王 昕，張宇翔，任婷婷，趙倩囡，岳田利*，袁亞宏*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

茯磚茶屬于一種發(fā)酵黑茶，至今已有幾百年的歷史，產(chǎn)銷量一直占據(jù)黑茶市場的首位。冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是茯磚茶在特定溫度、濕度條件下，通過“發(fā)花”工藝長成的自然益生菌體，俗稱“金花”，是茯磚茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌之一[1-3]。胡治遠(yuǎn)等[4]研究報(bào)道，“金花”菌是茯磚茶加工過程中發(fā)花階段的主導(dǎo)微生物，對(duì)茯磚茶醇香、濃厚的風(fēng)味及健康功效有重要貢獻(xiàn)；胡謝馨等[5]研究表明“金花”菌對(duì)野葛、粉葛、葛渣固體發(fā)酵后總黃酮和葛根素含量的增加有很大貢獻(xiàn)。冠突散囊菌發(fā)酵[6]可使茶的成分發(fā)生很大變化[7-11]，產(chǎn)生大量氧化產(chǎn)物和水解產(chǎn)物以及有機(jī)酸等活性物質(zhì)，使發(fā)酵茶具有降脂[12-15]減肥、改善人體消化道功能[16]、治療心血管疾病[17-18]等保健功效[19-21]。有研究報(bào)道，一種從海藻中提取分離的內(nèi)生真菌冠突散囊菌可產(chǎn)生蒽醌類化合物，從而使其具有止血、抗菌、瀉下、利尿的作用[22]；Salazar等[23]研究表明冠突散囊菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物Compound 1具有抑制細(xì)胞生長的作用，在抗癌、抗腫瘤的應(yīng)用上有很重要的參考價(jià)值；李佳蓮等[24]研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等有較強(qiáng)的抑制作用。

以往對(duì)冠突散囊菌的研究主要集中在茶葉固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵周期長、工藝難控制且原料要求高（多以黑毛茶為原料，一級(jí)鮮葉要求一芽二三葉，二級(jí)一芽三四葉，三級(jí)一芽四五葉，四級(jí)一芽五六葉或開面葉），而對(duì)冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵研究較少且鮮見關(guān)于茶水浸提液滅菌處理影響主要理化指標(biāo)的研究，為進(jìn)一步縮短發(fā)酵周期[25]，同時(shí)解決由于夏秋茶滋味苦澀品質(zhì)差不能被有效開發(fā)利用的問題[26]，本實(shí)驗(yàn)著重研究冠突散囊菌的分離鑒定、生長特性，以夏秋茶（平利山茶）浸提液為原料，分離得到的冠突散囊菌作為發(fā)酵菌種，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵制備富含冠突散囊菌菌絲體的發(fā)酵黑茶產(chǎn)品。為進(jìn)一步揭示冠突散囊菌在液態(tài)發(fā)酵中的調(diào)控機(jī)制提供理論支持，為冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)提供可行性途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

手筑茯磚茶1 000 g，購自湖南益陽捷飲茶業(yè)有限公司；平利山茶（夏秋茶），2017年10月采自陜西省安康市平利縣茶園。

沒食子酸（分析純，純度98.5%）、谷氨酸（純度＞99%） 上海源葉生物科技有限公司；一水合茚三酮（純度＞97%） 北京奧科生物科技有限公司；福林-酚試劑（生化試劑，濃度1 mol/L） 上海荔達(dá)生物科技有限公司；Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒 北京奧科生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱、ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智誠分析儀器制造有限公司；SHB-Ш循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；CFX CONNCT聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Gel Doc XR+凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；JY600C電泳儀 北京市六一儀器廠；DGX-9143BC電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YT-CJ-2ND超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Ni-U光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制作與茶樣制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。稱取去皮馬鈴薯200 g，切片加1 000 mL蒸餾水，煮沸10～20 min，用紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值自然[27]。

茶葉制備：將鮮葉經(jīng)滾筒烘干制成干茶密封保存?zhèn)溆?，?GB/T 8302—2013《茶 取樣》[28]的規(guī)定取樣，并按GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測定》[29]的規(guī)定，制備試樣。

1.3.2 冠突散囊菌的分離純化

取樣器具用75%乙醇溶液消毒，將實(shí)驗(yàn)手筑茯磚茶于超凈工作臺(tái)操作。五點(diǎn)取樣法將每部分所取樣品混勻，然后稱取10 g茶樣于盛有250 mL 0.85%無菌生理鹽水的500 mL三角瓶中。28 ℃搖床洗脫2 h，洗脫茶樣中的霉菌孢子。將洗脫得到的茶樣原液梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取各梯度洗脫液100～200 μL均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度3 個(gè)平行。28 ℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天至長出菌落，挑取形態(tài)不同的單菌落于PDA培養(yǎng)基上劃線純化多次，直至得到單菌落，進(jìn)行形態(tài)觀察和斜面保存。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)PDA培養(yǎng)得到的單菌落，采用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit提取基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對(duì)所選菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：20 μL的總反應(yīng)體系中包含上下游引物各1 μL（5.94 nmol，稀釋100 倍），2 μL模板DNA，10 μL premix Taq，加無菌水至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外成像系統(tǒng)拍照，將單一透亮條帶的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序得到的序列和GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，確定相似度高的序列，得到目標(biāo)菌株冠突散囊菌。采用Cluxtal-X對(duì)基因序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA6.0對(duì)相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.3.4 生長特性分析

將斜面保存的冠突散囊菌于PDA培養(yǎng)基上活化1～2 次，用接種環(huán)挑取適量黃色閉囊殼于無菌生理鹽水，振搖均勻，血球計(jì)數(shù)使得孢子懸浮液濃度為107CFU/mL。以2%接種量接種孢子懸浮液于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)8 d。每隔12 h取出三角瓶，將培養(yǎng)液過濾于濾紙上，100～105 ℃烘至質(zhì)量恒定。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體干質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.5 形態(tài)學(xué)特征觀察

取斜面保存的冠突散囊菌劃線接種于PDA培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并進(jìn)行菌落特征、顯微形態(tài)及掃描電鏡的形態(tài)學(xué)研究。

1.3.6 山茶浸提液制備

參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》[30]和文獻(xiàn)[31]，平利山茶與蒸餾水比例為1∶25（g/mL），沸水浴浸提45 min，待浸提液冷卻后離心取上清液，得到山茶浸提液。

1.3.7 孢子懸浮液制備

將斜面保存的HNYYWX.13冠突散囊菌于PDA培養(yǎng)基上活化1～2 次，用接種環(huán)挑取適量黃色閉囊殼于無菌生理鹽水，振搖均勻，血球計(jì)數(shù)使得孢子懸浮液濃度為107CFU/mL，即得液態(tài)發(fā)酵所用孢子懸浮液。

1.3.8 冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵

以2%接種量將冠突散囊菌的孢子懸浮液分別接種到100 ℃、15 min滅菌的山茶浸提液、不滅菌的山茶浸提液（均不添加蔗糖）和添加4%蔗糖的山茶浸提液、不添加4%蔗糖的山茶浸提液（均不滅菌）中，28 ℃、120 r/min搖床發(fā)酵。分別于0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180 h測定發(fā)酵液的茶多酚總量、氨基酸總量，探究滅菌處理及碳源對(duì)冠突散囊菌液態(tài)發(fā)酵的影響。

1.3.9 指標(biāo)測定

參考GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[32]和GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》[33]的方法分別測定發(fā)酵液中的茶多酚總量和氨基酸總量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，茶多酚總量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.008 7+0.012 31X，R2=0.999 06；氨基酸總量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.875 78X-7.241 38×10-4，R2=0.998 17。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過OriginPro 9.0作圖，SPSS 20.0作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子生物學(xué)鑒定

2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳

圖1 茯磚茶部分優(yōu)勢(shì)菌種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析圖Fig. 1 PCR amplification of fungal ITS from Fuzhuan tea

茯磚茶中所分離出的部分菌種的ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析見圖1。3～13號(hào)泳道的條帶分子質(zhì)量約處于500～750 bp，且均呈現(xiàn)單一、明亮，表明此11 株菌的DNA純度較高、無污染，可送去基因測序進(jìn)一步鑒定。

2.1.2 基因測序

表1 湖南益陽茯磚茶測序結(jié)果Table 1 Results of sequencing of 33 strains in Fuzhuan tea from Yiyang, Hunan province

從表1可以看出，在湖南益陽茯磚茶中所分離的33 株菌中，編號(hào)分別為HNYYWX.1、HNYYWX.3、HNYYWX.5、HNYYWX.10、HNYYWX.17、HNYYWX.21、HNYYWX.22、HNYYWX.28的8 株菌經(jīng)過在GenBank中BLAST比對(duì)后，與數(shù)據(jù)庫中冠突散囊菌的模式菌株（JQ743649.1）相似度均達(dá)到99%，編號(hào)為HNYYWX.13的菌株相似度為100%，因此選擇HNYYWX.13菌株進(jìn)行冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵研究。

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從GenBank下載冠突散囊菌模式菌株或公認(rèn)菌株的相應(yīng)基因序列，以JQ743649.1（模式菌株）為參比，用MEGA 6.0軟件采用Neighbor-Joining Tree法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，編號(hào)為HNYYWX.1、HNYYWX.3等21 株菌與模式菌株JQ743649.1優(yōu)先聚集到一起，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明其與模式菌株的親緣關(guān)系非常接近；在此親緣關(guān)系下，菌株HNYYWX.7和HNYYWX.27、HNYYWX.10和HNYYWX.18差異更小。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位分析為研究相似菌株的差異性提供了很好的參考和指導(dǎo)。

圖2 茯磚茶分離株ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 NJ phylogenetic tree based on ITS sequences of fungi in Fuzhuan tea

2.2 冠突散囊菌生長曲線

如圖3所示，培養(yǎng)0～12 h時(shí)，由于PDB培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，冠突散囊菌很快適應(yīng)生長環(huán)境，大量吸收培養(yǎng)基中的碳源等營養(yǎng)物質(zhì)，促使無性孢子迅速萌發(fā)生長，使得前12 h菌絲體干質(zhì)量增加近0.015 g/mL。隨后繼續(xù)培養(yǎng)12～132 h，期間菌體生長明顯趨于平穩(wěn)，呈緩慢增加的趨勢(shì)。完全適應(yīng)PDB生長環(huán)境的冠突散囊菌，經(jīng)過前12 h菌體的大量繁殖，冠突散囊菌菌體干質(zhì)量大大增加，使得PDB培養(yǎng)體系內(nèi)菌體相對(duì)密度大大增加，菌體生長空間相對(duì)變小。培養(yǎng)到132～156 h時(shí)可見菌體生長速率大幅提升，并且156 h菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大為0.058 g/mL，可知此階段為冠突散囊菌活力最旺盛的時(shí)期。到168 h時(shí)，菌絲體干質(zhì)量略微減少（0.002 g/mL），可能是由于菌絲體自溶造成[35]。

圖3 HNYYWX.13冠突散囊菌培養(yǎng)過程中菌絲體干質(zhì)量變化Fig. 3 Change in dry biomass yield of E. cristatum HNYYWX.13 during incubation

2.3 冠突散囊菌形態(tài)特征

圖4 HNYYWX.13冠突散囊菌的形態(tài)特征Fig. 4 Morphological characteristics of E. cristatum HNYYWX.13

將分離得到的冠突散囊菌接種到PDA瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)，約48 h冠突散囊菌開始生長，首先長出白色菌絲體向外延伸，菌落中心逐漸由白色變?yōu)闇\黃色，圖4A為冠突散囊菌生長2 d的形態(tài)。圖4B中，黃色閉囊殼產(chǎn)生在整個(gè)菌落區(qū)域內(nèi)，菌落直徑達(dá)到7～10 mm，呈淡黃色，第5天時(shí)菌落直徑18～20 mm，菌落邊緣呈淡黃色，中心凸起，越靠近菌落中心顏色依次變深呈黃色、深黃色，菌落中心顏色深至橄欖褐色或深褐色，并且菌落中心有少許黃色透明小液珠滲出。菌落生長7 d時(shí)，直徑達(dá)到25～30 mm，菌落背部有大量色素滲出，擴(kuò)散進(jìn)入培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)深褐色。約12 d，能夠很明顯觀察到菌落中心有干澀、凸起褶皺，菌落直徑達(dá)40～45 mm。圖4C為冠突散囊菌生長19 d形態(tài)，此時(shí)菌落直徑達(dá)50～55 mm，基本不再變化，顏色全部呈現(xiàn)褐色，分泌出的色素使整個(gè)培養(yǎng)基呈黑褐色。

圖4D中孢子梗簇?fù)?，菌絲體交錯(cuò)（紅色橢圓）。圖4E觀察到單個(gè)子囊果為橢球狀（紅色方框）及向外發(fā)散的菌絲體（紅色橢圓）。

通過電鏡觀察，冠突散囊菌能產(chǎn)生大量閉囊殼（圖4F），纏繞在菌絲中，呈球形或近球形，直徑為750～950 μm。子囊球形或近球形，由擬薄壁組織包裹子囊孢子，隨著子囊孢子的發(fā)育，擬薄壁組織逐漸溶解漏出球狀體的子囊孢子，直徑約26～32 μm，圖4G為大量散落的子囊孢子。隨著子囊孢子的進(jìn)一步發(fā)育，如圖4H、I所示，整個(gè)子囊孢子呈“雙花”狀，子囊孢子呈雙凸透鏡形，“赤道”（4I圖中紅色標(biāo)記）部分具有兩條明顯的縱向雞冠狀“脊”，較薄，反卷，赤道溝較深。

2.4 冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵

2.4.1 滅菌處理對(duì)發(fā)酵過程中主要理化指標(biāo)的影響

圖5 發(fā)酵過程中茶多酚總量的變化Fig. 5 Changes in tea polyphenol content during liquid-state fermentation

茶多酚是茶葉發(fā)酵過程中菌體生長的主要碳源，通過冠突散囊菌的代謝調(diào)控，可將茶葉中的茶多酚轉(zhuǎn)化為小分子的功能性成分[11,34]，如兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、茶黃素[35-36]、茯茶素等，使茶多酚總量減少，由圖5可知，接種冠突散囊菌的發(fā)酵液中，茶多酚總量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸減少，對(duì)于浸提液直接發(fā)酵過程，茶多酚總量由15.09%減少到10.32%；浸提液滅菌后發(fā)酵，茶多酚總量由14.32%減少到11.64%。前者發(fā)酵過程，冠突散囊菌利用了更多的茶多酚，大大促進(jìn)了新的代謝產(chǎn)物的生成。正如文獻(xiàn)[37]通過冠突散囊菌調(diào)控，經(jīng)過氧化、縮合等作用生成了更多種類的功能產(chǎn)物，如：茯茶素A和茯茶素B[38]、異戊二烯衍生物[39]、三萜烯類化合物[40]、7 種B環(huán)裂解兒茶素（黃烷-3-醇）衍生物[8]以及其他未解析清楚的未知化合物[41]；許杰等[42]研究表明冠突散囊菌發(fā)酵過程中，表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯氧化縮合形成茶黃素，茶黃素進(jìn)一步氧化、與氨基酸、蛋白質(zhì)等縮合成形成茶紅素等功能性成分。配對(duì)t檢驗(yàn)分析表明，滅菌后發(fā)酵與直接發(fā)酵，茶多酚總量存在極顯著差異（P=0.002＜0.01）。此外，滅菌處理前，發(fā)酵液中茶多酚總量為15.09%，而滅菌處理后茶多酚總量減少為14.32%，說明滅菌處理會(huì)破壞大量的茶多酚，對(duì)茶葉自身營養(yǎng)有很大損失；發(fā)酵過程中，浸提液直接發(fā)酵轉(zhuǎn)化近5%的茶多酚，而滅菌處理后發(fā)酵僅轉(zhuǎn)化約3%的茶多酚，表明浸提液直接接種冠突散囊菌發(fā)酵，可產(chǎn)生更多具有生物活性的小分子物質(zhì)，更有利于豐富發(fā)酵茶湯的品質(zhì)。

圖6 發(fā)酵過程中氨基酸總量的變化Fig. 6 Changes in amino acid content during liquid-state fermentation

由圖6可知，接種冠突散囊菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中氨基酸總量呈上升趨勢(shì)，說明冠突散囊菌的代謝產(chǎn)生了大量氨基酸。研究[25]報(bào)道，接種冠突散囊菌發(fā)酵后，發(fā)酵液中會(huì)產(chǎn)生多種豐富的氨基酸，如人體必需氨基酸：賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等。發(fā)酵前約48 h，冠突散囊菌逐漸適應(yīng)生長環(huán)境。隨后，菌體生長比較穩(wěn)定，開始代謝產(chǎn)生各種氨基酸。顯然，浸提液直接發(fā)酵所得發(fā)酵液中氨基酸總量較滅菌處理更高。配對(duì)t檢驗(yàn)分析表明，滅菌后發(fā)酵與直接發(fā)酵，氨基酸總量存在極顯著差異（P=0.000＜0.01）。因此不滅菌處理比傳統(tǒng)滅菌處理發(fā)酵效果更好。

2.4.2 碳源對(duì)發(fā)酵過程中主要理化指標(biāo)的影響

由圖7、8可知，兩種處理方式下，發(fā)酵液中茶多酚總量降低，氨基酸總量升高，其中發(fā)酵前期氨基酸總量升高可能是由于冠突散囊菌的調(diào)控代謝生成，發(fā)酵后期可能由于冠突散囊菌菌絲體自溶釋放氨基酸到發(fā)酵液中[16]。添加碳源后發(fā)酵，48～108 h茶多酚減少速率明顯快于不添加碳源，正如文獻(xiàn)報(bào)道，蔗糖誘導(dǎo)冠突散囊菌“發(fā)花”[14]，其生長繁殖速度大大加快，利用發(fā)酵液中大量的茶多酚，將其轉(zhuǎn)化為小分子功能性成分，大大發(fā)揮冠突散囊菌代謝產(chǎn)物的生物活性功能（圖7），所以添加碳源有利于茶多酚轉(zhuǎn)化；如圖8所示，兩種處理方式下，發(fā)酵過程中氨基酸總量均呈上升趨勢(shì)且氨基酸生成量基本一樣，所以碳源對(duì)冠突散囊菌發(fā)酵過程中氨基酸總量影響不大。配對(duì)t檢驗(yàn)分析表明，添加碳源與未添加碳源發(fā)酵過程中，茶多酚總量和氨基酸總量均存在極顯著差異（P=0.000＜0.01）。綜合兩種指標(biāo)，添加碳源更有利于冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵。

圖7 碳源作用下發(fā)酵過程中茶多酚總量的變化Fig. 7 Changes in tea polyphenol content during fermentation with and without addition of carbon source

圖8 碳源作用下發(fā)酵液中氨基酸總量的變化Fig. 8 Changes in amino acids during fermentation with and without addition of carbon source

3 結(jié) 論

以湖南益陽手筑茯磚茶為研究對(duì)象，通過分離純化、PCR、基因測序的手段鑒定得到8 株序列相似度為99%的冠突散囊菌，1 株編號(hào)為HNYYWX.13序列相似度為100%的冠突散囊菌；對(duì)菌株HNYYWX.13進(jìn)行菌落形態(tài)、顯微形態(tài)及掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察，并探究得到其生長曲線，培養(yǎng)到132～156 h時(shí)菌體生長速率大幅提升，156 h菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大為0.058 g/mL，此階段為冠突散囊菌活力最旺盛的時(shí)期；選取菌株HNYYWX.13制備孢子懸浮液接種于平利山茶（夏秋茶）浸提液中液態(tài)發(fā)酵，研究了滅菌處理、添加碳源對(duì)冠突散囊菌發(fā)酵下茶多酚總量及氨基酸總量的影響，得出結(jié)論：添加碳源、不進(jìn)行滅菌處理更有利于冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵。

本研究探索了冠突散囊菌在平利山茶液態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用潛力，避免其固態(tài)發(fā)酵過程中條件不易控制、不宜規(guī)?；a(chǎn)的缺陷，利用我國浪費(fèi)最嚴(yán)重的夏秋茶，大大提高了茶資源利用率，并且提出傳統(tǒng)茶水浸提液滅菌后發(fā)酵的誤區(qū)，指出不進(jìn)行滅菌處理更有利于冠突散囊菌的液態(tài)發(fā)酵，為其工業(yè)化生產(chǎn)及茶產(chǎn)品的深加工技術(shù)提供了可行性路徑。但是關(guān)于冠突散囊菌在液態(tài)發(fā)酵中代謝機(jī)制還需進(jìn)一步研究，這對(duì)于深入揭示冠突散囊菌多種保健功效具有重要意義。