劉 迪 韓 莉 黃 坤 王 亨 余婷婷 王會霞

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430075)

“瘦肉精”是一種特定的可用來減少被飼養(yǎng)類動物的脂肪、增加其瘦肉比例的藥物的俗稱。傳統(tǒng)型瘦肉精一般是指β-受體激動劑，是一類人工合成的苯乙醇胺類物質(zhì)，包括克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、異丙喘寧、氯丙那林、西馬特羅、非諾特羅等。該類藥物在動物性食品中的殘留會對消費者身體造成不同程度的影響，對于易感人群危害更為嚴(yán)重[1-2]。而被視為新型“瘦肉精”的喹乙醇并不屬于瘦肉精類藥物，它不具備傳統(tǒng)瘦肉精藥物的生物學(xué)和化學(xué)特點，化學(xué)結(jié)構(gòu)也相差甚遠(yuǎn)，所造成的食品安全危害也不盡相同。喹乙醇為代表的抗生素，是一種化學(xué)合成的生長促進(jìn)劑，可促進(jìn)機體蛋白質(zhì)合成代謝，提高飼料能量利用率，增加畜禽養(yǎng)殖效率，減少養(yǎng)殖過程中疾病發(fā)生幾率[3]，因此可加快畜禽生長發(fā)育，提高個體瘦肉率。喹乙醇具有中度至明顯的蓄積毒性，對大多數(shù)動物有明顯的致畸作用，對人體也存在致畸形、致突變、致癌性[4]。喹乙醇本身不穩(wěn)定，在動物體內(nèi)可快速代謝，代謝產(chǎn)物中3-甲基-喹喔啉-2-羧酸(methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid，MQCA)為喹乙醇的主要代謝產(chǎn)物，在動物體內(nèi)滯留時間長，且含量與殘留關(guān)系穩(wěn)定，能反映喹乙醇的殘留情況，被確定為殘留標(biāo)志物[5]。

2002年，β-受體激動劑被列入《食用動物禁用獸藥及其他化合物清單》[6]，對于喹乙醇中國禁用于禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖，僅允許用作育成豬(體重<35 kg)的飼料添加劑[7]；而歐盟早在1998年就已禁止喹乙醇作為飼料添加劑[8]。現(xiàn)階段，對β-受體激動劑和喹乙醇及其代謝物的檢測方法較多。劉佳等[9]建立了一種豬肝中26種β2-受體激動劑藥物殘留的反相液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，26種β2-受體激動劑在 5，10，20 μg/L添加水平的回收率為 64.0%～112.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<15.2%，方法檢出限為0.15～1.35 μg/kg；金玉娥等[10]也采用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定了豬肉和豬肝中11種β2-受體激動劑，采用內(nèi)標(biāo)法定量，可以滿足食品安全法規(guī)的需要；Zhang等[11]、薛良辰等[12]、歐陽珊等[13]、Bodi等[14]、Merou等[15]、Sniegocki等[16]分別用液相—質(zhì)譜/質(zhì)譜測定了喹乙醇及其代謝物的含量，都取得了比較理想的結(jié)果。但上述研究的前處理過程都比較復(fù)雜，一般包括酶解、提取、固相萃取的過程，比較費時費力。生物樣品基質(zhì)復(fù)雜，內(nèi)源性物質(zhì)會干擾檢測結(jié)果。液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法特異性強、靈敏度高，是現(xiàn)階段最主要的檢測技術(shù)手段，但是同時檢測β-受體激動劑和喹乙醇及其代謝物的高效液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測分析法未見報道。本試驗擬建立同時檢測豬肉中β-受體激動劑和喹乙醇及其代謝物的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，以期為快速檢測和監(jiān)管豬肉中瘦肉精殘留提供技術(shù)保障，為動物源食品中獸藥殘留高通量快速分析檢測提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

試驗所用樣品為市售豬肉，且所有的陰性樣品均通過國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定驗證。

標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)：喹乙醇(olaquindox，CAS號：23696-28-8)、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic，MQCA，CAS號:74003-63-7)、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸-D4(MQCA-D4)、喹噁啉-2-羧酸-D4(quinoxaline-2-carboxylic-D4，QCA-D4，CAS號:879-65-2)、異丙喘寧(Metaproterenol，CAS號：5874-97-5)、氯丙那林(Clorprenaline，CAS號：3811-25-4)、西馬特羅(Cimaterol，CAS號：54239-37-1)、特布他林(Terbutaline，CAS號：23031-25-6)、沙丁胺醇(Salbutamol，CAS號：18559-94-9)、萊克多巴胺(Ractopamine，CAS號：97825-25-7)、克倫特羅(Clenbuterol，CAS號：129138-58-5)、非諾特羅(Fenoterol，CAS號：13392-18-2)、沙丁胺醇-D3(Salbutamol-D3)、萊克多巴胺-D3(Ractopamine-D3)、克倫特羅-D9(Clenbuterol-D9)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸：色譜級，美國Thermo Fisher Scientific公司；

鹽酸、氫氧化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

試驗用水：電阻率≥18.2 MΩ·cm，Milli-Q制備超純水；

C18、HLB、MCX、MAX、中性氧化鋁固相萃取柱：美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：Acquity UPLC H-class型，美國Waters公司；

串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀：Xevo TQ-XS型，美國Waters公司；

電子天平：ME2002E、XS204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

翻轉(zhuǎn)式混勻器：Trayster型，德國IKA公司；

低溫冷凍離心機：Allegra X-15R型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

氮吹儀：N-EVAP24型，美國Organomation公司；

渦旋混合器：EOFO-945601型，美國亨利特里姆公司；

均質(zhì)器：T25型，德國IKA公司；

超聲波清洗儀：S90H型，德國Elma公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇分別溶解各種標(biāo)準(zhǔn)品，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液和1 mg/L的同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于-18 ℃冰箱中，保存期限為3個月。使用時根據(jù)需要配成不同質(zhì)量濃度的中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，同位素內(nèi)標(biāo)液同樣按照需要配制成中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作液臨用前用0.1%甲酸水溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液溶液配制為0.2～20.0 μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品的前處理

稱取5.00 g搗碎的豬肉，置于50 mL的聚丙烯離心管中；加入100 μL混合同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入10 mL含2%甲酸的乙腈溶液；勻漿提取1 min，超聲提取15 min，4 000 r/min離心5 min；取上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中。另取一離心管加入10 mL含2%甲酸的乙腈溶液，洗滌勻漿刀頭0.5 min；洗滌液移入前一離心管中，用玻璃棒搗碎殘渣，渦旋混勻器渦旋1 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min；合并上清液，用含2%甲酸的乙腈溶液定容至刻度，搖勻備用。

準(zhǔn)確移取5.0 mL樣品溶液至已活化的中性氧化鋁固相萃取柱上，用試管收集流出液；用5 mL含2%甲酸的乙腈溶液洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，于45 ℃ 下氮氣吹干，用1.0 mL含0.1%甲酸水溶液溶解殘渣，超聲振蕩1 min；加入3 mL正己烷溶液，渦旋2 min，4 000 r/min 離心5 min；取下層溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.5 UPLC條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0.0～1.0 min，A保持95%不變；1.0～2.5 min，95%～50% A；2.5～3.0 min，A保持50%不變；3.0～4.0 min，50%～5% A；4.0～5.0 min，A保持5%不變；5.0～5.1 min，5%～95% A；5.1～7.0 min，A保持95%不變；流速：0.25 mL/min。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI源)，掃描方式采用正離子模式，檢測方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓2.8 kV，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃，錐孔氣為高純氮氣，流量150 L/h；脫溶劑氣為高純氮氣，流量800 L/h，碰撞氣為高純氬氣。各物質(zhì)的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測條件如表1所示。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

根據(jù)這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，在正離子掃描模式下，用蠕動泵按照化合物的絕對響應(yīng)，以一定的速度對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行流動注射分析，對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化處理。通過一級質(zhì)譜全掃描模式分析確定分析物的分子離子，調(diào)試選擇最佳的毛細(xì)管電壓和錐孔電壓，找到[M+H]+豐度最高的作為母離子，接著對分析物母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，獲取碎片離子信息，優(yōu)化碰撞能量等相關(guān)參數(shù)；選擇信噪比最強和次強的兩個子離子分別作為定量和定性離子，同位素內(nèi)標(biāo)物質(zhì)只需要選擇信噪比最強的子離子。最終確定的質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測條件參數(shù)見表1。

表1 各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)?Table 1 Mass spectrometry parameters of each target compound

? *為定量離子。

2.2 色譜條件的確定

根據(jù)β-受體激動劑苯環(huán)上取代基的差異，可分為苯胺型和苯酚型。苯酚型β-受體激動劑極性較大；苯胺型β-受體激動劑、喹乙醇以及MQCA為中等極性極性。β-受體激動劑一般是弱堿性化合物，而喹乙醇及其化合物為酸性化合物。這些目標(biāo)化合物在C18柱上都有好的保留效果，堿性化合物在中等pH值流動相條件下的峰形容易出現(xiàn)拖尾。本研究對比了Waters ACQUITY UPLC HSS C18和Waters ACQUITY UPLC BEH C18分析目標(biāo)物時的效果，這兩支色譜柱的粒徑<2.0 μm。ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱采用三鍵鍵合C18配體和專有的端機封尾技術(shù)，可以改善堿性化合物的峰形，還能有效抑制酸性條件下鍵合相的水解。

前期預(yù)試驗結(jié)果表明：采用Waters ACQUITY UPLC HSS C18柱分析樣品時，各化合物的峰形更優(yōu)，并且各化合物之間的分離度更優(yōu)。因此，本研究選用Waters ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱。同時，在正離子模式下加入一定量的甲酸可以提高離子化效率和分離度，比較了甲醇、乙腈分別作為有機相與0.1%甲酸溶液組成流動相的效果。乙腈作為有機相時比甲醇作為有機相時各物質(zhì)的靈敏度略高，故選用乙腈—0.1%甲酸溶液作為流動相。在優(yōu)化的色譜條件下，各化合物的峰形尖銳，并且可以在7 min內(nèi)完成目標(biāo)物的分離和色譜柱的分離。各目標(biāo)化合物的選擇離子流色譜圖見圖1。

2.3 提取方式的選擇

β-受體激動劑和喹乙醇及其代謝物的提取方式，大多為水解后通過后續(xù)凈化再檢測。水解方式包括酶解[17-18]、酸解[19-20]、堿解[21-22]。酶解過程條件溫和，但需要16 h以上，耗時長且步驟繁瑣，而且不適合這兩類物質(zhì)的同時檢測；強堿水解效果好，可以有效水解蛋白質(zhì)，但是反應(yīng)通常較為劇烈，會造成有些化合物(如MQCA)的降解；酸水解反應(yīng)較堿水解溫和，但是提取后經(jīng)固相萃取柱凈化后，有些化合物的提取效率和回收率達(dá)不到要求。

為達(dá)到同時檢測這些物質(zhì)的要求，本研究擬采取有機相均質(zhì)提取的方式，物理性破壞細(xì)胞，可以大大縮短操作時間，簡化試驗步驟。一般選用的有機相有乙酸乙酯和乙腈，而喹乙醇及其代謝物必須在酸性環(huán)境下才能被提取出來，試驗對比了2%甲酸乙酸乙酯和2%甲酸乙腈的提取效果，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出：提取溶劑對沙丁胺醇-D3提取回收率影響最大，內(nèi)標(biāo)的回收率為絕對回收率，絕對回收率太低會影響方法的檢出限；對于QCA-D4和MQCA-D4而言，用2%甲酸乙腈的提取效率要略低于2%甲酸乙酸乙酯，可能是因為乙腈可以沉淀一部分蛋白質(zhì)，也會帶入一部分水溶性雜質(zhì)，會造成基質(zhì)減弱效應(yīng)，需要后續(xù)的凈化過程；對于其他化合物，兩種提取溶液對于相對回收率無太大影響。綜合考慮，本研究采用 2%甲酸乙腈作為提取劑以均質(zhì)方式提取，以盡量增大提取的絕對回收率。

2.4 凈化條件的優(yōu)化和內(nèi)標(biāo)物的選擇

動物樣品中一般含有大量的內(nèi)源性物質(zhì)，必須通過凈化減小基質(zhì)對檢測的干擾。一般凈化的方式有固相萃取法和液液萃取法。液液萃取法凈化效果較差，且耗費大量的試劑；而固相萃取法凈化效果好，試劑用量少。本研究采用固相萃取法凈化。

圖1 各目標(biāo)化合物的選擇離子流色譜圖Figure 1 Selected ion chromatogram of each target compound

圖2 不同提取溶液對提取效率的影響Figure 2 Effect of different extraction solutions on extraction efficiency

一般動物源性食品提取液凈化常用的固相萃取柱有：C18、MCX、MAX、HLB和中性氧化鋁。首先，對比了C18、MCX、MAX、HLB 4款柱子，提取液先用氮吹儀吹干后用水復(fù)溶，上樣、淋洗、洗脫，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，喹乙醇在C18固相萃取柱上絕對回收率很低；在HLB固相萃取柱上苯酚型β-受體激動劑的絕對回收率很低；而MCX 固相萃取柱僅對弱堿性的β-受體激動劑有保留；MAX固相萃取柱僅對酸性的喹噁啉類藥物有保留。這幾種柱子都可以較好地完成凈化過程，消除大部分基質(zhì)的影響，但是并不適用于所有的目標(biāo)化合物。

本研究選用了中性氧化鋁固相萃取柱，樣品提取液直接通過經(jīng)乙腈活化過的中性氧化鋁固相萃取柱，后用乙腈洗脫中性氧化鋁柱，收集全部流出液，吹干后0.1%甲酸水復(fù)溶。結(jié)果表明：基質(zhì)凈化的效果理想，各化合物的回收率均可達(dá)到要求。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加大乙腈洗脫量時，苯酚型β-受體激動劑的絕對回收率有明顯的提升，為確保目標(biāo)化合物收集完全，最終選用5 mL乙腈的洗脫量。

表2是經(jīng)中性氧化鋁小柱凈化前后各目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)對比，和各化合物的絕對回收率與相對回收率的對比。所有目標(biāo)化合物峰面積較凈化前都有較大程度變大。這表明動物樣品中待測物的檢測存在嚴(yán)重的基質(zhì)抑制效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為-45.2%～-86.2%；而凈化后基質(zhì)效應(yīng)有了一定程度的改善，為-29.3%～-49.2%。

為了補償檢測過程中的基質(zhì)效應(yīng)，本試驗采用同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。由表2可以看出，各化合物的絕對回收率在35.1%～66.4%，根據(jù)內(nèi)標(biāo)的絕對回收率匹配與之絕對回收率相差不大的化合物，通過同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正后相對回收率可達(dá)94.4%～107.1%，均可以達(dá)得到滿意的補償效果。

表2 凈化前后各目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)及各化合物的絕對回收率和相對回收率?Table 2 Matrix effects of each target compound before and after purification and absolute recovery and relative recovery of each compound %

? a為采用沙丁胺醇-D3為內(nèi)標(biāo)；b 為采用QCA-D4為內(nèi)標(biāo)；c 為采用MQCA-D4為內(nèi)標(biāo)；d為采用萊克多巴胺-D3為內(nèi)標(biāo)；e為采用克倫特羅-D9為內(nèi)標(biāo)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

將各種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用0.1%甲酸水溶液稀釋，分別配制成濃度為0.2～20.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按照1.5和1.6中所確定的液相條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測。以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，擬合線性曲線，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度0.2～20.0 μg/L 濃度范圍內(nèi)目標(biāo)化合物均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2≥0.996 2。

對陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)，經(jīng)前處理后的樣液進(jìn)行檢測，根據(jù)目標(biāo)化合物色譜峰信號強度的S/N=3和S/N=10得出豬肉中非諾特羅、萊克多巴胺和氯丙那林的檢出限和定量限分別為0.1，0.3 μg/kg；克倫特羅的檢出限和定量限分別為0.05，0.20 μg/kg，其他化合物的檢出限和定量限分別為0.2，0.5 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

以不含目標(biāo)分析物的陰性豬肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗。準(zhǔn)確稱取豬肉樣品5.0 g，設(shè)定3個添加水平(檢出限、2倍檢出限、10倍檢出限)，混勻后根據(jù)1.4方法進(jìn)行提取、凈化和測定，每個添加水平重復(fù)測定6次，計算添加平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。由表4可知：豬肉中各目標(biāo)化合物的回收率為89.1%～121.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～12.9%(n=6)。

表3 豬肉中各目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Regression equation,correlation coefficient,detection limit and limit of quantification of each target compound in pork

表4 豬肉中各目標(biāo)化合物的回收率和精密度Table 4 Recovery and precision of each target compound in pork (n=6)

2.7 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法對2018年下半年武漢地區(qū)采集的20份豬肉樣品進(jìn)行檢測，均未檢出β-受體激動劑和喹乙醇及其代謝物。

3 結(jié)論

本方試驗用2%甲酸—乙腈溶液提取，中性氧化鋁小柱凈化，正己烷去脂，液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測，建立了準(zhǔn)確定性定量檢測豬肉中8種β-受體激動劑和喹乙醇及其代謝物殘留量的方法。本方法成本低，操作快捷簡單，靈敏度較高，重復(fù)性好，能夠用于應(yīng)急檢測或日常豬肉中傳統(tǒng)型和新型“瘦肉精”殘留監(jiān)測，也為動物源食品中不同性質(zhì)的獸藥殘留高通量快速分析檢測提供一定的技術(shù)參考。但是，本研究檢測基體較為單一，今后可擴大檢測基體量、研究不同基體的前處理方式的優(yōu)化以及如何更加有效去除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，以期達(dá)到更全面、嚴(yán)格管理這類藥物使用和殘留監(jiān)測的目的。