武肖琦 馮濤 劉艷軍 焦思鵬 孫攀 楊靜慧

（天津農(nóng)學(xué)院園藝學(xué)院，天津 300384）

桃（Prunus persica） 是世界上栽培廣泛的落葉果樹之一，世界桃產(chǎn)量一直呈上升趨勢，其中中國占一半以上。迄今為止，桃樹在中國已有3 000多年的栽培歷史，全國各地的栽培品種1 000多個(gè)［1]，具有重要的商業(yè)價(jià)值。桃作為重要的經(jīng)濟(jì)果樹之一，其果實(shí)品質(zhì)的好壞與成熟期的早晚直接影響果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益。

NAC基因家族是植物基因組中含量極其豐富且植物特有的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一。最早是在矮牽牛NAM、擬南芥AATF1/2和CUC2蛋白的N端被

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為‘津柳早紅’，成熟期在6月上旬，屬于極早熟桃品種。于2018年4月至6月，采取‘津柳早紅’的花蕾、葉片、莖、根及果實(shí)；于2018年發(fā)現(xiàn)的一段高度保守的氨基酸序列，Aida等［2]將其命名為NAC結(jié)構(gòu)域，并將包含NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白稱為NAC轉(zhuǎn)錄因子。迄今為止，已經(jīng)預(yù)測或鑒定出許多來自不同植物的NAC基因，主要有玉米（Zea mays）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、高粱（Sorghumbicolor）、番木瓜（Caricapapaya）［3]以及大豆（Soybean）［4]等。同時(shí)還有研究表明NAC家族具有非常重要的生物學(xué)功能，如廣泛參與花的成熟［5]、木纖維的形成［6]、側(cè)根的發(fā)育［7-8]、植物的抽枝［9]、植物的衰老［10-11]以及影響激素信號(hào)的傳導(dǎo)［12-14]等，在各種發(fā)育過程和逆境應(yīng)答中起非常重要的調(diào)節(jié)作用。

桃果實(shí)成熟受多因素影響，包括環(huán)境、生長素及基因型等。Bailey等［15]推測桃果實(shí)成熟期共受3個(gè)位點(diǎn)的6個(gè)累加基因的控制，其中每個(gè)貢獻(xiàn)基因控制大概15 d的成熟期，例如基因型Sm1Sm1Sm2Sm2Sm3Sm3比Sm1Sm1Sm2Sm2Sm3sm3早成熟15 d，基因型sm1sm1sm2sm2sm3sm3比sm1sm1sm2sm2Sm3sm3晚成熟15 d，但景士西等［16]認(rèn)為此說法尚缺乏試驗(yàn)證據(jù)進(jìn)行支持。Eduardo等［17]研究發(fā)現(xiàn)，編碼NAC家族的轉(zhuǎn)錄因子候選基因ppa008301m（PpNAC72）是植物中NAC基因家族中的一員，MD基因座的精細(xì)定位［18]鑒定出ppa008301m（PpNAC72）作為可能的至熟基因在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。

近年來，對桃NAC基因家族的研究取得了一定進(jìn)展，但對于桃成熟相關(guān)分子的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究基于前期對影響桃成熟期基因的篩選與研究，以‘津柳早紅’為材料，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得PpNAC72，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測該基因在不同器官和不同時(shí)期的表達(dá)變化，為更好地研究桃果實(shí)成熟的機(jī)制提供理論與實(shí)驗(yàn)支持。4月下旬至6月中旬，每隔8 d取‘津柳早紅’各時(shí)期的果實(shí)。試驗(yàn)材料均采自天津市大柳灘桃園基地，材料經(jīng)液氮中速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)桃參考基因組（https：//www.rosaceae.org/）中的ppa008301m序列，使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，NAC-F1：5'-GGAATTCCATAT GGCTCTCTTTCTTTCTCTC-3'，NAC-R1：5'-TAACCC GGGACTACTCGATTTCTCCAC-3'（下劃線處分別為NdeⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 桃總RNA提取及cDNA的合成 根據(jù)植物總RNA快速提取試劑盒EASYspin Plus（Aidlab，北京）說明書提取葉片、花蕾、果實(shí)、根、莖的RNA，并使用Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa，中國大連）合成cDNA。

1.2.3PpNAC72的克隆 以‘津柳早紅’cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA模板1.0 μL、5×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL rTaq 酶 0.2 μL、10 μmol/L 正、反向引物各 1.0 μL 和dd H2O 17.3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 3 min ；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 8 min，4℃保存，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收，并與pEASY-Blunt載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4PpNAC72的qRT-PCR分析 提取‘津柳早紅’根、莖、花、葉以及不同時(shí)期果實(shí)的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)序列非保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，qPCR-F1：5'-GTCGTCTTCC TGCTCGTCTCA-3'和 qPCR-R1：5'-TCACATTCATT TGCCCTTGG-3'，產(chǎn)物長度為245 bp。內(nèi)參基因RPⅡ（RNA polymeraseⅡ）上游引物F2：5'-TGAAGCAT ACACCTATGATGATGAAG-3'，下游引物R2：5'-CT TTGACAGCACC-AGTAGATTCC-3'［19]。根據(jù) iTaq Universal SYBR Green Supermix操作說明，以RPⅡ?yàn)閮?nèi)參基因，利用BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀（伯樂，美國）進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：iTaq Universal SYBR Green Supermix 10μL、上游引物（qPCR-F1/RP II-F2）1 μL、下游引物（qPCR-R1/RP II-R2）1 μL、cDNA 模板 1 μL、ddH2O補(bǔ)至20 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算不同器官和不同時(shí)期PpNAC72的表達(dá)量。

1.2.5PpNAC72的生物信息學(xué)分析 利用NCBIBLAST對獲得的目的片段進(jìn)行同源性比對，利用Bioedit進(jìn)行氨基酸序列分析，并利用MEGA 6.0構(gòu)建PpNAC72系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。進(jìn)一步利用在線工具 expasy（http：//web.expasy.org/compute_pi/） 推測該蛋白的等電點(diǎn)，并利用expasy上的ProtParam工具對PpNAC72所編碼的氨基酸序列進(jìn)行親水性分析。利用在線工具SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽分析，利用在線工具 TMHMM v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，利用在線 工 具 PredictProtein（https：//www.predictprotein.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，利用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié) 構(gòu)。 通 過PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

2 結(jié)果

2.1 PpNAC72的克隆

從‘津柳早紅’果實(shí)中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后使用特異性引物PCR擴(kuò)增得到約1 100 bp的片段（圖1）。結(jié)果表明，該基因全長編碼序列為1 050 bp，編碼349個(gè)氨基酸，BLAST結(jié)果（圖2）顯示，該基因含有個(gè)1個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，從N端第15-139氨基酸。此基因命名為PpNAC72。經(jīng)序列對比，發(fā)現(xiàn)目的基因比桃參考基因組中的該基因多出一段長度為36 bp的片段（圖3）。

圖2 PpNAC72蛋白中NAM結(jié)構(gòu)域分析

圖3 PpNAC72的同源性分析

圖1 桃RNA檢測（A）和PpNAC72的擴(kuò)增（B）

2.2 PpNAC72的蛋白理化特性

PpNAC72所編碼的蛋白質(zhì)分子量為39.2 kD，等電點(diǎn)為8.34，不穩(wěn)定系數(shù)為39.14，為穩(wěn)定蛋白。親水性分析表明，親水性氨基酸為153個(gè)，占43.9%；疏水性氨基酸為142個(gè)，占40.6%，平均疏水系數(shù)為-0.623，為親水性蛋白，其中，親水性最高的氨基酸是第78位的精氨酸（Arg，R），其親水指數(shù)位-2.800。氨基酸組成中帶有負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）共有37個(gè)，占10.6%；帶有正電荷的氨基酸（Arg+Lys）共有40個(gè)，占11.5%。該蛋白沒有跨膜區(qū)域，非膜蛋白。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，桃樹PpNAC72蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占3.44%，β-折疊結(jié)構(gòu)占14.04%，環(huán)肽鏈占82.52%。PpNAC72蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 PpNAC72蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.3 啟動(dòng)子元件分析

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)重要組成部分。選取PpNAC72起始密碼子上游2 000 bp進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中常見的順式作用元件——CAAT-box、參與脫落酸反應(yīng)作用的順式作用元件（如ABRE）、參與光響應(yīng)的元件（如G-Box、Box 4和ATCT-motif）、與生長素相關(guān)的響應(yīng)元件（如TGA-element）。結(jié)果表明，PpNAC72可能參與多重激素調(diào)控果實(shí)成熟的響應(yīng)。

2.4 PpNAC72的組織特異性分析

‘津柳早紅’不同器官的熒光定量PCR檢測結(jié)果（圖5）表明，PpNAC72在所有被檢測的器官（包括營養(yǎng)器官以及生殖器官）中都有不同程度的表達(dá)。在果實(shí)中表達(dá)量最高，在根部、花朵中相對較少，在根部表達(dá)量最低。

該基因在不同時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)量隨著果實(shí)的成熟不斷增加，在果實(shí)生長階段中后期表達(dá)量達(dá)到最高，其表達(dá)量是前一個(gè)時(shí)期的3倍，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他時(shí)期；隨后表達(dá)量降低，但在果實(shí)接近成熟時(shí)基因表達(dá)量增加（圖6）。

圖5 PpNAC72的組織特異性分析

圖6 PpNAC72在不同時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)量分析

2.5 PpNAC72的同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將桃的轉(zhuǎn)錄因子PpNAC72與甜櫻桃（Prunus avium，XP_021809122.1）、 梅（Prunus mume，XP_008226676.1）、野草莓（Fragaria vesca subsp. Vesca，XP_004291667.1）、 月 季（Rosa chinensis，AKC884 81.1）、 白 梨（Pyrus x bretschneideri，XP_00937849 2.1）、 蘋 果（Malus domestica，ADL36797.1、 川 桑（Morusnotabilis，XP_010089503.1）、湖北海棠（Malus hupehensis，AGS08773.1）、山黃麻（Tremaorientalis，PON45671.1）、 可 可（Theobroma cacao，EOY 12853.1）、 胡 桃（Juglans regia，XP_018851445.1）、甜橙（Citrus sinensis，XP_006464708.1）等物種的NAC家族氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)桃樹的PpNAC72與甜櫻桃同源性最高，達(dá)96%，與樹棉（Gossypium arboreum，XP_017605223.1）最低（圖7）。利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖8）表明，桃的轉(zhuǎn)錄因子PpNAC72與甜櫻桃和梅的NAC轉(zhuǎn)錄因子位于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，與其他植物的NAC轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

NAC類轉(zhuǎn)錄因子是一類植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，該類轉(zhuǎn)錄因子具有自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：其N端含有約150個(gè)氨基酸組成的高度保守NAM結(jié)構(gòu)域，并且在該結(jié)構(gòu)域中含有A、B、C、D和E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域［20]。而且，NAC類轉(zhuǎn)錄因子C端一般特異性很高，具有轉(zhuǎn)錄激活功能［21-22]，此外C端還富含絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等。另有研究表明，含有60個(gè)殘基的NAM結(jié)構(gòu)域，是由包圍著一些螺旋狀元件的一個(gè)扭曲的β-折疊組成［23]。絕大多數(shù)NAC基因僅有1個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，少數(shù)含有2個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，且大多數(shù)NAM結(jié)構(gòu)域兩端基本都具有保守基序［24]。

圖7 桃樹PpNAC72蛋白與其他物種中NAC蛋白的氨基酸序列比對

圖8 桃樹PpNAC72蛋白與其他物種NAC蛋白的聚類分析

本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)，獲得了PpNAC72的開放閱讀框編碼序列，利用生物信息學(xué)對所獲得的PpNAC72氨基酸序列分析顯示：該蛋白具有一個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，位置從N端第15-139氨基酸，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占3.44%，β-折疊結(jié)構(gòu)占14.04%。該基因的蛋白C端富含絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等，與NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼的蛋白質(zhì)特點(diǎn)一致。使用Bioedit對桃PpNAC72的氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子與其中與甜櫻桃NAC同源性最高，與其他物種的NAC蛋白同源性比對均在96%-70%，說明桃PpNAC72相對保守。

經(jīng)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥、番茄等模式作物上調(diào)控果實(shí)成熟的NAC轉(zhuǎn)錄因子較多，擬南芥中與果實(shí)成熟相關(guān)的NAC基因已有報(bào)道，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的下游轉(zhuǎn)錄因子基因AtNAC2可以被乙烯合成前體ACC誘導(dǎo)，推測該基因是乙烯和生長素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的一個(gè)下游基因，該基因超表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)根生長，同時(shí)具有明顯的耐鹽性［8]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的NAP轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育、葉片衰老、響應(yīng)生物和非生物脅迫等方面有重要作用，NAP轉(zhuǎn)錄因子不僅與葉片衰老有關(guān)，也與果實(shí)衰老緊密相關(guān)［25]。Liu等［26]研究發(fā)現(xiàn)甜橙的CitNAC在其成熟期和衰老期的果實(shí)中均有相應(yīng)的表達(dá)，預(yù)示著CitNAC可能調(diào)控甜橙果實(shí)的成熟衰老。擬南芥的3個(gè)NAC基因RD26/ANAC072、ANAC019和ANAC055均受干旱、高鹽或低溫的誘導(dǎo)表達(dá)，證實(shí)ANAC072參與脅迫響應(yīng)和ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑［27]。馬鈴薯StNAC72可能參與干旱及水分刺激信號(hào)傳導(dǎo)過程［28]。表明該基因在不同植物中的功能有所不同，在植物發(fā)育過程和逆境應(yīng)答中均發(fā)揮作用，是一個(gè)多功能轉(zhuǎn)錄因子。

本研究通過從桃樹‘津柳早紅’中分離克隆轉(zhuǎn)錄因子PpNAC72，對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行初步分析，并且對桃各個(gè)器官的PpNAC72進(jìn)行定量表達(dá)分析，結(jié)果表明，該基因在桃樹的各個(gè)部位均有表達(dá)，且在果實(shí)中的表達(dá)量達(dá)到最高，同時(shí)該基因的表達(dá)量在其生長期的不同時(shí)期有明顯變化，并呈現(xiàn)增加-減少-增加的趨勢。桃樹的果實(shí)發(fā)育分為3個(gè)時(shí)期：一是第一個(gè)迅速生長期，此期幼果縱徑生長迅速；二是緩慢生長期，即硬核期，此期果實(shí)生長較慢，主要是果核的硬化和胚胎的形成；三是第二個(gè)迅速生長期，此期細(xì)胞體積迅速膨大。PpNAC72的表達(dá)量隨著果實(shí)的生長不斷增加，在其果實(shí)生長階段的中后期表達(dá)量達(dá)到最高，此時(shí)果實(shí)可能處于迅速生長期；隨后表達(dá)量降低；但在果實(shí)接近成熟是時(shí)基因表達(dá)量增加，此時(shí)果實(shí)可能處于第二個(gè)迅速生長期。該基因的表達(dá)量的變化趨勢符合桃樹的生長規(guī)律，說明該基因極有可能參與果樹的生長發(fā)育，并有可能影響桃樹的成熟，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從桃樹中克隆獲得PpNAC72，其開放閱讀框1 050 bp，編碼349個(gè)氨基酸，具有一個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，PpNAC72蛋白為親水性蛋白，非膜蛋白。PpNAC72與甜櫻桃同源性最高，親緣性最近。PpNAC72可能參與果樹的生長發(fā)育，并有可能影響桃樹的成熟。