沈鵬輝，樊詩堃，趙謀明，周非白*

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，其必需氨基酸組成完整，營養(yǎng)價值接近于動物蛋白。同時，因具有多種功能特性，大豆蛋白被廣泛應用于食品工業(yè)中。然而在豆制品加工過程中，高活性脂肪氧合酶易催化多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應，產(chǎn)生大量活性氧及次生氧化產(chǎn)物，可進一步誘導蛋白氧化[1]。氧化通過修飾氨基酸側(cè)鏈可以改變蛋白的一級結(jié)構(gòu)；而羰基、共價鍵的形成等會進一步改變蛋白構(gòu)象，導致其二、三、四級結(jié)構(gòu)的改變[2]。蛋白的結(jié)構(gòu)與功能緊密相關(guān)，而氧化通常會伴隨著蛋白質(zhì)溶解性、保水性、凝膠性及乳化性等[3-5]功能特性的改變，從而影響蛋白的加工特性。生產(chǎn)實際中，油脂-蛋白共存現(xiàn)象使得蛋白氧化不可避免，鑒于脂質(zhì)過氧化過程及產(chǎn)物的復雜性，明晰反應主要副產(chǎn)物對蛋白結(jié)構(gòu)及功能特性的影響是相關(guān)工作開展的基礎(chǔ)。

乳液是食品工業(yè)中最重要的食品體系之一，常見的如牛奶、乳飲料、酸奶、涂抹醬及乳化肉制品等均可歸為蛋白穩(wěn)定的乳液體系[6]。當今社會，高脂膳食導致人體能量攝入過剩，使得高血脂、肥胖等健康問題日益突出。因此，乳液中脂質(zhì)的消化問題受到越來越多食品科技工作者的關(guān)注[7-9]。通常認為，乳液的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性與其消化特性具有密切關(guān)系。作為常用乳液界面穩(wěn)定劑，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變是影響蛋白基乳液結(jié)構(gòu)及脂肪消化特性的直接因素。梁晗妮[10]利用不同濃度脲素作用于蕓豆7S球蛋白，發(fā)現(xiàn)高濃度的脲素會使蕓豆7S球蛋白的三聚體結(jié)構(gòu)逐漸解離成單聚體，導致油水界面吸附蛋白濃度的減少和油滴絮凝程度的增加。Sarkar等[11]研究表明，通過控制界面蛋白的聚集可降低油脂的生物利用度，增加乳液胃排空時間，從而延緩脂質(zhì)消化。前期研究表明，氧化可改變蛋白分子間的交聯(lián)類型及交聯(lián)程度，導致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及表面特性的變化，進而影響蛋白的界面行為及體相/界面蛋白的相互作用[12]。目前，關(guān)于氧化誘導的蛋白結(jié)構(gòu)變化對乳液消化特性影響的研究仍然很有限。

本實驗以丙二醛（malondialdehyde，MDA）為代表性次級油脂氧化產(chǎn)物作用于大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI），研究不同MDA濃度作用下蛋白結(jié)構(gòu)（巰基、羰基、席夫堿、等電點和亞基組成）的變化。進一步以氧化蛋白制備水包油（O/W）型乳液并建立體外模擬脂質(zhì)消化體系，研究乳液在消化過程中的穩(wěn)定性及脂肪酸釋放動力學。本研究擬從生物化學角度探究氧化對蛋白結(jié)構(gòu)、乳液形成及乳液消化特性的影響及內(nèi)在關(guān)聯(lián)，為全面評估蛋白質(zhì)氧化行為對營養(yǎng)健康的影響提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍脫脂豆粕 山東禹王有限公司；金龍魚玉米油市售；1,1,3,3-四甲氧基丙烷、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、乙二胺四乙酸二鈉 美國Sigma-Aldrich公司；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、疊氮化鈉、甲醇、乙酸 廣州精科化玻儀器公司；溴酚藍、考馬斯亮藍R250、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、巰基乙醇、甘油、丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺 美國Genview公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SL2000A多功能粉碎機 青島納麗雅廚具設(shè)備有限公司；EL 204/EL 3002電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CR22N高速冷凍離心機 日本日立公司；Sorvall Legend Micro 17微量離心機 美國Thermo公司；WN7501V紫外-可見分光光度計 上海佐科工業(yè)設(shè)備有限公司；pHS-3E pH計 北京雷磁儀器有限公司；Mini-PROTEAN 3 Cell電泳儀 美國Bio-Rad Laboratories公司；JB-1磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司；Nano-ZS納米粒度及Zeta電位分析儀、Mastersizer 2000粒度分布儀 英國Malvern公司；THZ-82A恒溫振蕩器常州澳華儀器有限公司；C300化學發(fā)光分子成像系統(tǒng)美國Azure Biosysterms公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

將脫脂低溫豆粕粉碎至粉末，過40 目篩，然后以1∶10的質(zhì)量比加入蒸餾水分散，并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 8.0，在室溫下攪拌2 h。然后紗布過濾，室溫下以8 000×g離心20 min，收集上清液，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.5，4 ℃靜置30 min后離心（8 000×g，20 min），收集沉淀，后用蒸餾水洗滌沉淀多次除去表面殘留清蛋白。取出沉淀稱量濕質(zhì)量，加入濕質(zhì)量7 倍的蒸餾水后緩慢攪拌，調(diào)節(jié)至pH 7.5，待樣品溶解后透析48 h，期間每6 h換水一次。透析后凍干，所得分離蛋白于干燥低溫的環(huán)境下保存?zhèn)溆?，并以凱氏定氮法測定蛋白含量。

1.3.2 MDA儲備液及氧化SPI的制備

1.3.2.1 MDA儲備液的制備

通過水解1,1,3,3-四甲氧基丙烷配制MDA儲備液，方法參照Wu Wei等[13]有所改進。MDA儲備液經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，10 mmol/L，pH 7.0）稀釋后在267 nm波長處測定吸光度，摩爾吸光系數(shù)為31 500 L（mol·cm）。

1.3.2.2 MDA氧化SPI的制備

將SPI分散于PBS配成質(zhì)量分數(shù)4%的蛋白分散液，于室溫下攪拌2 h，4 ℃水化過夜（12 h），離心（10 000×g，20 min，20 ℃）并收集上清液。添加不同濃度的MDA溶液作用于蛋白分散液，使MDA的終濃度分別為0、0.1、1、2.5、5、10 mmol/L，體系蛋白終質(zhì)量濃度為30 mg/mL（含NaN30.5 mg/mL）?；旌衔锸覝兀?5 ℃）避光反應24 h后透析36 h（取透析液于267 nm比色以確定透析完全）獲得不同氧化程度的蛋白，Lowry法測定蛋白濃度后凍干保存。

1.3.3 氧化SPI的結(jié)構(gòu)表征

1.3.3.1 羰基含量的測定

參考Morzel等[14]的方法，采用DNPH比色法測定氧化SPI的羰基值，結(jié)果以nmol/mg表示。

1.3.3.2 巰基含量的測定

參考Morzel等[14]的方法，通過5,5’-二硫硝基苯甲酸衍生測定氧化SPI的巰基含量，結(jié)果以nmol/mg表示。

1.3.3.3 席夫堿熒光光譜掃描

將氧化SPI用PBS稀釋至一定質(zhì)量濃度（0.2 mg/mL）以進行席夫堿的內(nèi)源熒光掃描。將激發(fā)波長設(shè)定為350 nm，記錄400～600 nm的發(fā)光光譜。設(shè)定狹縫寬度為5 nm，以240 nm/min收集數(shù)據(jù)。記錄峰值及峰值對應的波長。電壓為500 mV。

1.3.3.4 氧化SPI等電點的測定

將凍干SPI分散于蒸餾水中（1 mg/mL），充分水化后單向調(diào)整樣品pH 6.5～3.5，采用Nano-ZS納米粒度及電位分析儀測定不同pH值條件下蛋白分散液Zeta電位，并以此判斷氧化對SPI等電點的影響。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

參照Flores等[15]的方法有所改進，并分別在還原及非還原情況下進行。其中還原性樣品緩沖液組成為：60 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8）、2 g/100 mL十二烷基硫酸鈉，25%甘油、14.4 mmol/L β-巰基乙醇、0.05 g/100 mL溴酚藍；非還原性樣品緩沖液不含β-巰基乙醇，其他組成與還原性樣品一致。標準蛋白質(zhì)Markers分子質(zhì)量25～170 kDa。最終上樣量為25 μg蛋白。凝膠電泳于恒流條件（25 mA）下進行，其中濃縮膠及分離膠分別為5%及12%。凝膠染色及脫色后于C300成像系統(tǒng)進行圖片處理。

1.3.5 乳液制備

將氧化SPI分散于PBS配制成一定質(zhì)量濃度的分散液，加入玉米油，使得體系蛋白質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL，玉米油為10 g/100 mL。上述混合液經(jīng)高速均質(zhì)攪拌機預乳化（10 000×g，2 min）后，超聲處理5 min（150 W、1 s脈沖，冰?。?，即得新鮮制備的乳液。添加0.02% NaN3以防微生物作用。

1.3.6 乳液體外消化模型

參考Tokle[16]和Zeeb[17]等的方法進行乳液體外模擬胃腸道消化實驗。

模擬胃部消化：取20 mL乳液和模擬胃液（含2 g/L NaCl，84 mmol/L HCl，3.2 g/L胃蛋白酶）1∶1混合，調(diào)pH 2.0，在120 r/min、37 ℃模擬胃部消化1 h。反應結(jié)束后調(diào)pH 7.0。

模擬腸道消化：取30 mL上述混合物與模擬腸液混合后進行模擬腸道消化（37 ℃、120 r/min），終體系含10 mmol/L CaCl2、150 mmol/L NaCl、10 mg/mL膽鹽、1.6 mg/mL胰脂肪酶。在此消化的2 h內(nèi)，采用pH-Stat法，通過不斷加入0.1 mol/L NaOH維持體系pH 7.0，記錄反應時間及NaOH消耗量。通過消耗的NaOH量可計算乳液體系中游離脂肪酸釋放率，公式如下：

式中：V（NaOH）為中和所產(chǎn)生的游離脂肪酸所需的氫氧化鈉的體積/mL；m（NaOH）為氫氧化鈉溶液濃度（0.1 mol/L）；WLipid為初始脂質(zhì)的總質(zhì)量（1.5 g）；MLipid為玉米油的摩爾質(zhì)量（800 g/mol）。

1.3.7 乳液的結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 乳液粒徑的測定

采用Mastersizer 2000粒度分布儀測定乳液油滴的粒徑大小。參數(shù)設(shè)置：顆粒折射率為1.473；顆粒吸收率為0.002；分散劑為水；分散劑折射率為1.330。采用d[3,2]表面積平均直徑表征油滴粒度的平均大?。?/p>

式中：ni和di分別為液滴數(shù)及液滴直徑/μm。每組測3 個平行數(shù)據(jù)。

1.3.7.2 乳液界面蛋白含量測定

取1 mL乳液以室溫10 000×g離心60 min，得到上下兩層，其中上層為乳析層，下層為乳清層。用帶針頭的注射器將下清層取出，并過0.22 μm的濾膜，濾液采用Lowry法以BSA作標準曲線測定濾液中蛋白質(zhì)含量。界面蛋白質(zhì)量分數(shù)的計算公式如下：

式中：Cs為用于乳液制備的初始蛋白分散液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；Cf為濾液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.7.3 非界面蛋白組成

取1.3.7.2節(jié)得到的下清層，分別添加還原/非還原的電泳樣品緩沖液使所得樣品的蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，樣品充分振蕩并過夜。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗參考1.3.4節(jié)。

1.3.7.4 乳液電勢分析

將乳液用PBS稀釋100 倍后，采用Nano-ZS納米粒度及電位分析儀測定不同pH值條件下蛋白分散液的Zeta電位，每組測3 個平行數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗重復3 次，以 ±s表示最終實驗結(jié)果。采用SPSS 11.5（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，通過Studente Newmane Keuls（S-N-K）測試用以比較3 組實驗均值在5%水平上是否有顯著性差異。采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MDA氧化對蛋白結(jié)構(gòu)的影響

MDA可導致蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛性的氧化，形成蛋白質(zhì)羰基衍生物和共價交聯(lián)物[14]。由表1可知，在較低濃度的MDA（0～2.5 mmol/L）作用下，羰基含量與MDA濃度基本呈線性變化關(guān)系，說明MDA中的一個活性羰基以1∶1加成方式與蛋白質(zhì)的伯胺反應形成烯胺，這與Burcham等[18]的研究結(jié)果一致。而隨著MDA濃度的進一步增加（5～10 mmol/L），羰基的增長速率明顯降低，可能是由于蛋白在MDA作用下與Cys、His和Lys殘基的NH或NH2基團，特別是與Lys殘基的ε-氨基反應形成席夫堿而產(chǎn)生蛋白-蛋白交聯(lián)[19]，通過形成蛋白聚集體而包埋了親核側(cè)鏈。

表1 氧化對蛋白結(jié)構(gòu)和等電點的影響Table 1 Effects of oxidation on protein structure and isoelectric point

如表1所示，較低濃度MDA（0～2.5 mmol/L）對SPI巰基含量的影響整體較?。≒＞0.05），其中1 mmol/L濃度MDA作用可輕微提高SPI的游離巰基含量，可能與低氧化刺激下蛋白結(jié)構(gòu)的展開有關(guān)。而高濃度MDA（5～10 mmol/L）作用下，巰基含量顯著下降至1.8 nmol/mg（P＜0.05），損失率約32%。蛋白氧化過程中巰基會發(fā)生一系列復雜的反應，出現(xiàn)一定程度的損耗并形成各種氧化產(chǎn)物，如次磺酸、亞磺酸和二硫化物等，因而蛋白氨基酸側(cè)鏈在MDA作用下可因形成二硫鍵主導的共價交聯(lián)而導致巰基損失。結(jié)合羰基含量的變化結(jié)果可知，巰基的損失伴隨著羰基的生成，表明油脂氧化產(chǎn)物MDA氧化攻擊的廣泛性。

此外，隨著MDA濃度的增加，SPI的席夫堿熒光強度明顯加強，并在0.1～5 mmol/L MDA濃度下呈線性增長（y=683.48x+113.58，R2=0.996），表明席夫堿含量的增加。MDA是包含兩個反應性羰基官能團的分子，這些基團易與蛋白質(zhì)的游離氨基反應形成席夫堿，使分子間發(fā)生強交聯(lián)；同時，席夫堿熒光光譜峰值處的吸收波長隨MDA作用濃度的增加而發(fā)生輕微紅移，表明蛋白所處疏水環(huán)境發(fā)生變化，可能與氧化誘導的蛋白交聯(lián)/聚集相關(guān)。

由表1可知，低濃度MDA（0～1 mmol/L）對蛋白等電點的影響較小，而在較高MDA濃度（2.5～10 mmol/L）作用下，SPI的等電點向低pH值偏移，可能與MDA作用下帶電荷氨基酸的氧化損失（NH或NH2基團受到氧化形成席夫堿，導致帶正電荷基團的損失[20]）或因蛋白結(jié)構(gòu)聚集而導致的內(nèi)卷有關(guān)[21]。

2.2 MDA氧化對蛋白亞基組成的影響

圖1 經(jīng)不同濃度MDA作用后SPI的凝膠電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE patterns of SPI upon treatment with MDA at different concentrations

SPI主要由β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）組成[22]。7S是三聚體糖蛋白，分子質(zhì)量為150～200 kDa。組成7S的主要亞基分別為α（分子質(zhì)量約為68 kD）、α’（分子質(zhì)量約為72 kD）、β（分子質(zhì)量約為52 kD），這3 個亞基通過疏水相互作用形成三聚體。11S是一種六聚體蛋白，不含糖基，分子質(zhì)量為300～380 kDa。11S由5 個亞基組成，每個亞基均由一條酸性肽鏈（A亞基，分子質(zhì)量約為35 kDa）和一條堿性肽鏈（B亞基，分子質(zhì)量約為20 kDa）通過一個二硫鍵連接而成。

由圖1可知，在非還原條件下，隨著MDA濃度的升高，170 kDa（β-伴大豆球蛋白7S，αβ2）、57 kDa（大豆球蛋白11S的AB亞基）及30 kDa（大豆球蛋白11S的A5B3亞基）的條帶濃度逐漸降低。同時，高分子質(zhì)量聚集體在凝膠頂端的積聚逐漸加深，表明蛋白受氧化而產(chǎn)生聚集，且聚集程度隨著蛋白氧化的加深而不斷增加。進一步分析在還原條件下SPI的電泳圖，研究發(fā)現(xiàn)大部分分離膠頂端的聚集體在β-巰基乙醇作用下消失，表明聚集/交聯(lián)的形成很大程度上由二硫鍵或類似機制誘導。同時，聚集的11S組分解離形成的A、B亞基條帶在β-巰基乙醇作用下逐漸恢復，且與空白樣品相比并無明顯差異，表明在MDA作用下11S組分間主要形成由二硫鍵主導的共聚物；然而，針對7S組分，其解離形成的α’、α和β亞基條帶僅得到部分恢復，表明MDA可誘導7S組分同時形成二硫鍵和非二硫鍵誘導的聚集。此外，分離膠頂部高分子質(zhì)量區(qū)的彌散條帶強度仍隨著MDA濃度的升高而加深，表明高濃度MDA作用下非二硫鍵主導的聚集的增加。Huang Youru[23]及Wu Wei[24]等的研究也發(fā)現(xiàn)油脂氧化產(chǎn)物作用于SPI可導致非二硫鍵誘導的聚集產(chǎn)生，其中Huang Youru等[23]表明亞油酸氧化可通過增強蛋白分子間的疏水相互作用、氫鍵或靜電作用等非共價鍵增強蛋白聚集；而Wu Wei等[24]認為這種聚集是由非二硫鍵的共價鍵引起的。結(jié)合羰基和席夫堿的結(jié)果（表1），MDA作用下非二硫鍵誘導的蛋白交聯(lián)很可能與形成的席夫堿有關(guān)。

2.3 MDA氧化蛋白對乳液結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 乳化活性及乳液表面電勢

圖2 MDA氧化蛋白對乳液粒徑分布（A）和Zeta電位（B）的影響Fig. 2 Effect of MDA-induced protein oxidation on particle size distribution (A) and zeta-potential (B) of emulsion

乳液粒徑大小可反映乳化劑的乳化活性[25]。由圖2A可知，經(jīng)MDA氧化處理的SPI制備的乳液粒徑分布差距不大，均呈現(xiàn)單峰分布；同時隨著MDA濃度的升高，各氧化樣品制備的乳液其粒徑亦無顯著差異，結(jié)果表明氧化對蛋白乳化活性影響不大。

由蛋白穩(wěn)定的乳液油滴間的靜電排斥力與相互吸引力很大程度上由蛋白結(jié)構(gòu)決定，并與乳液穩(wěn)定性密切相關(guān)。油滴表面的電荷量決定了油滴間的排斥力大小，可通過測量表面電勢反映。MDA氧化蛋白對乳液Zeta電位的影響如圖2B所示。由于乳液pH值高于蛋白等電點，所有乳液的Zeta電位均為負值。隨著MDA濃度的升高，蛋白乳液Zeta電位均呈現(xiàn)下降趨勢（絕對值升高），可能與氧化導致的蛋白結(jié)構(gòu)變化及其等電點的改變相關(guān)（表1）。尤其是高濃度MDA（5～10 mmol/L）處理后，蛋白乳液的Zeta電位顯著下降（P＜0.05），與SPI的等電點在高濃度MDA作用下向低pH值偏移一致。

2.3.2 界面蛋白含量分析

圖3 MDA氧化蛋白對乳液界面蛋白含量的影響Fig. 3 Effect of MDA-induced protein oxidation on protein content at emuision interface

由圖3可知，未氧化處理的SPI制備的乳液其界面蛋白質(zhì)量分數(shù)約為43%，而較低濃度MDA（0.1 mmol/L）處理SPI即可顯著降低其在界面上的吸附（-11.6%，P＜0.05），可能與MDA誘導下蛋白聚集體的形成有關(guān)。已有研究表明，蛋白聚集體的形成可能通過位阻效應降低其在界面的吸附[26]，而氧化作用下增強的蛋白分子帶電性一定程度上可增加其移動速率。隨著MDA氧化濃度的進一步增加，界面蛋白含量變化平緩，雖整體上有降低趨勢但各氧化濃度之間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.3 MDA氧化蛋白對乳液非界面蛋白組成的影響

圖4 SPI經(jīng)不同濃度MDA作用后乳液非界面蛋白組成的凝膠電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE pattern of SPI after treatment with MDA at different concentrations

比較氧化蛋白與乳液非界面蛋白的組分差異研究氧化蛋白對乳液界面組成的影響，由圖4可知，在非還原條件下，乳液非界面蛋白組成與氧化SPI組成（圖1）相似，但170 kDa組分條帶在2.5～10 mmol/L MDA作用下消失不見，同時α’和α亞基在5～10 mmol/L MDA作用下也消失不見，說明在較高的氧化程度下，SPI的7S組分以及其α’和α亞基具有較好的吸附到乳液界面的能力；同時在還原條件下，和氧化SPI還原條件下的電泳圖相比，α’、α及β亞基恢復程度變小，其中α’較α及β更易受MDA影響，而且在MDA濃度為10 mmol/L時，α’亞基條帶消失，說明此時α’亞基全部吸附到了乳液界面上。上述結(jié)果表明，各濃度MDA處理SPI對乳液界面蛋白組分影響較大，在經(jīng)高濃度MDA氧化后更多7S組分以聚集狀態(tài)參與了界面蛋白組成，其中以α’組分吸附到乳液界面的能力最強。

2.4 MDA氧化蛋白對乳液消化特性的影響

2.4.1 乳液消化動力學

圖5 乳液消化動力學曲線Fig. 5 Digestion kinetic curve of emulsions stabilized by oxidized SPI

通過比較游離脂肪酸釋放速率及程度可以分析乳液的脂質(zhì)消化特性。由圖5可知，未經(jīng)MDA氧化的SPI制備的乳液經(jīng)消化后釋放的游離脂肪酸程度最高，釋放率約為34.8%。經(jīng)0.1 mmol/L MDA處理的SPI制備的乳液釋放率顯著降低（P＜0.05），但在0.1～2.5 mmol/L區(qū)間內(nèi)并無顯著變化（P＞0.05）。隨著MDA濃度的進一步升高，游離脂肪酸釋放率明顯降低并在10 mmol/L達到最低（約27%）。大量的研究表明，胃腸道中的脂肪酶必須吸附至乳滴表面才可展開并暴露其作用位點，進而與油脂接觸啟動水解過程。因而蛋白結(jié)構(gòu)的改變可通過改變?nèi)橐航Y(jié)構(gòu)，影響界面蛋白吸附層與脂肪酶的交互作用，進而改變油脂的消化進程[27-28]。已有研究表明，7S組分可以形成高黏彈性的界面膜[29]，從而阻止或減緩脂肪酶與油脂的接觸。MDA誘導的氧化作用下，7S組分間可形成以二硫鍵及席夫堿共誘導的強共價交聯(lián)，結(jié)合乳液非界面蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果，隨著MDA濃度的升高，更多聚集狀態(tài)的7S組分參與界面組成，可增強界面剛性及致密性，一定程度上可減緩脂肪酶與油脂的接觸，進而降低乳液脂質(zhì)釋放率。

已有研究表明，膽鹽是脂質(zhì)消化中的關(guān)鍵性物質(zhì)，它通過替代界面的表面活性物質(zhì)促進脂肪酶和乳液界面層的結(jié)合，從而加快脂質(zhì)的消化[30]。研究進一步對所獲得的消化動力學曲線進行非線性擬合，以期通過對擬合曲線求導獲得各時間點的消化速率。由于脂質(zhì)的初始消化速率在很大程度上可以影響消化進程，本實驗主要探究蛋白結(jié)構(gòu)變化對乳液消化初始速率的改變。實驗發(fā)現(xiàn)上述所有蛋白乳液的消化曲線經(jīng)擬合均符合下列方程：

式中：y為游離脂肪酸釋放率；x為時間；a、b、c均為擬合參數(shù)。對上述方程求導，其x=0點處的值即為乳液消化的起始速率，各MDA濃度作用SPI后制備的乳液的消化起始速率如圖6所示。乳液的起始消化速率隨著MDA濃度的升高而降低，并在0～10 mmol/L內(nèi)符合指數(shù)遞減方程（2.5 mmol/L MDA之后變化趨于平穩(wěn)）：

結(jié)果表明乳液界面上的蛋白交聯(lián)/聚集體減弱了膽鹽在脂質(zhì)消化中的作用，使得脂質(zhì)的初始消化速率降低。Maldonado-Valderrama等[31]研究發(fā)現(xiàn)高黏彈性的界面膜能夠阻礙膽鹽的替換行為。故MDA濃度的升高引起更多聚集狀態(tài)的7S組分參與界面組成，使得界面黏彈性增加，進而阻礙膽鹽的替換行為，降低脂質(zhì)的初始消化速率。

圖6 MDA氧化蛋白對乳液初始消化速率的影響Fig. 6 Effect of MDA-induced protein oxidation on the initial digestion rate of emulsion

綜上結(jié)果表明，MDA氧化蛋白會改變蛋白的結(jié)構(gòu)，進而改變?nèi)橐航缑娴鞍捉Y(jié)構(gòu)及組分，氧化誘導的蛋白交聯(lián)/聚集可延緩或降低膽鹽在界面的替代，進而減緩乳液消化并降低乳液脂質(zhì)釋放率。

2.4.2 乳液消化穩(wěn)定性

圖7 MDA氧化蛋白對乳液消化穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of MDA-induced protein oxidation on the digestion stability of emulsion

由圖7可知，與未消化樣品相比（圖2A），經(jīng)體外胃消化后，乳液的粒徑基本不變（圖7a）。Bellesi等[32]研究發(fā)現(xiàn)，SPI在油水界面不易被胃蛋白酶水解，并且在模擬胃消化結(jié)束后乳液界面結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。經(jīng)小腸消化后，乳液的粒徑分布逐漸呈多峰分散狀態(tài)（圖7b）。乳液的消化主要在小腸中進行，此階段發(fā)生的一系列復雜的變化，比如膽鹽吸附到界面、膽鹽和界面膜的相互作用、胰脂酶的吸附和脂質(zhì)水解、界面電勢的改變、消化產(chǎn)物的積累等，導致乳液狀態(tài)產(chǎn)生較大變化[32]。粒徑分布隨著MDA濃度的提高不斷右移，平均粒徑不斷增加，表明油滴在消化過程發(fā)生了一定程度的聚結(jié)?？赡苁怯捎谙^程油滴的聚結(jié)導致比表面積變小，使得與脂肪酶接觸的表面積變小，進而一定程度上降低了乳液脂質(zhì)釋放率。

3 結(jié) 論

SPI在MDA的作用下會發(fā)生氧化交聯(lián)/聚集，且隨MDA濃度的提高，蛋白氧化程度加深。其中蛋白11S組分主要形成由二硫鍵主導的共聚物。7S組分同時形成由二硫鍵和非二硫鍵誘導的共聚物。

不同濃度MDA氧化處理SPI對乳液的粒徑分布和界面蛋白含量影響不大，但對界面蛋白的組成影響較大，其中經(jīng)高濃度MDA氧化后，更多7S組分以聚集狀態(tài)參與了界面蛋白組成，使得界面層黏彈性和剛性增強，阻止脂肪酶與油脂的接觸，并降低或延緩了膽鹽替代界面蛋白的程度，進而降低了乳液的消化程度和起始消化速率。

因此，大豆蛋白經(jīng)過脂質(zhì)次級氧化產(chǎn)物的氧化作用，結(jié)構(gòu)發(fā)生交聯(lián)聚集，使得乳液結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生改變，并使乳液具備了抗消化的特性。