張 蘭 崔利民 付 倩 張文濤 金 焰 霍彥平

乳腺癌是由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成的惡性腫瘤[1]。目前，全切除術(shù)是晚期乳腺癌常見(jiàn)的外科手術(shù)，可有效的切除患者的腫瘤組織，抑制癌細(xì)胞擴(kuò)散。但術(shù)后仍有部分患者病情惡化而出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，故此其預(yù)后評(píng)估也逐漸受到關(guān)注和重視[2]。有研究顯示，miRNA是1種小分子的單鏈非編碼RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、腫瘤血管生成、入侵和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，其中miRNA-23a表達(dá)在乳腺癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中存在異常，但其機(jī)制尚不明確[3-4]。對(duì)此，本研究通過(guò)檢測(cè)晚期乳腺癌全切除術(shù)后患者的miRNA-23a表達(dá)，探討其與晚期乳腺癌全切除術(shù)后患者的預(yù)后關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月至2017年3月本院晚期乳腺癌全切除術(shù)后患者160例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)等檢查證實(shí)為乳腺癌[5]；②就診前1個(gè)月無(wú)免疫、放化療、抗感染等治療史；③無(wú)精神病病史；④患者或家屬簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠及哺乳特殊人群；②血液性疾??；③有心、肝、腎等嚴(yán)重性疾病；④拒絕或終止本次研究者。其中年齡30～68歲，平均年齡(48.52±17.53)歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(19.06～30.40)kg/m2，平均BMI(24.21±4.06)kg/m2，腫瘤類型：導(dǎo)管癌18例，小葉癌15例，腺癌伴粉刺樣癌12例，其他類型6例，同期選取健康人員160例，年齡26～72歲，平均年齡(48.53±17.55)歲，BMI(19.06～30.13)kg/m2，平均BMI(24.22±4.08)kg/m2，為本院體檢中心經(jīng)健康體檢合格的正常人，輔助檢查中血、尿常規(guī)檢查，血清肝、腎功能生化指標(biāo)，相關(guān)激素的標(biāo)記免疫分析指標(biāo)均在正常范圍，無(wú)心、肺、腎等器官器質(zhì)性病變，本次研究已經(jīng)我院倫理委員會(huì)審批且通過(guò)，兩組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

血清抽?。航o予所有患者術(shù)前(出院日)、術(shù)后及健康人員晨起空腹抽取上臂靜脈血3 ml于無(wú)菌試管中，室溫靜置30 min，待血液自然凝固后3 500 r/min離心 10 min，收集上層血清，標(biāo)本置-80 ℃ 保存?？俁NA提取：按照總RNA提取試劑(北京Tiangen公司)的說(shuō)明書提取，水溶解后采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，待吸光度(A260/280nm)位于1.8～2.1之間可用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作對(duì)miRNA-23a進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，miRNA-23a莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物為：5'-CGTCGCTACATCCAG7rrGAG-CATATGCGACGCTrC-CAGT-3'，由上海生工生物工程有限公司負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃保存。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：應(yīng)用SYBR Green FQ-PCR試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)行檢測(cè)。miR-23a：上游引物(F)：5'-，ITIHCAGACCCCAGGCAG-GCACA-3'，下游引物(R)：5'-TCCATCAGCGTCAA-CACCATCA-3'；本實(shí)驗(yàn)設(shè)置復(fù)孔3個(gè)，采用u6基因作為內(nèi)參，每個(gè)樣品測(cè)定3次，miRNA表達(dá)量變化采用與u6基因循環(huán)閾值比較進(jìn)行確定，U6 F：5'-GCGCGTCGTGAAGCGTYC-3'，R：5'-GTGCAGGGT-CCGAGGT-3'。PCR循環(huán)參數(shù):95 ℃ 3 min，95 ℃12 s，62 ℃40 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.3 觀察指標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)

在62 ℃采集熒光信號(hào)，并用熒光定量PCR儀自帶軟件進(jìn)行熔解曲線分析，miR-23a的相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔCt法計(jì)算，公式：ΔCt =[(樣本CtmiRNA-23-樣本CtU6)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 所有研究對(duì)象的血清miRNA-23a表達(dá)量比較

患者術(shù)后血清miRNA-23a表達(dá)量明顯低于健康人員，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 所有研究對(duì)象的血清miRNA-23a表達(dá)量比較

2.2 乳腺癌術(shù)前、術(shù)后患者血清miRNA-23a表達(dá)量比較

患者術(shù)后血清miRNA-23a表達(dá)量明顯高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌術(shù)前、術(shù)后患者血清miRNA-23a表達(dá)量比較

2.3 乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移血清miRNA-23a表達(dá)量及變化量比較

隨訪12個(gè)月后發(fā)現(xiàn)乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有50例，無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移110例，同時(shí)在術(shù)后3、6、9、12個(gè)月血清miRNA-23a表達(dá)量及變化量方面，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者明顯低于無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者術(shù)后呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者術(shù)后呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 miRNA-23a與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的Logistic回歸性分析結(jié)果

Logistic回歸性分析結(jié)果顯示，血清miRNA-23a表達(dá)變化量<20%是患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

組別例數(shù)3個(gè)月6個(gè)月9個(gè)月12個(gè)月變化量/%復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者500.48±0.120.41±0.130.35±0.100.29±0.09-7.21±0.02無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者1100.58±0.200.95±0.331.22±0.231.65±0.4231.56±0.12t3.27411.16825.63422.6252266.504P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

表4 miRNA-23a與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的Logistic回歸性分析結(jié)果

3 討論

乳腺癌是發(fā)生在女性乳腺上皮組織的惡性腫瘤，隨著近年來(lái)生活節(jié)奏的加快和醫(yī)學(xué)知識(shí)的匱乏導(dǎo)致該發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì)，已成為當(dāng)前社會(huì)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，多數(shù)患者被確診時(shí)已是晚期狀態(tài)，嚴(yán)重危及患者的身體健康[6-7]。目前，臨床主要通過(guò)全切除術(shù)治療晚期乳腺癌，可有效切除腫瘤組織，控制癌細(xì)胞擴(kuò)散，改善患者病情[8]。但有研究顯示，多數(shù)晚期乳腺癌患者的乳腺癌細(xì)胞喪失了正常細(xì)胞的特性，游離機(jī)體后易造成其他病變，從而引起病情復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，故如何針對(duì)性確?；颊咝g(shù)后預(yù)后轉(zhuǎn)歸有價(jià)值的指標(biāo)具有重要的臨床意義[9]。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，miRNA是1類短序列、非編碼的單鏈小分子RNA，通過(guò)堿基配對(duì)識(shí)別靶mRNA，引發(fā)靶基因的降解或者抑制其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)，與癌組織的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。其中miRNA-23a是存在脊椎動(dòng)物的基因組中的1種抑癌因子，可參與基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，其表達(dá)量在晚期乳腺癌的診斷及預(yù)后評(píng)估中具有重要的參考價(jià)值[11]。

對(duì)此，本研究通過(guò)檢測(cè)所有研究對(duì)象的血清miRNA-23a表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者血清miRNA-23a表達(dá)量明顯低于健康人員，此與Zhu等[12]的研究結(jié)果基本相同，表明血清miRNA-23a表達(dá)量與晚期乳腺癌的病理發(fā)展有密切關(guān)系。這可能由于隨著乳腺癌患者病情的惡化，導(dǎo)致體內(nèi)的癌細(xì)胞嚴(yán)重?cái)U(kuò)散，從而使miRNA對(duì)靶基因的降解或者抑制其翻譯的負(fù)性調(diào)控能力降低，繼而降低miRNA-23a發(fā)揮調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖的能力。同時(shí)本研究中，患者術(shù)后血清miRNA-23a表達(dá)量明顯高于術(shù)前(出院日)，此與Shaker等[13]的研究結(jié)果基本相同，表明晚期乳腺癌患者行全切除術(shù)可有效改善血清miRNA-23a表達(dá)量。這有可能由于通過(guò)全切除術(shù)可有效的切除腫瘤組織，遏止癌細(xì)胞的擴(kuò)散，從而恢復(fù)miRNA對(duì)靶基因的正常調(diào)控，促進(jìn)miRNA-23a的表達(dá)趨于平衡。此外，兩組術(shù)后患者均有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，且在術(shù)后3、6、9、12個(gè)月血清miRNA-23a表達(dá)量及變化量方面，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者明顯低于無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者術(shù)后呈持續(xù)下降的趨勢(shì)，無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者術(shù)后呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，此與胡聶等[14]的研究結(jié)果基本相同，表明血清miRNA-23a表達(dá)量變化與患者術(shù)后的發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。這有可能由于部分患者術(shù)后的癌組織無(wú)法被抑制殺死，且隨著病情的發(fā)展會(huì)加劇擴(kuò)散分化，進(jìn)一步侵襲miRNA-23a，使其參與的基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控失衡，從而使miRNA-23a的表達(dá)量降低。同時(shí)，本研究的Logistic回歸性分析結(jié)果顯示，血清miRNA-23a表達(dá)變化量<20%是患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素，此與Kleivi等[15]的研究結(jié)果基本相同，表明miRNA-23a的表達(dá)量可作為晚期乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的評(píng)估因子，故術(shù)后監(jiān)測(cè)miRNA-23a的表達(dá)量對(duì)患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有重要意義，若術(shù)后患者的miRNA-23a的表達(dá)量明顯降低，應(yīng)及時(shí)檢查預(yù)防，確保病情穩(wěn)定。

綜上所述，miRNA-23a與晚期乳腺癌的發(fā)生及其全切除術(shù)后預(yù)后轉(zhuǎn)歸有關(guān)，術(shù)后監(jiān)測(cè)血清miRNA-23a表達(dá)量可作為評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)。