趙鵬成 易軍鵬 李 欣 楊亞皇 賀 健

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南科技大學(xué)化工與制藥學(xué)院，河南 洛陽 471023)

花生(Arachishypogaea)亦名落花生，來源于豆科一年生草本油料植物，是人類重要的食用植物油資源[1]。中國是花生生產(chǎn)大國之一，2017年產(chǎn)量已達(dá)1 709.23萬t，花生殼按30%計(jì)算，其產(chǎn)量約500萬t[2-3]。花生殼黃酮組分的主要物質(zhì)為木犀草素[4]，從黃酮類物質(zhì)中分離得到的木犀草素在臨床上具有止咳、祛痰及消炎的作用[5-6]，在體內(nèi)具有抗菌、抗病毒、抗癌以及降低血脂等作用[7-10]。因此以木犀草素為代表的花生殼中黃酮類化合物也受到空前的重視。

目前，黃酮的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲輔助提取技術(shù)、微波輔助法和酶輔助提取法[11-14]。傳統(tǒng)的提取方法存在得率較低的問題，微波輔助法和超聲波輔助法能耗和成本較高，酶輔助提取法操作繁瑣，不適于工業(yè)生產(chǎn)。蒸汽爆破(Steam Explosion Pre-treatment，SEP)常用于處理中草藥和動(dòng)物飼料等[15-16]。木質(zhì)原料在高溫、高壓蒸汽作用下，纖維素聚合度下降，半纖維素部分降解，木質(zhì)素軟化，橫向連結(jié)強(qiáng)度下降。當(dāng)充滿壓力蒸汽的物料瞬時(shí)(0.087 5 s)泄壓，孔隙中的水氣劇烈膨脹，產(chǎn)生“爆破”效果，可部分剝離木質(zhì)素，并將原料撕裂為細(xì)小纖維，原料中的細(xì)胞壁和表層纖維被不同程度的打破，使目標(biāo)成分從細(xì)胞內(nèi)部溶出進(jìn)入提取介質(zhì)中。研究[17-19]表明，蒸汽爆破技術(shù)可以使原料提取率明顯提高，該預(yù)處理技術(shù)已廣泛應(yīng)用于油脂、糧食和中草藥等行業(yè)。

本研究擬以花生殼為原料，以蒸汽爆破壓力、維壓時(shí)間、含水率等因素對(duì)木犀草素得率影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化蒸汽爆破預(yù)處理的最優(yōu)工藝，并利用大孔吸附樹脂對(duì)木犀草素粗品進(jìn)行純化，通過紫外分光光度法和紅外圖譜對(duì)純化后的木犀草素進(jìn)行定量定性分析，為今后對(duì)花生殼木犀草素的更深入研究以及花生殼資源綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶殼花生：魯花11號(hào)，產(chǎn)地河南洛陽；

大孔吸附樹脂：AB-8型，東鴻化工有限公司；

木犀草素標(biāo)品：96%，上海源葉生物科技有限公司；

無水乙醇、石油醚、鹽酸、氫氧化鈉、溴化鉀等：分析純，天津德恩化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

間歇式蒸汽爆破機(jī)：QBS-80型，鶴壁正道生物能源有限公司；

冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

分析天平：FA-1005型，上海儀器有限公司；

PH計(jì)：PHS-3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

電子掃描顯微鏡：JSM-5610LV型，日本電子株式會(huì)社；

紫外可分光光度計(jì)：UV-4800型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

氣浴恒溫振蕩器：ZD-85型，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；

傅里葉紅外變換光譜儀：TENSPOR27型，德國BRUKER儀器公司；

高效液相色譜儀：E2695型，美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 花生殼蒸汽爆破預(yù)處理 將花生殼清洗干凈，置于45 ℃烘箱內(nèi)干燥24 h，將干燥的花生殼用等梯度比例的去離子浸泡12 h，放入QBS-80型蒸汽爆破機(jī)物料倉中，通入飽和蒸汽，選取不同梯度維壓時(shí)間和蒸汽爆破壓力，在微秒內(nèi)(0.087 5 s)完成釋壓，預(yù)處理后的花生殼置于45 ℃干燥箱內(nèi)干燥至恒重，裝密封袋后避光保存。

1.3.2 蒸汽爆破預(yù)處理工藝優(yōu)化

(1)單因素試驗(yàn)：根據(jù)文獻(xiàn)[20]可知，蒸汽爆破預(yù)處理對(duì)活性物質(zhì)提取的主要影響因素為爆破壓強(qiáng)、維壓時(shí)間和含水率。因此本試驗(yàn)對(duì)以上3個(gè)工藝參數(shù)分別設(shè)計(jì)5個(gè)梯度，通過控制變量法進(jìn)行試驗(yàn)。即爆破壓強(qiáng)因素選取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 MPa；維壓時(shí)間因素選取15，30，45，60，75 s；含水率因素選取5%，10%，15%，20%，25%。固定參數(shù)為爆破壓強(qiáng)1.2 MPa，含水率15%，維壓時(shí)間45 s，比較不同爆破條件對(duì)木犀草素提取率的影響。

(2)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)：通過單因素試驗(yàn)，確定預(yù)原料含水率、蒸汽爆破壓力和維壓時(shí)間3個(gè)獨(dú)立變量，以木犀草素提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，對(duì)花生殼汽蒸汽爆破參數(shù)采用三因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立數(shù)學(xué)模型，并對(duì)各因素間的相互作用，以及各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系進(jìn)行分析。單次試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.3.3 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，吸取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分別加70%乙醇定容至10 mL，混勻，利用紫外分光光度計(jì)測定352 nm處吸光度[21-23]。以吸光度值為縱坐標(biāo)，木犀草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.165 8x+0.018 6(R2=0.999 8)。

1.3.4 花生殼木犀草素提取工藝 將未處理及蒸汽爆破預(yù)處理后的花生殼粉碎過60目篩。稱量花生殼粉末3 g，加入10倍體積的石油醚萃取脫脂3次。向脫脂后的花生殼粉末按1∶15(g/mL)加入70%乙醇，70 ℃回流提取1 h，抽濾得濾液[24]。殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取1次，合并兩次濾液作為提取液，取1/5提取液用70%乙醇稀釋30倍并測定其吸光度，結(jié)合木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式(1)進(jìn)行木犀草素提取率測定。

(1)

式中：

S——木犀草素提取率，%；

c——木犀草素提取液濃度，mg/mL；

v——提取液體積，mL；

D——稀釋倍數(shù)；

m——花生殼粉末樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 木犀草素的純化 按1.3.3制備木犀草素提取液，置于50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，旋蒸至水浸膏，加入10倍量的去離子水進(jìn)行洗滌，8 000 r/min離心取沉淀，并重復(fù)洗滌沉淀兩次。加入無水乙醇溶解沉淀物，離心取上清液，旋蒸至近干，加入70%乙醇30 mL進(jìn)行洗滌，重復(fù)洗滌兩次，合并兩次洗滌液調(diào)整成pH為6的靜態(tài)吸附樣品液待用。

AB-8大孔吸附樹脂經(jīng)無水乙醇、酸、堿預(yù)處理后，洗滌至中性[23]。稱取預(yù)處理好的AB-8濕樹脂20 g，裝入100 mL具塞錐形瓶中，加入60 mL樣品液，密封后放入搖床中25 ℃，150 r/min振搖6 h，取出靜置24 h，過濾取充分吸附后的樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸。將吸附后的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，用70%乙醇進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，流速2.0 BV/h，洗脫液總量200 mL。利用紫外分光光度計(jì)對(duì)洗脫液進(jìn)行木犀草素含量測定。取1/2洗脫液置于50 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，旋蒸至水浸膏，去離子水洗出并定容至20 mL，真空冷凍干燥成粉末，得木犀草素純化樣品，準(zhǔn)確稱量樣品重量并計(jì)算木犀草素純度。剩余1/2洗脫液進(jìn)行高效液相色譜定性分析。

1.3.6 花生殼微觀結(jié)構(gòu)觀察 將干燥至恒重的花生殼樣品用導(dǎo)電膠帶粘到樣品臺(tái)上，用掃描電子顯微鏡分別觀察不同汽爆參數(shù)預(yù)處理和未經(jīng)汽爆預(yù)處理的花生殼微觀結(jié)構(gòu)的變化。

1.3.7 木犀草素紅外光譜分析 對(duì)木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品、未處理的木犀草素樣品和汽爆處理的木犀草素樣品采用溴化鉀壓片法制樣。將溴化鉀粉末在紅外干燥箱內(nèi)干燥，取2 mg木犀草素樣品與40 mg左右的溴化鉀粉末在研缽中充分研磨，使用壓片機(jī)制成薄片后在4 000～400 cm-1波長范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，用不加樣品的溴化鉀薄片進(jìn)行背景掃描。

1.3.8 花生殼木犀草素高效液相色譜分析 同時(shí)對(duì)純化后樣品進(jìn)行高效液相檢測，色譜條件為：Diamonsil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-0.5%磷酸(70∶30，體積比)作為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長352 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上所有試驗(yàn)重復(fù)3次，采用DPS 9.50數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 物料含水率對(duì)花生殼木犀草素得率的影響 由圖1 可知，控制維壓時(shí)間及蒸汽爆破壓強(qiáng)相同的條件下，木犀草素得率隨物料含水率提高先增加后降低，在含水率為15%條件下木犀草素得率達(dá)到最高。由于適當(dāng)?shù)乃帜軌蚴刮锪铣浞秩苊?，提高蒸汽滲透效率，進(jìn)而增強(qiáng)蒸汽爆破效果，提高木犀草素得率。當(dāng)物料水分過飽和，多余的水分占據(jù)物料內(nèi)部間隙，阻礙蒸汽滲透，降低蒸汽爆破效果[25]。

2.1.2 爆破壓強(qiáng)及維壓時(shí)間對(duì)花生殼木犀草素得率的影響 由圖2、3可知，隨著蒸汽爆破壓力的升高和維壓時(shí)間的延長，花生殼木犀草素得率均呈先增加后減少趨勢(shì)，在蒸汽爆破壓強(qiáng)1.2 MPa及維壓時(shí)間45 s條件下木犀草素得率達(dá)到最高。這是由于黃酮成分大部分被包裹在細(xì)胞壁中[26]，隨著爆破強(qiáng)度的增強(qiáng)，有效地打破花生殼內(nèi)部細(xì)胞壁的阻礙作用，促進(jìn)其中的黃酮類物質(zhì)提取率增加[27]。但當(dāng)爆破壓力和維壓時(shí)間繼續(xù)增大和延長時(shí)，木犀草素提取率反而出現(xiàn)降低，與張琪等[28]蒸汽爆破預(yù)處理對(duì)粉葛總黃酮及抗氧化性的影響結(jié)果一致。由于在高溫高壓條件下可能會(huì)促使花生殼中活性成分發(fā)生化學(xué)變化，導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)發(fā)生降解，另外細(xì)胞內(nèi)部溶出的黃酮類物質(zhì)又重新聚合形成不溶性物質(zhì)[29]，最終致使木犀草素提取率隨壓強(qiáng)和時(shí)間的變化先增后減。因此適當(dāng)?shù)谋茐毫途S壓時(shí)間可以對(duì)木犀草素得率起到促進(jìn)作用。

圖1 含水率對(duì)木犀草素得率的影響
Figure 1 Effect of water content on the extraction yields of luteolin from peanut shell

圖2 爆破壓強(qiáng)對(duì)木犀草素得率的影響Figure 2 Effect of steam explosion pressure on the extraction yields of luteolin from peanut shell

圖3 維壓時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響Figure 3 Effects of residence time on the extraction yields of luteolin from peanut shell

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過響應(yīng)面分析法對(duì)花生殼蒸汽爆破技術(shù)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素和水平見表1，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

采用Design Expert分析軟件進(jìn)行回歸擬合分析，分析得到多元二次回歸模型方程：

(2)

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平表Table 1 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with independent variables and response values

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance (ANOVA)for the regression model

2.2.2 試驗(yàn)因素間的相互作用 為更直觀說明交互影響作用，對(duì)交互項(xiàng)作響應(yīng)面圖和等高線圖。其中含水率和蒸汽爆破壓力的交互項(xiàng)呈現(xiàn)出典型的橢圓形(見圖4)，說明兩因素交互作用顯著。

圖4 含水率和爆破壓強(qiáng)對(duì)花生殼木犀草素得率的交互影響Figure 4 Interaction effects of water content and blasting pressure on yield of luteolin from peanut shell

2.2.3 最佳工藝參數(shù)優(yōu)化 根據(jù)DPS 9.50軟件預(yù)測，得到蒸汽爆破工藝的最佳參數(shù)組合為蒸汽爆破壓力1.24 MPa，維壓時(shí)間 46.27 s，預(yù)浸泡含水率15.89%，在相同提取條件下，木犀草素得率為0.928%?？紤]到現(xiàn)實(shí)操作性，蒸汽爆破工藝參數(shù)校正為蒸汽爆破壓力1.25 MPa，維壓時(shí)間46 s，預(yù)浸泡含水率16%，在此條件下木犀草素得率為0.926%，實(shí)際提取率與理論值接近，差異不顯著。未經(jīng)爆破處理的花生殼在相同提取條件下木犀草素得率僅為0.472%。本試驗(yàn)經(jīng)過蒸汽爆破處理后的樣品，在相同提取條件下最終提取量高出未經(jīng)爆破處理的樣品近1倍。說明該模型的擬合程度較好，校正后的蒸汽爆破參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定實(shí)用價(jià)值。

2.3 蒸汽爆破對(duì)花生殼的微觀結(jié)構(gòu)影響

圖5對(duì)比了未經(jīng)汽爆處理和在蒸汽爆破壓力1.25 MPa，維壓時(shí)間46 s，預(yù)浸泡含水率16%的條件下處理的花生殼的掃描電鏡圖。未經(jīng)汽爆處理的花生殼雖然表面也有許多溝塹和坑壑，未經(jīng)處理的花生殼表面是由長纖維形成的規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并覆蓋著均一光滑的片狀結(jié)構(gòu)。而經(jīng)汽爆處理后，蒸汽爆破花生殼的表皮層受到破壞，出現(xiàn)了很大程度的斷裂及較深的孔洞，網(wǎng)狀纖維消失，取而代之的是熔融態(tài)的片層狀結(jié)構(gòu)。片層表面的細(xì)長絲狀突起可能是由于汽爆造成花生殼木質(zhì)素和半纖維素的降解，從而使纖維素析出并附著在物料表面，呈細(xì)絲狀?；ㄉ鷼さ娜廴谧兓舱f明了在汽爆中發(fā)生了一些化學(xué)變化，可能是木犀草素提取率提高的原因。

圖5 未處理和蒸汽爆破處理花生殼的掃描電鏡圖Figure 5 Scanning electron micrographs of untreated peanut shell and steam-exploded peanut shell (×1 000)

2.4 紅外光譜分析

A.木犀草素標(biāo)品 B.爆破處理純化后樣品 C.未爆破處理純化后樣品
圖6 木犀草素標(biāo)品及純化后樣品紅外圖譜
Figure 6 FT-IR spectra of Luteolin standard and purified samples

2.4 高效液相色譜分析

木犀草素標(biāo)品的出峰時(shí)間為4.7 min，兩個(gè)提取純化樣品中均含有木犀草素。由圖7可知，本研究提取純化得到的木犀草素仍含有部分雜質(zhì)，與紅外光譜分析一致。經(jīng)爆破處理后，純化樣品中的木犀草素含量顯著增加，與紫外分光光度法檢測的結(jié)果一致，測得木犀草素含量在純化后凍干品中達(dá)到32.81%。說明蒸汽爆破預(yù)處理，可以顯著提高木犀草素的提取率。

A.木犀草素標(biāo)品 B.爆破處理純化后樣品 C.未爆破處理純化后樣品
圖7 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品、未爆破處理純化后樣品和爆破處理純化后樣品HPLC圖
Figure 7 Luteolin standard,unexploded purified sample and exploded purified sample HPLC diagram

3 結(jié)論

將花生殼進(jìn)行蒸汽爆破預(yù)處理，花生殼木犀草素得率顯著提高。經(jīng)響應(yīng)面分析以及回歸模型預(yù)測，蒸汽爆破預(yù)處理的最佳條件為蒸汽爆破壓強(qiáng)1.25 MPa，維壓時(shí)間46.0 s，含水率16%。在該條件下，木犀草素提取率為0.926%，約為未處理的2倍。蒸汽爆破預(yù)處理后的花生殼木質(zhì)素、纖維素發(fā)生斷裂和降解，表面結(jié)構(gòu)變得松弛有空隙，溶劑滲透加快，促使木犀草素提取率增加。通過分析紅外光譜圖和HPLC圖譜得出，蒸汽爆破純化后樣品中主要物質(zhì)為木犀草素，其含量在純化后凍干品中達(dá)到32.81%，遠(yuǎn)高于未蒸汽爆破處理樣品。因此，蒸汽爆破預(yù)處理能夠明顯增加花生殼提取物中木犀草素的提取率。本研究發(fā)現(xiàn)蒸汽爆破技術(shù)使花生殼中木犀草素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的改變，但具體改變的方向和影響值得進(jìn)一步探討。