李王麗 佟 曉 陳 斌

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，高發(fā)年齡在50歲左右，近年來(lái)其發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)[1-2]。宮頸鱗狀細(xì)胞癌的具體發(fā)病機(jī)制還不明確，病因包括遺傳、長(zhǎng)期雌激素刺激、體質(zhì)因素等[3]。現(xiàn)代研究表明宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展是涉及多個(gè)遺傳變化多階段演化過程，其中癌癥相關(guān)基因的檢測(cè)有助于宮頸鱗狀細(xì)胞癌的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)[4-5]。黏蛋白4(mucin 4,MUC4)是一種高分子量的糖基化蛋白，在正常的女性生殖道中均有表達(dá)，在宮頸癌中MUC4的表達(dá)量較正常的宮頸組織顯著上升[6-7]。內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)也是一種酪氨酸激酶受體，可參與體內(nèi)的多種反應(yīng)，EGFR及其相關(guān)的信號(hào)通路可以作為宮頸癌患者的治療靶點(diǎn)[8]；其也能夠進(jìn)一步激活該通路的下游因子從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[9-10]。本文采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)MUC4、EGFR和p-AKT在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁組織中的表達(dá)，探討其在宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生與發(fā)展中的意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

采用回顧性、總結(jié)研究方法，2015年9月到2017年12月選擇在我院進(jìn)行手術(shù)診治的宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者120例的癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放療、化療及激素治療；有完整的臨床與病理資料；病理檢查診斷為宮頸鱗狀細(xì)胞癌；癌旁組織與離癌組織距離≥3 cm；醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴隨有婦科內(nèi)分泌疾病及生殖道炎癥；妊娠與哺乳期婦女；臨床與病理資料缺項(xiàng)。

在120例患者的組織標(biāo)本中，年齡最小45歲，最大78歲，平均年齡(65.33±4.21)歲，年齡≥60歲60例；分化程度：高分化80例，中分化20例，低分化20例；臨床分期：Ⅰ期60例，Ⅱ期40例，Ⅲ期20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；肌層浸潤(rùn)50例。

1.2 免疫組化方法

所有患者的癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本取材后，用10%的甲醛溶液固定12～24 h，石蠟包埋，制備成4 μm厚的石蠟切片。

兔抗人MUC4、EGFR和p-AKT多克隆抗體來(lái)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB酶底物顯色劑來(lái)自廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司，超敏鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶染色法(S-P免疫組化法)廣譜免疫組化試劑盒來(lái)自廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司。

將切片組織37 ℃烤24 h，脫蠟后清洗3次。3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，清洗3次后進(jìn)行抗原修復(fù)，加入一抗，濕盒內(nèi)4 ℃過夜。清洗后，加二抗37 ℃，30 min。DAB顯色，脫水封片后在光學(xué)顯微鏡觀察。取已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo)

鏡下順序放大200倍，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野。MUC4、EGFR和p-AKT蛋白表達(dá)陽(yáng)性為胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。染色強(qiáng)度陰性為0分、染色弱但強(qiáng)于陰性對(duì)照為1分、染色清晰為2分、染色強(qiáng)為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為0分，≥10%～30%為1分，>30%～60%為2分，>60%為3分。上述二種評(píng)分相加0～1分為(-)，2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)，3～6分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MUC4、EGFR和p-AKT表達(dá)陽(yáng)性率情況

癌組織中MUC4、EGFR和p-AKT表達(dá)陽(yáng)性率分別為90.8%、74.2%和93.3%，癌旁組織分別為28.3%、36.7%和30.0%，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同組織的MUC4、EGFR和p-AKT陽(yáng)性表達(dá)情況(例，%)

2.2 MUC4、EGFR和p-AKT表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的相關(guān)性

在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，MUC4、EGFR和p-AKT表達(dá)陽(yáng)性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤(rùn)深度的加深、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而顯著增高(P<0.05)。見表2。

2.3 MUC4、EGFR和p-AKT的相關(guān)性分析

在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示MUC4與EGFR呈顯著正相關(guān)性(γ=0.563，P<0.05),MUC4與p-AKT呈顯著正相關(guān)性(γ=0.433，P<0.05)，EGFR與p-AKT呈顯著正相關(guān)性(γ=0.411，P<0.05)。見表3。

3 討論

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是嚴(yán)重危害女性健康的疾病，當(dāng)前在我國(guó)的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，已對(duì)女性的生命和健康造成了嚴(yán)重的威脅[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者存在血糖異常，多伴隨有肥胖、高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病，其發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過程，也是多種因素綜合作用導(dǎo)致的病變[12-13]。

本研究顯示癌組織中MUC4、EGFR和p-AKT表達(dá)陽(yáng)性率分別為90.8%、74.2%和93.3%，癌旁組織分別為28.3%、36.7%和30.0%，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MUC4對(duì)上皮細(xì)胞的完整性和更新起著重要作用，其在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤中均表達(dá)異常[14]，但其具體機(jī)制目前尚不清楚。EGFR在多種實(shí)性腫瘤中表現(xiàn)出高度活性，在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的患者體內(nèi)出現(xiàn)了EGFR基因擴(kuò)增、表達(dá)上調(diào)。EGFR是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，具有酪氨酸激酶活性，其前體在胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)修飾形成成熟EGFR，膜受體與配體結(jié)合形成受體復(fù)合物，經(jīng)內(nèi)陷、吞飲進(jìn)入胞質(zhì)，于溶酶體內(nèi)降解，受體再循環(huán)至膜上[15-16]。研究表明，約80%的宮頸癌、50%的卵巢癌、60%的子宮內(nèi)膜癌、70%的外陰癌組織中存在EGFR的過度表達(dá)，遠(yuǎn)高于正常組織，其中以宮頸、外陰的鱗狀上皮腫瘤中過表達(dá)最明顯[17]。Akt經(jīng)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-3-磷脂酰肌醇依賴性激酶-1(PDK1)，整合素連接激酶等作用后發(fā)生2個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，從而被激活，p-Akt為其活化形式，在胰腺癌、乳腺癌、大腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌都呈現(xiàn)高表達(dá)狀況[18]。

表2 MUC4、EGFR和p-AKT陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征參數(shù)的相關(guān)性(例，%)

表3 宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織MUC4、EGFR和p-AKT表達(dá)的相關(guān)性分析(n=120)

宮頸鱗狀細(xì)胞癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，組織學(xué)上為高分化、中分化、低分化，高發(fā)年齡為55歲左右，近年來(lái)其發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)。本研究顯示在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，MUC4、EGFR和p-AKT表達(dá)陽(yáng)性率隨著分化程度的降低、臨床分期的增加、肌層浸潤(rùn)深度的加深、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而顯著增高(P<0.05)。MUC4包括2個(gè)EGF樣結(jié)構(gòu)域、1個(gè)跨膜區(qū)及1個(gè)磷酸化位點(diǎn)，MUC4高表達(dá)與結(jié)腸癌、膽管細(xì)胞癌、胰腺癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[19]。EGFR是生長(zhǎng)因子受體，主要參與腫瘤細(xì)胞的增殖，目前已經(jīng)作為一些惡性腫瘤的診斷指標(biāo)應(yīng)用于臨床[20]。EGFR表達(dá)增加與宮頸癌的惡性度及不良預(yù)后相關(guān)，EGFR中強(qiáng)表達(dá)與臨床分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素相關(guān)。宮頸癌中p-AKT受到多種信號(hào)分子的影響，與酪氨酸激酶受體如EGFR、FGFR、PDGFR等結(jié)合后通過PI3K/AKT信號(hào)通路激活細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[21]。本研究Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織的MUC4與EGFR、p-AKT呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，EGFR與p-AKT呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)。有研究顯示在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中存在EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中PI3K/AKT信號(hào)通路主要參與調(diào)控細(xì)胞的存活[22]。MUC4可以調(diào)控EGFR的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。EGF和TGF-α可以與胞內(nèi)酪氨酸激酶受體結(jié)合后激活其下游的信號(hào)通路，從而促進(jìn)MUC4的轉(zhuǎn)錄[23]。不過本研究也有一定的不足，與樣本量偏小有關(guān)，而且免疫組織化學(xué)染色主要是在蛋白水平檢測(cè)，可能存在一定的檢測(cè)誤差，將在下一步中完善分析。

綜上所述，MUC4、EGFR和p-AKT在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，與臨床病理特征參數(shù)密切相關(guān)，共同參與調(diào)節(jié)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展。