林志堅 肖 斌 孫朝暉 李林海

根據(jù)2017 年發(fā)布的中國腫瘤登記年報顯示，乳腺癌的發(fā)病率已經(jīng)高居全球女性惡性腫瘤之首，發(fā)病率高達(dá)28.42/10 萬，每年新發(fā)病例約27.9 萬，死亡病例數(shù)約6.5 萬[1]。

谷氨酸是重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，谷氨酸通過與谷氨酸受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用[2]。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體兩類。代謝型谷氨酸受體包括GRM1-8共8個受體亞型，為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，通過介導(dǎo)第二信使來調(diào)節(jié)受體生理功能[3]。

代謝型谷氨酸受體4 (Glutamate Metabotropic Receptor 4，GRM4)是1種突觸前谷氨酸受體，其在控制運(yùn)動的基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的數(shù)個關(guān)鍵位置表達(dá)[4]，參與突觸前興奮性谷氨酸信號的神經(jīng)傳遞。研究表明GRM4在結(jié)直腸癌[5]、骨肉瘤[6]等多種腫瘤中高表達(dá)并與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)，其過表達(dá)可能是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因。而我們課題組近期也報道了GRM4與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)作用[7]。本研究擬構(gòu)建人GRM4基因慢病毒載體，并篩選穩(wěn)定表達(dá)GRM4蛋白的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，為進(jìn)一步探討GRM4在乳腺癌中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

非病毒質(zhì)粒3×Flag-GRM4、293T細(xì)胞系、MDA-MB-231細(xì)胞、慢病毒載體質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒pMD2.G及包裝質(zhì)粒psPAX2由本實驗室保存；DNA maker購自Takara公司(Cat:3427Q)；總RNA提取試劑(Cat:ER101-01)及qPCR試劑(Cat:AQ141-01)購自北京全式金公司；LipofectamineTM 2000購自Thermo Fisher(Cat:11668027)；凝膠純化試劑盒、TaqDNA聚合酶及dNTP、限制性內(nèi)切酶購自Takara公司；ECL Western blotting試劑盒購自Thermo Fisher(Cat:WP20005)；DAPI染液購自碧云天(Cat:C1002)。

1.2 重組慢病毒GRM4質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

1.2.1 目的片段獲取 以之前構(gòu)建好的非病毒質(zhì)粒3×Flag-GRM4為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，切膠純化后回收備用。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將PCR產(chǎn)物與慢病毒載體進(jìn)行常規(guī)的連接、轉(zhuǎn)化、挑菌等分子克隆實驗，重組質(zhì)粒并送華大基因測序鑒定。

1.3 GRM4慢病毒的包裝

轉(zhuǎn)染前一天在10 cm平皿中接種293T包裝細(xì)胞，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；包裝細(xì)胞50%融合時共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2以及慢病毒表達(dá)載體各4 μg，以及30 μl標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000，同時設(shè)置慢病毒空載體pCDH-vector作為陰性對照；6 h后換液，加入10 ml的新鮮培養(yǎng)基；48 h后培養(yǎng)上清用0.45 μm的非硝酸纖維濾器消毒過濾，以清除細(xì)胞碎屑及污染的包裝細(xì)胞，4 ℃暫時保存。

1.4 MDA-MB-231細(xì)胞感染、穩(wěn)定株的與鑒定

感染前一天(18～24 h)，將目標(biāo)細(xì)胞鋪于10 cm平皿；細(xì)胞達(dá)到50%融合度后，將10 ml的含病毒上清液加入8 μg/ml的Polybrene(已配成1000×工作液)；6 h后更換正常培養(yǎng)基(含10%FBS的DMEM)；24 h后開始用濃度0.5 μg/ml puro篩選；每1～2天更換培養(yǎng)基(均含相同puro濃度，根據(jù)細(xì)胞死亡情況，調(diào)整puro濃度)；約1周后可挑選出穩(wěn)定細(xì)胞株，獲得的細(xì)胞即為穩(wěn)定表達(dá)GRM4的細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的熒光表達(dá)情況；將篩選后的穩(wěn)定表達(dá)GRM4細(xì)胞和對照細(xì)胞按5×10個/孔接種于6孔板完全培養(yǎng)基中，孵育24 h后，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-PCR方法檢測兩組細(xì)胞中GRM4基因表達(dá)的情況。

1.5 Western blotting檢測GRM4的表達(dá)

RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書操作測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，用50 g/l脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，加以50 g/L脫脂牛奶1∶1 000稀釋的抗兔Flag抗體，4 ℃過夜，TBS-T洗膜后，加以50 g/l脫脂牛奶1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，37 ℃溫育1 h，TBS-T洗膜，ECL液顯影，β-actin作為內(nèi)參蛋白定量。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的獲得

以非病毒質(zhì)粒3×Flag-GRM4為模板PCR擴(kuò)增獲得目的基因DNA后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約為2700 bp明亮特異的目的條帶，與GRM4的分子量大小相符(2736 bp)(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增目的基因GRM4的電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

將重組慢病毒質(zhì)粒送至華大公司測序驗證，經(jīng)序列比對后證實插入序列無誤，表明重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 重組GRM4慢病毒的包裝

GRM4慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒和慢病毒空載體質(zhì)粒pCDH-vector與包裝病毒系統(tǒng)質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染1周后收集病毒上清液。

2.4 MDA-MB-231細(xì)胞感染、穩(wěn)定株的篩選及鑒定

在熒光顯微鏡下可觀察到重組GRM4慢病毒感染后的細(xì)胞和對照細(xì)胞均帶有綠色熒光，證明病毒成功感染細(xì)胞。進(jìn)一步將感染過的細(xì)胞傳代，于40×顯微鏡下可觀察到轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長情況與正常細(xì)胞相比，細(xì)胞形態(tài)基本一致，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，生長狀況良好；證明轉(zhuǎn)染細(xì)胞群培養(yǎng)成功。

2.5 RT-PCR法和Western blot法檢測感染細(xì)胞中GRM4表達(dá)

實時熒光PCR檢測結(jié)果顯示重組慢病毒感染的細(xì)胞中GRM4基因mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組(圖2A)。Western blot 檢測結(jié)果表明，重組慢病毒感染的細(xì)胞中GRM4蛋白表達(dá)量明顯高于對照組(圖2B)。綜上所述，穩(wěn)定表達(dá)GRM4的MDA-MB-231細(xì)胞株構(gòu)建成功。

A為RT-PCR法檢測法，B為Western blot檢測法。

3 討論

代謝型谷氨酸受體是1個龐大的受體家族，它主要參與學(xué)習(xí)、記憶、疼痛的傳導(dǎo)以及維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。這些受體被激活后通過G-蛋白效應(yīng)酶、腦內(nèi)第二信使等組成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起作用，產(chǎn)生較緩慢的生理反應(yīng)。有研究表明，谷氨酸信號通路的紊亂可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。最初，對于代謝型谷氨酸受體的研究大多集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面。事實上，谷氨酸及其受體在外周組織中也有廣泛分布[9]，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)這些受體不僅參與神經(jīng)突觸的調(diào)控，還在細(xì)胞增殖、分化和生存方面發(fā)揮重要作用[10]。新近研究表明，GRM5在肝臟中具有表達(dá)，且在與肝臟相關(guān)的病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，GRM5的表達(dá)及活性升高可能是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變的重要原因[11]。

GRM4主要是突觸前谷氨酸受體，其在控制運(yùn)動的基底神經(jīng)節(jié)環(huán)路的數(shù)個關(guān)鍵位置表達(dá)[4]，參與突觸前興奮性谷氨酸信號的神經(jīng)傳遞。GRM4可在人的骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)[6,12]，并且骨肉瘤組織中GRM4的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[13]。此外，GRM4已經(jīng)被證明與許多腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)，如結(jié)直腸癌[5]，橫紋肌肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤[14]。肖斌等人的研究發(fā)現(xiàn)GRM4能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖能力[7]。根據(jù)GRM4的前期研究報道及代謝型谷氨酸受體各亞型在多種腫瘤進(jìn)程中的作用，我們推測GRM4可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染有多種載體可供選擇，如質(zhì)粒、脂質(zhì)體、反轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒等，其中慢病毒載體以其高感染率、高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達(dá)、宿主范圍廣及安全性好等特點(diǎn)，已成為真核系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移的有力工具。本研究通過基因重組技術(shù)將GRM4基因插入到慢病毒載體中，構(gòu)建了重組慢病毒載體質(zhì)粒。隨后，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染到239T細(xì)胞中，進(jìn)行病毒包裝。用重組慢病毒感染MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)藥物篩選和實驗鑒定后，成功獲得穩(wěn)定表達(dá)GRM4蛋白的細(xì)胞株。穩(wěn)定表達(dá)GRM4蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株的獲得，可作為GRM4 蛋白過表達(dá)載體應(yīng)用于腫瘤等疾病的功能研究，有助于從細(xì)胞和分子水平深入探討GRM4 蛋白在乳腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。