表1）。組裝完整性較高，可用于后續(xù)的注釋分析。

表1 文冠果果實轉錄組數(shù)據(jù)組裝結果

2.2 功能基因注釋

利用BLAST軟件將獲得的Unigene數(shù)據(jù)信息分別在 Nr、Swiss-Prot、Pfam、GO、KOG和 KEGG數(shù)據(jù)庫比對，對所有注釋上的Unigene數(shù)目進行分析統(tǒng)計。結果（表2）表明文冠果果實兩個樣本共包含68 298個Unigene，其中24 691個Unigene得到注釋，43 607個Unigene未得到注釋，獲得注釋的Unigene占總Unigene的36.15%。在注釋的Unigene中，Nr數(shù)據(jù)庫注釋的Unigene最多，達到24 059個；COG數(shù)據(jù)庫注釋的Unigene最少，僅有7 483個。注釋到長度300≤ 長度＜ 1 000 Unigene數(shù)為7 724個，其中注釋到Nr數(shù)據(jù)庫300≤長度＜ 1 000的最多，達到7 425個；注釋到COG數(shù)據(jù)庫300≤長度＜ 1 000 Unigene數(shù)最少，有1 544個。注釋到長度≥ 1 000個堿基的Unigene數(shù)為13 924個，其中注釋到Nr數(shù)據(jù)庫長度≥ 1 000 Unigene數(shù)最多，達到13 892個。

表2 文冠果果實基因的BLAST比對結果

根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫注釋顯示，Unigene注釋同源基因的物種分布圖如圖1所示，甜橙Citrus sinensis的同源序列最多，達7 131條，占注釋序列總數(shù)的29.65%，其次是克萊門柚Citrus clementina，匹配同源序列4 950條，占總注釋序列的20.58%，兩個物種所匹配的同源序列占總注釋序列的一半。其次匹配較高的分別是可可Theobroma cacao（1 916條，7.97%）、 葡 萄Vitis vinifera（1 539條，6.40%）、稻Oryza sativa（700條，2.91%）、毛果楊Populus trichocarpa（686，2.85%）、麻風樹Jatropha curcas（662，2.75%）、蓖麻Ricinus communis（595，2.47%）、胡楊Populus euphratica（457，1.90%）、桃Prunus persica（377，1.57%）和其他物種（5 039，20.95%）。

圖1 文冠果果實轉錄組Unigene與Nr數(shù)據(jù)庫匹配物種分布

為了進一步揭示文冠果果實轉錄組Unigene的功能分類，根據(jù)Nr數(shù)據(jù)庫注釋得到的信息，通過GO數(shù)據(jù)庫，對文冠果果實轉錄組Unigene進行基因生物學特征功能分類。結果（圖2）顯示，GO數(shù)據(jù)庫注釋的14 766個文冠果果實轉錄組Unigene可分為細胞組分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）和生物過程（Biological process）等3個GO類別的54個小組。細胞組分涉及28 681個GO條目，分為17個功能組，其中細胞（6 588個）、細胞部分（6 588個）和細胞器（5 044個）涉及的Unigene較多；分子功能涉及18 283個GO條目，分為17個功能組，其中催化活性（7 790個）和結合活性（7 637個）含Unigene較多；41 373個GO條目歸屬于生物過程，分為20個功能組，其中代謝過程（10 120個）、細胞進程（8 512個）和單一生物體過程（7 194個）涉及的Unigene較多。

圖2 文冠果果實轉錄組Unigene的GO功能分類圖

為了進一步分析文冠果果實轉錄組Unigene的功能，進行了KOG功能分類分析，結果如圖3所示，共獲得25個不同的功能分類，比較全面，包含了大多數(shù)的生命活動。其中，一般功能預測（General function prediction only）的基因數(shù)量最多3 998條（25.32%），是最大的功能類群，其次是翻譯后修飾、蛋白質翻轉和分子伴侶（Posttranslational modification，protein turnover，chaperones）1 387條（8.62%），信號轉導類機制（Signal transduction mechanisms） 次 之， 由 1 254條（8.17%）， 碳 水化合物轉運與代謝（Carbohydrate transport and metabolism）也有870條（5.41%），另外劃分到脂類轉運與代謝（Lipid transport and metabolism）這一功能類別的有560條（3.61%），其他功能分類的基因數(shù)量不盡相同。

以KEGG數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，將8 284個文冠果果實轉錄組Unigene分為127個代謝通路（表3）。核糖體（445個）、碳代謝（320個）、氨基酸的生物合成（288個）、內(nèi)質網(wǎng)上蛋白質處理（240個）和植物激素信號轉導（221個）等代謝通路涉及的Unigene較多。此外，淀粉和糖代謝通路涉及200個Unigene，脂肪酸代謝通路有81個，脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成和脂肪酸延長分別涉及40、40和30個Unigene。

圖3 文冠果果實轉錄組Unigene的KOG注釋分析

2.3 轉錄組SSRs特征分布

利用MISA軟件對篩選得到的1 kb以上的Unigene做SSR分析，結果如表4所示：共發(fā)現(xiàn)SSR位點11 732個。其中，單核苷酸SSR最豐富，有7 139個，遠遠超過其他種類SSR，占全部SSR的60.85%，平均長度最短，為12.46 bp；二核苷酸SSR（2 655個）和三核苷酸SSR（1 854個）分別占總SSR的22.63%和15.8%，平均長度分別為15.47 bp和16.53 bp；四核苷酸SSR（63）、五核苷酸SSR（11）和六核苷酸SSR（10）很少，三者之和不到總SSR的1%，其平均長度較長，六核苷酸SSR的平均長度達到43.2 bp。

3 討論

文冠果適應性廣，抗逆性強，含油率高，是我國重點發(fā)展的木本油料樹種，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?5-27]。目前關于文冠果的研究主要集中在生長發(fā)育［4-6]、栽培管理［7-8]、油脂組成及提?。?，5，9-11]、生物柴油制備［12-13]和常規(guī)育種［14]等方面，分子生物學方面的研究較少，果實發(fā)育過程中的基因表達情況尚不清楚。第二代高通量測序技術因測序時間短、成本低和數(shù)據(jù)量大的優(yōu)點近年來被廣泛應用于組學研究中。本研究利用高通量測序技術得到了文冠果果實的轉錄組數(shù)據(jù)，共獲得12.74Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達到6.31Gb，Q30堿基百分比在89.51%及以上，測序質量較高。組裝后獲得了68 298個Unigene序列，其中長度在1 kb以上的Unigene有16 724條，組裝完整性良好。

Nr數(shù)據(jù)庫注釋結果顯示，由于缺少文冠果基因組和轉錄組，大量Unigene未獲得注釋，其中僅有24 691個Unigene得到注釋，占36.15%。這與松蘿鳳梨［28]、白鮮根［29]等已報道物種轉錄組測序注釋結果相似，說明文冠果果實轉錄組有大量序列需要深入挖掘。與甜橙Citrus sinensis的同源序列最多，達7 131條，占注釋序列總數(shù)的29.65%，其次是克萊門柚Citrus clementina，匹配同源序列4950條，占總注釋序列的20.58%，兩個物種所匹配的同源序列占總注釋序列的一半。

表3 文冠果果實轉錄組Unigene的KEGG注釋

通過GO數(shù)據(jù)庫對文冠果果實轉錄組Unigene進行基因生物學特征功能分類，代謝過程（10 120個）、細胞進程（8 512個）、催化活性（7 790個）和結合活性（7 637個）等含Unigene較多，總體來說，文冠果果實在細胞活動、代謝活動的基因表達豐度較高，表明文冠果果實自身具有較強的代謝能力。

續(xù)表

表4 文冠果果實轉錄組SSR分布特征

通過KOG數(shù)據(jù)庫注釋共獲得25個不同的功能分類，比較全面，包含了大多數(shù)的生命活動，文冠果果實轉錄組中Unigene主要涉及基因表達、蛋白質合成和物質代謝等功能分類，符合文冠果果實作為強“庫”器官積累營養(yǎng)物質這一基本功能。

以KEGG數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，將8 284個文冠果果實轉錄組Unigene分為127個代謝通路，與Liu等［21]和敖妍等［22]研究結果不同，推測可能是由于取材不同造成的。本研究樣品為文冠果果實，而Liu等測序樣品為文冠果芽、花、葉和種子的混合樣，敖妍等以文冠果花芽為材料。本研究分離了大量涉及淀粉和糖代謝、脂肪酸代謝、脂肪酸生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成和脂肪酸延長等通路相關基因，為后期研究文冠果果實生長發(fā)育和營養(yǎng)物質積累奠定基礎。

目前限制文冠果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大因素就是種質資源混亂，缺少優(yōu)良品種，僅利用外部形態(tài)學特征很難做到精細區(qū)分。轉錄組數(shù)據(jù)除了用于基因挖掘及表達調(diào)控研究外，可以開發(fā)大量EST-SSR分子標記。SSR標記是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，廣泛用于遺傳圖譜的構建、目標基因的標定、指紋圖譜的繪制等研究中［20]。利用MISA軟件對篩選得到的1kb以上的Unigene做SSR分析，共發(fā)現(xiàn)SSR位點11 732個，遠遠高于劉玉林等［23]和申展等［24]研究結果中的SSR位點，分析是取材不同造成的結果差異。后期會將實驗結果與之進行比對，篩選驗證開發(fā)出更可靠的SSR位點，用于文冠果種質資源分類和優(yōu)良品種培育。

4 結論

本研究利用Illumina Hi-seqTM2000高通量測序平臺對兩個發(fā)育時期的文冠果果實進行轉錄組測序，共獲得68 298個Unigene序列，共有24 691個Unigene得到注釋，占36.15%；GO數(shù)據(jù)庫注釋顯示14 766條Unigene分為細胞組分、分子功能及生物學過程3大類54個功能組；KOG數(shù)據(jù)庫中注釋到的13 994條Unigene功能系統(tǒng)分為25類；以KEGG代謝途徑數(shù)據(jù)庫為依據(jù)，可將8 284個文冠果果實轉錄組Unigene分為127個代謝通路，可以全面了解文冠果果實的代謝途徑信息；在文冠果果實轉錄組中發(fā)現(xiàn)11 732個SSR位點，最多的為單核苷酸SSR，占60.85%。