陳彥宏 陳 穗 宋安華 黃景初 陳悅銘 劉 佳 王 宇,

(1.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400；2.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東 中山 528437)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)及其鈉鹽屬高毒有機(jī)氯農(nóng)藥，被廣泛應(yīng)用于防腐、抗菌、殺蟲、除草等方面。中國主要將五氯酚用于吸血蟲中間宿主釘螺的滅殺，稗草的防治，皮革、木材的防腐，以及養(yǎng)殖水體的消毒、清塘等[1]。五氯酚化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，具有生物蓄積作用，致畸、致癌、致突變等毒副作用，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC列為2B類致癌物[2]。五氯酚鈉具有較好的水溶性，可通過水載體廣泛傳播，進(jìn)入食物鏈并產(chǎn)生生物蓄積[3]。五氯酚進(jìn)入高等動物體內(nèi)，可通過血液參與機(jī)體循環(huán)，與血液中細(xì)胞、功能蛋白等發(fā)生作用，抑制生物代謝過程的氧化磷酸化，影響肝、腎、中樞神經(jīng)等器官、組織的正常生理活動[4]。農(nóng)業(yè)部公告第193號及第235號規(guī)定，所有動物源食品中禁止使用五氯酚及其鈉鹽[5-6]，動物性食品中不得檢出?！秶沂称钒踩O(jiān)督抽檢實施細(xì)則(2018年版)》也明確規(guī)定畜禽肉及其副產(chǎn)品須檢測五氯酚及其鈉鹽項目[7]。因此，建立靈敏度高、重現(xiàn)性好、可用于確證動物源食品中痕量五氯酚及其鈉鹽殘留的檢測方法顯得尤為重要。

目前，針對五氯酚及其鈉鹽常用的檢測方法有氣相色譜法(GC)[8-10]、氣相色譜—質(zhì)譜法(GC-MS)[11-13]、液相色譜法(LC)[14-16]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[17-19]、免疫分析法[20]等。GC和GC-MS需柱前衍生，操作繁瑣；LC靈敏度不高，定性較差；LC-MS/MS具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，已廣泛運(yùn)用于動物源食品中獸藥殘留及非法添加物的確證檢測。GB 23200.92—2016為動物源食品中五氯酚的測定提供了依據(jù)，但該法規(guī)使用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，當(dāng)同時檢測多種不同類型樣品時，需配制多條基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，基質(zhì)復(fù)雜，操作繁瑣。

本研究擬運(yùn)用全自動高通量柱式固相萃取系統(tǒng)，在GB 23200.92—2016的基礎(chǔ)上，優(yōu)化樣品前處理方法，采用內(nèi)標(biāo)法定量，研究提取溶液的選擇、固相萃取條件的選擇與優(yōu)化、內(nèi)標(biāo)的選擇等對測定結(jié)果的影響，建立顯著降低基質(zhì)效應(yīng)、響應(yīng)度高、定性定量準(zhǔn)確的檢測方法，以滿足食品安全監(jiān)管中大批量實際樣品的測定分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、紅立魚、明蝦、大閘蟹、鮮牛奶：市售；

C18固相萃取柱：500 mg/6 mL，天津博鈉艾杰爾科技有限公司；

Oasis HLB固相萃取柱：200 mg/6 mL，美國Waters公司；

Oasis MAX固相萃取柱：150 mg/6 mL，美國Waters公司。

五氯酚鈉(PCP-Na)標(biāo)準(zhǔn)品：批號Lot 94492，純度86.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

五氯酚-13C6(PCP-13C6)標(biāo)準(zhǔn)品：批號Lot M-310，純度99%，加拿大CDN公司；

五溴酚(PBP)標(biāo)準(zhǔn)品：批號Lot 160473，純度99.6%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

三乙胺：分析純，德國CNW公司；

氨水、甲酸、鹽酸、乙酸銨：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

試驗用水：一級水，經(jīng)Synergy超純水系統(tǒng)純化的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀：UPLC-30A型，日本Shimadzu公司；

三重四級桿質(zhì)譜儀：Triple Quad 5500型，美國AB SCIEX公司；

全自動高通量柱式固相萃取系統(tǒng)：SPE1000-8型，美國LabTech公司；

分析天平：UW6200H型，日本Shimadzu公司；

分析天平：CP225D型，德國Sartorius公司；

均質(zhì)機(jī)：T18 digital ULTRA-TURRAX型，德國IKA公司；

旋渦混合器：MS 3 digital型，德國IKA公司；

渦旋振蕩器：Multi Reax型，德國Heidolph公司；

離心機(jī)：Allegra X-30R型，美國BECKMAN公司；

氮吹儀：N-EVAP 112型，美國Organomation公司；

超純水系統(tǒng)：Synergy型，德國Merck公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取溶劑的選擇 稱取2.00 g均質(zhì)豬肉樣品若干份于50 mL離心管，分別使用10 mL乙腈、5%三乙胺乙腈、2%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)、5%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)、8%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)、2%氨水—乙腈、5%氨水—乙腈和8%氨水—乙腈充分提取，均質(zhì)1 min，旋渦混合5 min，8 000 r/min 離心3 min，收集提取液。

1.2.2 固相萃取條件的確定

(1)固相萃取柱的選擇：使用1.0，5.0，10.0 μg/kg添加水平下的豬肉樣品，比較C18、Oasis HLB和Oasis MAX固相萃取柱的萃取回收率。

(2)洗脫液的選擇：確定使用Oasis MAX固相萃取柱后，比較4%甲酸—甲醇、6%甲酸—甲醇、8%甲酸—甲醇、10%甲酸—甲醇、0.2%鹽酸—甲醇、0.4%鹽酸—甲醇等不同酸度的酸性甲醇溶液的洗脫能力。使用甲醇、水活化Oasis MAX柱，移取5 mL提取液以1 mL/min流速通過固相萃取柱，用5 mL 5%氨水溶液、甲醇、甲酸—甲醇—水溶液(2∶49∶49，體積比)淋洗，氣推抽干，分別使用5 mL 4%甲酸—甲醇、6%甲酸—甲醇、8%甲酸—甲醇、10%甲酸—甲醇、0.2% 鹽酸—甲醇和0.4%鹽酸—甲醇洗脫，收集洗脫液。

(3)定容溶劑的選擇：洗脫液于40 ℃下氮?dú)獯抵两?，分別用水、乙腈和乙腈—水溶液(50∶50，體積比)定容至2.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.3 超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法條件的確定

(1)質(zhì)譜條件：使用電噴霧電離負(fù)離子(ESI-)多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，氣簾氣(CUR)0.206 9 MPa(即30.0 Psi)，碰撞氣(CAD)0.062 1 MPa(即9.0 Psi)，電噴霧電壓(IS)—4 500 V，離子源溫度(TEM)500 ℃，霧化氣(GS1)0.344 8 MPa(即50.0 Psi)，輔助氣(GS2)0.344 8 MPa (即50.0 Psi)，選定母離子對，優(yōu)化去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)、碰撞電壓(CE)和碰撞室射出電壓(CXP)。

(2)色譜條件：色譜柱為Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL，以乙腈為流動相A相，比較水、5 mmol/L乙酸銨水溶液和5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相B相時的分離效果，選擇最佳流動相。

(3)基質(zhì)效應(yīng)與內(nèi)標(biāo)的選擇：配制豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹和牛奶樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，與相應(yīng)濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，研究基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)(ME)=[(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率÷溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)-1]×100%。比較五氯酚-13C6和五溴酚的性質(zhì)，選擇合適內(nèi)標(biāo)。

1.2.4 方法學(xué)考察

(1)線性關(guān)系與定量限：使用乙腈—水溶液(50∶50，體積比)逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，加入內(nèi)標(biāo)，制得0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)濃度1.0 μg/L。以五氯酚與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)y，濃度為橫坐標(biāo)x，加權(quán)后進(jìn)行線性回歸。進(jìn)樣量5 μL，計算目標(biāo)物峰高與基線噪聲的信噪比(S/N)，以S/N=10為儀器定量限，并測定空白樣品加標(biāo)回收后的信噪比，確證方法定量限。

(2)準(zhǔn)確度與精密度：在豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹和牛奶樣品中各添加1.0，5.0，10.0 μg/kg五氯酚，重復(fù)測定6次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、分析，并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的確定

由表1可知，提取回收率隨著提取溶劑中堿濃度的增加而增加，當(dāng)堿濃度增加至一定程度后，回收率趨于穩(wěn)定，且提取溶劑中含水的提取效果優(yōu)于不含水的。5%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，體積比)和5%氨水乙腈提取效率相近，此方法最終選用5%氨水—乙腈進(jìn)行提取。動物組織內(nèi)部的五氯酚以結(jié)合態(tài)存在[21]，提取前需將其水解(加酸或加堿)或酶解成游離態(tài)。加堿可調(diào)節(jié)溶劑pH值，PCP的pKa為4.74[22]，當(dāng)pH>pKa+2個單位時，PCP發(fā)生離子化，呈游離的離子形態(tài)。

表1提取溶劑對豬肉加標(biāo)樣品中五氯酚提取回收率的影響
Table 1Extraction percentage of pentachlorophenol from pork spiked samples by different extraction solvents(5 μg/kg)

提取溶劑回收率/%乙腈64.05%三乙胺—乙腈72.22%三乙胺的乙腈—水溶液76.95%三乙胺的乙腈—水溶液83.28%三乙胺的乙腈—水溶液80.12%氨水—乙腈74.85%氨水—乙腈85.48%氨水—乙腈80.4

2.2 固相萃取條件的確定

2.2.1 固相萃取柱的選擇 由圖1可知，在1.0，5.0，10.0 μg/kg 添加水平下，Oasis MAX柱的萃取回收率最佳，Oasis HLB柱次之，C18柱最差。這是由于C18柱更適合于非極性到中等極性的化合物，對強(qiáng)極性的五氯酚吸附保留效果較弱。HLB柱為親水親脂平衡柱，是適用于酸性、中性和堿性化合物的通用型小柱，對極性化合物的保留需提供較好的水浸潤性環(huán)境，對水樣品中五氯酚的回收率較好，但對動物源食品中五氯酚的回收率一般。Oasis MAX柱為一種混合型的陰離子交換柱，其填料為N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基質(zhì)-CH2N(CH3)2C4H9。堿性環(huán)境下，呈酸性的五氯酚發(fā)生離子化，帶電荷，其酚羥基表現(xiàn)為1個負(fù)電荷的陰離子，酚羥基與MAX柱填料上表現(xiàn)為1個正電荷陽離子的季銨基發(fā)生離子交換作用，使五氯酚被強(qiáng)吸附并保留于MAX柱上[17]。因此，最終選用Oasis MAX固相萃取柱進(jìn)行凈化。

圖1 固相萃取柱對豬肉中五氯酚萃取回收率的影響Figure 1 Extraction percentage of pentachlorophenol from pork by different solid phase extraction columns

2.2.2 洗脫液的選擇與優(yōu)化 由圖2可知，隨著甲酸濃度的增加，洗脫液的洗脫能力逐漸增強(qiáng)。鹽酸的酸度強(qiáng)于甲酸，洗脫液中加入微量鹽酸同樣可實現(xiàn)五氯酚的洗脫，但由于鹽酸酸度過強(qiáng)，洗脫下部分強(qiáng)吸附的干擾物質(zhì)，基質(zhì)干擾加重，影響回收率。因此，最終選用10%甲酸—甲醇進(jìn)行洗脫。

使用酸性甲醇洗脫，主要是利用其酸性pH可中和被吸附的陰離子，使其去離子化，不再與填料上的季銨基產(chǎn)生靜電吸引。當(dāng)pKa-2個單位

圖2 酸性甲醇溶液濃度對五氯酚洗脫能力的影響Figure 2 Elution ability of acid methanol solution with different acid concentration on pentachlorophenol

2.2.3 定容溶液的選擇與優(yōu)化 分別使用水、乙腈和乙腈—水溶液(50∶50，體積比)定容，發(fā)現(xiàn)水中未檢測到目標(biāo)物五氯酚；乙腈中五氯酚峰型較差，出現(xiàn)溶劑效應(yīng)；乙腈—水溶液(50∶50，體積比)中五氯酚峰型良好。因此，最終選用乙腈—水溶液(50∶50，體積比)進(jìn)行定容。五氯酚鈉水溶液經(jīng)酸化至pH為6.6～6.8時，將全部轉(zhuǎn)化為五氯酚析出[3]。MAX固相萃取時，酸性甲醇洗脫液已使五氯酚鈉轉(zhuǎn)化為五氯酚。五氯酚鈉易溶于水，而分子形態(tài)的五氯酚難溶于水，可溶于多數(shù)有機(jī)溶劑。

2.3 超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法條件的確定

2.3.1 質(zhì)譜條件的確定 五氯酚是一種氯代酚類物質(zhì)。五氯酚所含苯環(huán)中存在共軛雙鍵，使π鍵電子云完全平均化，每個碳—碳鍵的鍵長和鍵能均相等，故五氯酚具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。五氯酚分子離子([M-H]-)在三重四級桿碰撞室內(nèi)不易被打碎，當(dāng)碰撞能量(CE)增加至較大程度也只能使母離子裂解出1個[Cl]-，較難獲得特征子離子，如圖3所示。

圖3 五氯酚m/z 262.8離子的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖Figure 3 Production scanning mass spectrum of pentachlorophenol m/z 262.8 ion (CE -40 V)

因此，利用五氯酚中氯元素的35Cl和37Cl兩種同位素，選定4個同位素母離子對(262.8>262.8，264.8>264.8，266.7>266.7和268.7>268.7)進(jìn)行定性定量分析，滿足確證要求[23]。其中，定量離子對為262.8>262.8，定性離子對為264.8>264.8，266.7>266.7和268.7>268.7，具體條件見表2。

2.3.2 色譜條件的確定 比較水，5 mmol/L乙酸銨水溶液和5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液3種流動相后發(fā)現(xiàn)，以水為流動相，五氯酚峰型較差，影響定量準(zhǔn)確；以5 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，峰型改善，但保留性較差，易受強(qiáng)極性雜質(zhì)干擾；以5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相，峰型尖銳，保留增強(qiáng)。因此，最終選用5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相B相，與乙腈(A相)組合進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表3。五氯酚為強(qiáng)極性的酸性化合物，C18色譜柱上保留較差。流動相中加入甲酸，可降低pH值，使五氯酚以分子形態(tài)存在，水中溶解性降低，極性減弱，獲得較好保留；同時可降低色譜柱殘余硅羥基的活性，降低五氯酚與硅羥基的次級相互作用，獲得較好色譜峰型。加入乙酸銨，可提高五氯酚的離子化效率，提高靈敏度[3]，改善峰型，具有緩沖作用，能維持流動相pH值穩(wěn)定。

2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)與內(nèi)標(biāo)選擇

(1)基質(zhì)效應(yīng)：液相色譜—質(zhì)譜分析中，受共流出干擾物和電離競爭抑制的影響，目標(biāo)物的質(zhì)譜信號會小于或大于相同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值，存在基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)影響分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。稀釋樣品基質(zhì)、凈化樣品基質(zhì)、優(yōu)化色譜分離條件和質(zhì)譜分析條件、使用內(nèi)標(biāo)物、配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線等可減小基質(zhì)效應(yīng)[24]。

表2 五氯酚、五氯酚-13C6和五溴酚的質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrum conditions of pentachlorophenol,pentachlorophenol-13C6 and pentabromophenol

表3 流動相梯度洗脫程序Table 3 Gradient of mobile phase

通過配制豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹、牛奶等樣品的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，測得豬肉、豬肝、雞肉、雞蛋、魚肉、蝦、蟹和牛奶的基質(zhì)效應(yīng)分別為-22.8%，-32.3%，-23.6%，6.0%，10.8%，-34.8%，-25.9%，-7.1%。其中，雞蛋、魚肉、牛奶因含水量較大，基質(zhì)效應(yīng)較低，為弱基質(zhì)效應(yīng)(|ME|<20%)，其他樣品為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng)(20%≤|ME|≤50%)[25]。當(dāng)同時檢測多種不同類型樣品時，需配制多條基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，基質(zhì)復(fù)雜，操作繁瑣。故本研究采用內(nèi)標(biāo)法定量，簡化操作。

(2)內(nèi)標(biāo)物的選擇：通過比較五氯酚的同位素內(nèi)標(biāo)五氯酚-13C6和性質(zhì)相近的鹵素內(nèi)標(biāo)五溴酚，由圖4可知，五氯酚-13C6和五氯酚m/z只相差6，而基于氯元素的同位素選擇母離子對，五氯酚-13C6和五氯酚存在相同母離子對268.7>268.7，質(zhì)譜信號發(fā)生疊加，影響定量定性結(jié)果。因此，最終選用五溴酚作為內(nèi)標(biāo)。

圖4 五氯酚、五氯酚-13C6和五溴酚的一級質(zhì)譜圖Figure 4 Mass spectrum of pentachlorophenol,pentachlorophenol-13C6 and pentabromophenol

2.4 方法學(xué)評價

五氯酚在0.2～10.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.600 75x+0.030 01(r=0.999 38)，定量限為1.0 μg/kg。由表4可知，五氯酚的回收率為86.0%～106.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%～4.27%。由圖5可知，五氯酚和五溴酚的色譜分離效果良好，無雜質(zhì)峰干擾。此方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度和精密度較高。

3 結(jié)論

本研究對提取溶劑、固相萃取柱、洗脫液、質(zhì)譜分析和色譜分離條件、內(nèi)標(biāo)物等進(jìn)行了優(yōu)化，建立了動物源食品中五氯酚及其鈉鹽測定的全自動固相萃取—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品中加入五溴酚內(nèi)標(biāo)，經(jīng)5%氨水—乙腈提取，運(yùn)用全自動高通量柱式固相萃取系統(tǒng)，Oasis MAX固相萃取柱凈化，5%氨水溶液、甲醇、甲酸—甲醇—水溶液(2∶49∶49，體積比)淋洗，10%甲酸—甲醇溶液洗脫，氮吹濃縮后用乙腈—水溶液(50∶50，體積比)定容，以乙腈和5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫，Kinetex C18色譜柱分離，利用氯的同位素選定母離子對并進(jìn)行質(zhì)譜分析測定。在不同動物源樣品基質(zhì)下，該方法分離效果良好，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度較好，能滿足動物源性食品中五氯酚及其鈉鹽殘留的確證分析要求，后續(xù)可進(jìn)一步研究并建立動物源食品中多種氯酚類化合物的測定方法。

表4不同樣品中五氯酚的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差
Table 4Extraction percentage and relative standard deviations of pentachlorophenol in different samples(n=6)

樣品加標(biāo)量/(μg·kg-1)測定值/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%1.00.8787.04.13豬肉5.04.7194.23.4210.09.8298.22.321.01.06106.04.27豬肝5.04.6693.23.9010.09.5695.63.881.00.9494.04.05雞肉5.04.9298.43.1610.09.7297.23.041.00.9292.03.15雞蛋5.05.02100.42.3910.09.6596.52.661.00.9393.03.27魚肉5.04.7294.42.4610.010.09100.91.621.00.8686.02.15蝦 5.04.8296.43.1810.09.6696.63.631.00.8989.03.43蟹 5.04.5791.42.8910.09.2592.53.271.00.9595.02.94牛奶5.04.7294.41.9510.09.6196.12.08

圖5 豬肉加標(biāo)樣品的MRM質(zhì)譜圖Figure 5 MRM mass spectrum of pork spiked sample (5 μg/kg)