馮西婭 張 玉 索化夷 王洪偉

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400700；2.西南大學(xué)食品科學(xué)與工程國家級教學(xué)示范中心，重慶 400700)

牦牛乳脂肪中主要含有棕櫚酸(28%～34%)、油酸(21%～37%)和硬脂酸(9%～19%)[1]。相對于其他牛乳脂肪，牦牛乳脂肪中含有較高含量的功能性脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)[2]。目前，中國關(guān)于牦牛乳的研究[3-4]多是針對其蛋白質(zhì)特性及總脂肪酸組成，但對牦牛乳甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成未有研究。甘油三酯是由1個甘油分子和3個脂肪酸分子組成，脂肪酸在甘油三酯中的位置分布是影響脂肪營養(yǎng)的重要因素，決定著甘油三酯的吸收代謝及油脂的應(yīng)用價值[5]。甘油三酯Sn-2位脂肪酸分析可以幫助研究人員有效地剖析其結(jié)構(gòu)，對牦牛乳的利用及產(chǎn)品營養(yǎng)學(xué)功能分析具有一定的科學(xué)參考價值[6]。

本試驗擬通過胰脂肪酶對甘油三酯Sn-1，3位進行專一性水解，將Sn-1，3位置上的脂肪酸游離出來，經(jīng)薄層層析分離得到甘油一酯[6]。再利用氣相色譜分析方法研究牦牛乳脂肪的Sn-2位脂肪酸組成，以期為牦牛乳的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牦牛乳脂肪：采自青海地區(qū)海拔2 000，2 500，3 000，3 500 m處的牧民家；

37種C4～C24脂肪酸甲酯混標(biāo)：產(chǎn)品編號18919-1AMP | SUPELCO，美國Sigma-aldrich公司；

豬胰脂肪酶：3萬U/g，重慶市鈦新化工有限公司；

膽酸鈉、柱層析硅膠、氫氧化鉀、氯化鈣、甲醇、乙醚、石油醚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)：分析純，重慶市鈦新化工有限公司；

無水乙醚、石油醚：色譜純，重慶市鈦新化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜儀：GC-2010型，配備電子捕獲檢測器(ECD)及氫火焰離子化檢測器(FID)，日本島津公司；

超聲波清洗機：SB-3200DTDN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

高效薄層層析硅膠板：GF254(20 cm×20 cm)型，北京貝洛生物科技有限公司；

硅膠柱：柱長30 cm，內(nèi)徑2 cm，重慶市鈦新化工有限公司；

薄層色譜展開缸：200 mm×200 mm，上海信誼儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 牦牛乳脂肪甘油三酯的制備 采用硅膠柱分離法。硅膠30 g，用石油醚調(diào)成糊狀填充層析柱。取牦牛乳脂肪1 g，溶于15 mL三氯甲烷，加入層析柱，然后用300 mL洗脫液(石油醚—乙醚混合溶液，體積比9∶1)洗脫，流速1.0～1.5 mL/min。收集液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，得純甘油三酯，供氣相色譜分析使用。

1.2.2 牦牛乳甘油三酯脂肪酸組成測定 根據(jù)文獻[7]，修改如下：取100 mg牦牛乳脂肪甘油三酯，裝入5 mL 離心管，加入石油醚—乙醚(體積比1∶1)混合溶液2 mL，適當(dāng)振搖，40 ℃水浴40 min。再加氫氧化鉀—甲醇(0.4 moL/L)溶液1 mL混勻，40 ℃水浴靜置30 min。沿瓶壁加入1 mL蒸餾水，靜置，待分層后，吸取上清液并稀釋10倍利用氣相色譜儀檢測。

1.2.3 胰脂肪酶水解甘油三酯方法 根據(jù)文獻[8]，修改如下：稱取純化過的甘三酯0.1 g于50 mL離心管中，加入胰脂肪酶40 mg及Tris-HCl緩沖液(pH 8)4 mL，搖勻1 min；依次加入2 g/L的膽酸鈉溶液1 mL及220 g/L的CaCl2溶液0.4 mL，搖勻1 min；后置于40 ℃恒溫水浴鍋1 min 并不斷搖動；在40 ℃，18 kHz，80 W超聲波清洗機中超聲2 min，加入6 mol/L的鹽酸1 mL并搖勻，加入乙醚1 mL，搖勻，吸取上清液。經(jīng)薄層層析分離，顯色確定甘一酯位置；刮取甘一酯，用乙醚提取后除去溶劑。

1.2.4 Sn-2位脂肪酸分析方法 對甘一酯進行甲酯化后經(jīng)氣相色譜分析牦牛乳脂肪的Sn-2 位脂肪酸組成及含量。根據(jù)脂肪酸甲酯混合標(biāo)準品的保留時間確定脂肪酸的組成成分，并用面積歸一法確定各組分的相對含量。

1.2.5 脂肪酸分布的測定或計算 以甘油三酯總脂肪酸和甘油三酯Sn-2位脂肪酸組成為基礎(chǔ)，通過式(1)計算一種脂肪酸結(jié)合在甘油三酯Sn-2位的含量占其總量的比例[9]。

(1)

式中：

c——脂肪酸結(jié)合在甘油三酯Sn-2位占比，%；

m1——甘油三酯Sn-2位脂肪酸含量，g；

m2——總脂肪酸含量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計分析軟件SPSS對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。每組試驗進行3次，結(jié)果用(平均值±標(biāo)準偏差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳脂肪甘油三酯脂肪酸組成

將提純的牦牛乳甘油三酯甲酯化，然后進行氣相色譜分析，得到總離子色譜圖見圖1。所得圖譜結(jié)合37種脂肪酸甲酯標(biāo)樣的保留時間比較分析定性，并采用峰面積歸一法定量，結(jié)果如表1所示。由表1可得：牦牛乳甘油三酯的脂肪酸種類共12種，中鏈飽和脂肪酸含量為2.18%～4.22%，飽和脂肪酸總量為63.44%～69.28%，顯著高于產(chǎn)自香格里拉地區(qū)及西藏拉薩地區(qū)的牦牛乳脂肪[1,10]。多不飽和脂肪酸含量為1.01%～2.34%，單不飽和脂肪酸含量為28.40%～34.21%，油酸(24.91%～30.99%)是含量最高的單不飽和脂肪酸。其次為棕櫚酸(31.35%～36.48%)和硬脂酸(9.82%～13.87%)。隨著海拔的升高，牦牛乳甘油三酯總脂肪酸中的SFA含量呈逐漸降低后升高的趨勢，UFA含量呈逐漸升高后降低的趨勢。海拔2 500 m處牦牛乳甘油三酯的棕櫚酸含量及LA/ALA(油酸/亞油酸)的比值顯著高于其他3個樣品，硬脂酸顯著低于其他3個樣品(P<0.05)。海拔3 000 m處牦牛乳甘油三酯的油酸含量顯著高于其他3個樣品(P<0.05)。

2.2 牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸組成

利用氣相色譜法分析牦牛乳脂肪甘油三酯Sn-2位脂肪酸組成，所得氣相色譜見圖2。得到牦牛乳脂肪Sn-2位不同脂肪酸含量，結(jié)果見表2。結(jié)合圖2及表2可知：牦牛乳脂肪Sn-2位脂肪酸中含量較高的為棕櫚酸(39.91%～46.23%)和油酸(17.42%～20.81%)，十四烷酸(14.66%～20.68%)。不同海拔牦牛乳的Sn-2位棕櫚酸的含量之間均有顯著性差異(P<0.05)。海拔2 000 m處的Sn-2位棕櫚酸含量最高(46.23%)，顯著高于其他3個海拔處采集的樣品(P<0.05)。此外，青海地區(qū)牦牛乳Sn-2位棕櫚酸含量(39.91%～46.23%)顯著高于普通牛乳Sn-2 位棕櫚酸的含量(32.00%～ 34.74%)[11-12]。位于Sn-2位的棕櫚酸被體內(nèi)的胰脂酶水解形成2-甘油一酯，與膽汁鹽形成乳糜微粒而被機體吸收，而Sn-1,3位置上的棕櫚酸被胰脂酶水解為游離脂肪酸，易與Ca2+形成鈣皂，不能被人體很好地吸收利用[13-15]。牦牛乳比普通牛乳更接近母乳中棕櫚酸的分布情況，更容易吸收，可為開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品如配方奶粉等提供理論參考[16-17]。海拔2 000 m與海拔3 000 m的牦牛乳樣品均未檢出位于Sn-2位亞油酸與Sn-2位亞麻酸，而海拔2 500 m與3 500 m 處的牦牛乳樣品檢出少量。所有牦牛乳脂肪樣品的Sn-2位脂肪酸組成中均未檢出丁酸，說明丁酸絕大部分結(jié)合于Sn-1，3位上。結(jié)合2.1節(jié)的結(jié)果可知，不同海拔的牦牛乳脂肪甘油三酯的總脂肪酸之間及Sn-2位脂肪酸之間大多有顯著性差異，初步判斷是牦牛在高寒草甸自由放牧，不同海拔之間牧草組成不同，牧草的營養(yǎng)成分影響了牦牛乳脂肪的營養(yǎng)特性。

1.丁酸甲酯 2.己酸甲酯 3.癸酸甲酯 4.月桂酸甲酯 5.十四烷酸甲酯 6.十五烷酸甲酯 7.棕櫚酸甲酯 8.棕櫚油酸甲酯 9.硬脂酸甲酯 10.油酸甲酯 11.亞油酸甲酯 12.亞麻酸甲酯圖1 不同海拔牦牛乳的甘油三酯的脂肪酸組成Figure 1 Different altitude yak milk triglyceride fatty acid composition

表1 不同海拔牦牛乳的甘油三酯的脂肪酸組成及含量?Table 1 Fatty acid composition and content of triglyceride in yak milk at different elevations %

? 同行小寫字母不同表明具有顯著性差異(P<0.05)；MUFA：單不飽和脂肪酸，PUFA：多不飽和脂肪酸，UFA：不飽和脂肪酸，MCSFA：中鏈飽和脂肪酸，SFA：飽和脂肪酸。

1.己酸甲酯 2.癸酸甲酯 3.月桂酸甲酯 4.十四烷酸甲酯 5.十五烷酸甲酯 6.棕櫚酸甲酯 7.棕櫚油酸甲酯 8.硬脂酸甲酯 9.油酸甲酯 10.亞油酸甲酯 11.亞麻酸甲酯
圖2 不同海拔牦牛乳脂肪的甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成
Figure 2 Sn-2 fatty acid composition of triglyceride in four kinds of yak milk fat

表2 不同海拔牦牛乳脂肪的甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成及含量Table 2 Sn-2 Fatty acid composition and content of triglyceride in four kinds of yak milk fat %

? “-”表示含量很少或者未檢出；同行小寫字母不同表明具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 不同海拔牦牛乳脂肪酸在甘油三酯結(jié)構(gòu)中的位置分布

如圖3所示，結(jié)合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的SFA占比達34.1%～40.0%，UFA的占比達21.8%～31.3%。結(jié)合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C14:0和C16:0占比分別達到了50.0%～62.5%和37.4%～47.5%，而 C18:0和 C18:1占比達到了16.1%～20.0%和19.6%～28.8%。隨著海拔的升高，結(jié)合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的SFA占比先逐漸升高，后顯著降低(P<0.05)。結(jié)合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C18:1、UFA占比呈先逐漸降低，趨于平緩后顯著升高的趨勢(P<0.05)。結(jié)合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C14:0占比先顯著性升高，后逐漸降低(P<0.05)。結(jié)合在牦牛乳甘油三酯Sn-2位上的C16:0、C18:0占比均是先顯著降低后顯著升高再顯著降低的趨勢(P<0.05)。

小寫字母不同表示不同海拔間差異顯著(P<0.05)圖3 不同海拔牦牛乳脂肪中主要脂肪酸結(jié)合在甘油三酯Sn-2位上的占比Figure 3 Proportion of various main fatty acids in yak milk fat at different altitudes in the Sn-2 position of triglyceride

3 結(jié)論

青海地區(qū)牦牛乳脂肪的脂肪酸種類共12種，其中飽和脂肪酸總量為63.44%～69.28%，含量最高的脂肪酸為棕櫚酸(31.35%～36.48%)。Sn-2位脂肪酸種類共檢測出9～11種，含量較高的為棕櫚酸(39.91%～46.23%)和油酸(17.42%～20.81%)，十四烷酸(14.66%～20.68%)。不同海拔的牦牛乳脂肪甘油三酯的總脂肪酸之間及Sn-2位脂肪酸之間大多有顯著性差異。青海地區(qū)牦牛乳脂肪中C14：0、C16:0、C15:0、C12：0、SFA主要結(jié)合在甘油三酯Sn-2位上，而C18:0、C18:1、C6:0、UFA主要結(jié)合在甘油三酯Sn-1,3位上。此外，青海地區(qū)牦牛乳Sn-2位棕櫚酸含量(39.91%～46.23%)顯著高于普通牛乳Sn-2位棕櫚酸的含量(32.00%～34.74%)，比普通牛乳更接近母乳中棕櫚酸的分布情況，更容易吸收，可為開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品如配方奶粉等提供理論參考。

本研究明確了牦牛乳甘油三酯的Sn-2位脂肪酸組成及其分布情況。并對導(dǎo)致不同海拔Sn-2位脂肪酸組成有顯著性差異的原因進行了初步推斷——不同海拔生長的牧草不同，其營養(yǎng)成分影響了牦牛乳脂肪的營養(yǎng)特性。目前牦牛乳的營養(yǎng)學(xué)研究有待加強，明確了牦牛乳甘三的結(jié)構(gòu)對于研究其營養(yǎng)學(xué)特性及牦牛乳制品的開發(fā)有促進作用。