李 俊 盧 揚 趙 剛 向達(dá)兵 陳中愛 劉 輝

(1.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，貴州 貴陽 550006；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106)

苦蕎被譽為藥食同源植物，除了蛋白質(zhì)、維生素等基本營養(yǎng)元素外，還富含蘆丁、槲皮素等黃酮類物質(zhì)，營養(yǎng)素含量豐富，比例均衡[1]。研究[2]表明，黃酮類物質(zhì)具有較高的食用和藥用價值，具有抗菌消炎等作用，長期食用還能增強人體免疫力。因此，苦蕎已經(jīng)成為食品加工的一個熱點，已經(jīng)開發(fā)出苦蕎醋、苦蕎茶、苦蕎酸奶等各種特色保健食品。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)后的苦蕎籽粒，黃酮類物質(zhì)的含量會顯著提高，其中蘆丁含量會增加4～6倍。但現(xiàn)階段國內(nèi)外對苦蕎產(chǎn)品的開發(fā)主要集中于苦蕎籽粒，對苦蕎萌發(fā)后的芽苗研究還較少。

乳酸菌具有協(xié)調(diào)人體腸道菌群的比例、降低膽固醇、增強免疫力等一系列功效[4]。通過乳酸菌發(fā)酵不僅能賦予制品新的保健功能，而且還可使制品產(chǎn)生特有的風(fēng)味。Cho等[5]開發(fā)出的乳酸菌發(fā)酵飲料蛋白含量高，脂肪含量低，活菌數(shù)高，抗氧化及抗菌活性顯著增強，感官性狀良好。王振斌等[6]采用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵葛根汁，發(fā)酵6 d葛根汁總黃酮含量提高了17.72%，γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度增加了279.17%，必需氨基酸總量增加了65.58%，乳酸濃度增加，產(chǎn)品中風(fēng)味物質(zhì)的含量比葛根汁有所提高。但現(xiàn)階段關(guān)于乳酸菌發(fā)酵對苦蕎制品中營養(yǎng)及風(fēng)味物質(zhì)的研究尚未見報道。

本研究以苦蕎芽苗及苦蕎茶湯為原料，采用植物乳桿菌發(fā)酵，利用液相色譜、氨基酸分析儀及氣質(zhì)聯(lián)用等檢測方法對發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料的蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、總黃酮、氨基酸、揮發(fā)性化合物、DPPH和ABTS自由基清除率進(jìn)行分析，探究發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料營養(yǎng)、風(fēng)味及抗氧化活性的變化，為苦蕎飲料的研制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎籽粒：貴米苦18號，貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心，溫度25 ℃、濕度80%條件下萌發(fā)8～10 d左右可得萌發(fā)苦蕎芽苗；

苦蕎茶：貴州省威寧縣東方神谷有限責(zé)任公司；

植物乳桿菌(GIM1.380)：廣東省微生物菌種保藏中心；

蘆丁、槲皮素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

果葡糖漿：食品級，加福得食品(北京)有限公司；

甲醇：液相色譜級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸、鹽酸、苯酚、檸檬酸鈉、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、過硫酸鉀：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：1260型，配紫外檢測器，色譜柱為Shiseido C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，美國Agilent公司；

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：HP6890/5975C型，色譜柱為FB-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，美國Agilent公司；

氨基酸分析儀：S433D型，德國Sykam公司；

均質(zhì)機：BRS-200型，安徽博進(jìn)化工機械有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦蕎芽苗茶飲料制備 參照文獻(xiàn)[7]。苦蕎茶湯與苦蕎芽苗按照4∶1(質(zhì)量比)的比例混勻后打漿，用4層紗布過濾雜質(zhì)后，4 000 r/min離心5 min，按照1∶10(體積比)的比例加入純凈水進(jìn)行稀釋，加入穩(wěn)定劑，均質(zhì)(25 MPa，60 ℃)后在121 ℃條件下滅菌5 min，按0.6%的菌劑添加量接種植物乳桿菌(液體MRS培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h)，37 ℃發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法[8]。制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y= 0.318 6X+0.002，R2= 0.999 1。樣品平行測定3次取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)的總黃酮含量(μg/mL)。

1.3.3 不同黃酮物質(zhì)含量測定 采用高效液相色譜法。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，修改如下：制成每100 mL分別含蘆丁100 mg，山奈酚-3-O-蕓香糖苷50 mg，槲皮素20 mg的混合溶液，作為混合對照品溶液。取5.0 mL飲料，加入75%乙醇50 mL，超聲30 min，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，過濾，即得供試品溶液。色譜條件：流動相：甲醇(A)∶0.1%磷酸溶液(B)=55∶45(體積比)；波長355 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.4 氨基酸測定 參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》的方法，水解后直接用氨基酸分析儀對苦蕎芽苗飲料中的氨基酸進(jìn)行分析。

1.3.5 揮發(fā)性成分測定 取樣品8 mL，置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中，放置磁力攪拌器上(轉(zhuǎn)速120 r/min)，插入裝有2 cm×50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進(jìn)樣器，在60 ℃水浴中頂空萃取45 min，快速移出萃取頭并插入色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)，熱解析5 min進(jìn)樣。色譜條件參照文獻(xiàn)[10]，對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist2014和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定揮發(fā)性化學(xué)成分。

1.3.6 DPPH自由基清除的測定 參照Yang等[11]的方法并稍作改動，將發(fā)酵前后飲料稀釋成不同濃度，分別置于10 mL試管中，加入3 mL DPPH溶液并振搖10 s，室溫靜置，避光反應(yīng)30 min。在波長517 nm處測其吸光值，以不加樣品的DPPH溶液作為空白對照。

1.3.7 ABTS自由基清除率測定 參照Guo等[12]的方法并稍作改動，將發(fā)酵前后飲料稀釋成不同濃度，分別置于10 mL試管中，加入3 mL ABTS工作液并振搖10 s，室溫靜置，避光反應(yīng)6 min。在波長734 nm處測其吸光值，以不加樣品液的ABTS工作液為空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin(Version 8.6)進(jìn)行作圖，采用SPSS(Version 17.0)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，P<0.01認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料中黃酮含量變化

發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料中黃酮含量變化見圖1。由圖1可知，發(fā)酵后蘆丁含量基本保持不變，但槲皮素和山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量有稍許降低，總黃酮含量也從(120.6±1.9)μg/mL降至(114.6±1.7)μg/mL。這些結(jié)果與Shyu等[13]關(guān)于柑橘果皮中黃酮類物質(zhì)的報道一致，柑橘果皮中黃酮類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后也有不同程度的降低。可能是，一部分黃酮被消耗或是經(jīng)修飾轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，Chen等[14]報道了發(fā)酵對黃岑莖葉提取物中黃酮類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)L.brevisRO1菌株能夠有效地提升黃酮類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化率。但關(guān)于苦蕎芽苗茶飲料中黃酮類物質(zhì)降低的原因還有待進(jìn)一步研究。

字母不同代表發(fā)酵前后測定結(jié)果差異顯著(P<0.05)圖1 發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料中黃酮含量對比Figure 1 Comparison of flavonoids content intea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

2.2 發(fā)酵前后苦蕎芽苗飲料中氨基酸含量變化

苦蕎芽苗茶飲料發(fā)酵前后氨基酸含量見表1?？嗍w芽苗茶飲料中包含6種必需氨基酸(EAA)和11種非必需氨基酸(NEAA)，但經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后蘇氨酸并未檢出。發(fā)酵前NEAA和總氨基酸(TAA)含量顯著高于發(fā)酵后 (P<0.05)，可能是氨基酸作為乳酸菌發(fā)酵的氮源物質(zhì)被吸收利用，導(dǎo)致發(fā)酵后氨基酸含量降低；同時發(fā)酵過程會產(chǎn)生一定的風(fēng)味，如蘇氨酸、纈氨酸等會通過微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生特征性風(fēng)味物質(zhì)乙醛[6]。發(fā)酵后EAA/TAA的比例為38.32%，EAA/NEAA為62.13%，而發(fā)酵前EAA/TAA和EAA/NEAA分別為26.89%和36.80%，發(fā)酵后EAA/TAA和EAA/NEAA比例顯著高于發(fā)酵前。FAO/WHO[15]提出的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為：人體EAA/TAA在40%左右，EAA/NEAA在60%左右。從這一角度分析，發(fā)酵有利于苦蕎芽苗茶飲料中蛋白質(zhì)性能的提高。

根據(jù)FAO/WHO[15]模式制定的苦蕎芽苗飲料發(fā)酵前后氨基酸評分見表2。蘇氨酸在發(fā)酵前后苦蕎芽苗汁中評分最低，為第一限制性氨基酸[10]。氨基酸評分越接近1，說明該食品氨基酸比例越接近FAO/WHO推薦模式。苦蕎芽苗茶飲料發(fā)酵前后大部分氨基酸評分都低于l，表明其必需氨基酸構(gòu)成有一定的提升空間。

表1發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料中氨基酸含量對比?
Table 1Comparison of amino acid content in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

mg/kg

? a代表發(fā)酵前后同一種氨基酸測定結(jié)果對比顯著 (P<0.05)，未標(biāo)注代表結(jié)果不顯著。

2.3 發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料中揮發(fā)性風(fēng)味成分變化

通過對發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料中各揮發(fā)性成分提取、分離、鑒定，求得其相對含量，結(jié)果如表3、4所示。共分離鑒定出8類54種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醛類(7種)，醇類(14種)，酮類(9種)，酯類(11種)，酸類(4種)，烯類(2種)，烷類(1種)，雜環(huán)類(3種)。王灼琛等[16]對苦蕎粉、苦蕎殼、苦蕎麩皮揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，苦蕎粉含有揮發(fā)性化合物成分44種，苦蕎殼含有46種揮發(fā)性物質(zhì)，苦蕎麩皮含有20種揮發(fā)性物質(zhì)。余麗等[17]從苦蕎中分析出了35種揮發(fā)性成分，包括酯類、烴類、酮類、醛類和醇類，以酯類和醛類為主。本試驗檢測出發(fā)酵前苦蕎芽苗茶飲料中含有46種揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)酵后含有43種揮發(fā)性物質(zhì)。

表2 苦蕎芽苗茶飲料發(fā)酵前后氨基酸評分對比?Table 2 Comparison of amino acid score in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

? 氨基酸評分表示1 g待測蛋白中該氨基酸占1 g標(biāo)準(zhǔn)蛋白中該種氨基酸的比值。

表4苦蕎芽苗茶飲料發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)分析匯總
Table 4Analysis and summary of volatile components in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

從表3可以看出，發(fā)酵前所有風(fēng)味物質(zhì)中2-乙酸庚酯含量最高，達(dá)到22.569%，發(fā)酵后所有風(fēng)味物質(zhì)中2-乙酸壬酯含量最高，達(dá)到39.986%，可能來源于飲料中添加的穩(wěn)定劑(黃原膠、羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉)，且發(fā)酵過程中發(fā)生了一定的化學(xué)變化。

從表4可以看出，發(fā)酵后酯類、酸類、烯類、烷類和雜環(huán)類物質(zhì)均有不同程度升高，而醛類、醇類、酮類物質(zhì)明顯降低。酯類化合物相對含量從39.331%升高到58.687%，它是發(fā)酵飲料中一種很重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，具有特殊的水果味和花香味，同時酯類物質(zhì)的閾值一般較低，對整個體系風(fēng)味的貢獻(xiàn)很大[18]。發(fā)酵前醇類物質(zhì)為主要揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)酵后醇類物質(zhì)含量從39.680%降低至29.933%，醇類一般具有芳香、花香或水果香，可以結(jié)合有機酸形成酯類物質(zhì)，改善發(fā)酵后產(chǎn)品的風(fēng)味。發(fā)酵后乙醇和2-壬醇含量顯著升高，而乙醇具有醇香味，對發(fā)酵后產(chǎn)品風(fēng)味影響較大。醇類物質(zhì)雖然含量較高，但閾值也較高，對發(fā)酵后飲料的香氣起到柔和作用[19]。發(fā)酵后酸類物質(zhì)含量從0.196%升高到3.045%，主要的風(fēng)味物質(zhì)是乙酸，是因為乳酸菌代謝會產(chǎn)生辛酸、癸酸等有機酸，有機酸能使飲料口感清爽并帶有新鮮的水果香，提升產(chǎn)品的滋味和口感。烷烴閾值較高，對風(fēng)味的影響不大。而揮發(fā)性烯烴具有良好的香氣，其中檸檬烯具有類似于檸檬的特異香味[20]。因此，通過發(fā)酵，苦蕎芽苗茶飲料中閾值較低的芳香性風(fēng)味物質(zhì)含量明顯提升，對飲料的風(fēng)味具有有益的影響。

2.4 發(fā)酵對苦蕎芽苗茶飲料抗氧化活性的影響

通過DPPH和ABTS自由基清除率兩種測定方法對比發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料的抗氧化活性，結(jié)果如圖2所示。飲料發(fā)酵后DPPH自由基清除率從(68.32±0.73)%升高至(72.19±0.52)%，ABTS自由基清除率從(61.25±0.49)%升高至(63.18±0.65)%，均有一定提升。賈紅玲[21]報道了乳酸菌發(fā)酵對全稻芽抗氧化性能的影響，DPPH和ABTS自由基清除率都有顯著提升。梁斐等[22]報道葎草經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，其總黃酮DPPH自由基清除率顯著高于對照組和自然發(fā)酵，對ABTS自由基的清除率顯著高于自然發(fā)酵組。乳酸菌發(fā)酵能夠提高DPPH和ABTS自由基清除率，可能有以下3種原因：① 發(fā)酵過程中苦蕎芽苗茶飲料因微生物的代謝活動自身活性物質(zhì)發(fā)生改變，同時代謝出新的活性物質(zhì)；② 發(fā)酵可能造成苦蕎芽苗茶飲料中黃酮種類和結(jié)構(gòu)改變，不同種類和結(jié)構(gòu)的黃酮對DPPH和ABTS自由基清除率差異較大，增加了其抗氧化活性；③ 乳酸菌活菌的存在對其抗氧化活性也有所提高。因此，乳酸菌發(fā)酵可以提高苦蕎芽苗茶飲料的抗氧化活性。

字母不同代表發(fā)酵前后測定結(jié)果差異顯著(P<0.05)圖2 苦蕎芽苗茶飲料發(fā)酵前后抗氧化活性對比Figure 2 Comparison of antioxidant activity in tea beverage of tartary buckwheat sprout before and after fermentation

3 結(jié)論

對發(fā)酵前后苦蕎芽苗茶飲料中營養(yǎng)、風(fēng)味及抗氧化活性的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。試驗結(jié)果顯示，發(fā)酵后蘆丁含量基本保持不變，總黃酮含量稍微降低，EAA/TAA達(dá)到38.32%，EAA/NEAA達(dá)到62.13%，顯著高于發(fā)酵前，蛋白質(zhì)更為均衡，但必需氨基酸評分不高。分離鑒定出8類54種揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)酵后閾值較低的芳香性風(fēng)味物質(zhì)含量明顯提升，對飲料的風(fēng)味具有有益的影響。發(fā)酵后DPPH自由基清除率從(68.32±0.73)%升高至(72.19±0.52)%，ABTS清除率從(61.25±0.49)%升高至(63.18±0.65)%，乳酸菌發(fā)酵可以提高苦蕎芽苗茶飲料的抗氧化活性?？傮w來說，乳酸菌發(fā)酵可以提高苦蕎芽苗茶飲料的營養(yǎng)價值，具有一定的應(yīng)用前景，但發(fā)酵過程會破壞其中的一些有益成分，下一步需要更深層次的研究其作用機理，全面提升產(chǎn)品品質(zhì)。