王 爽，許堅吉，劉曉霓，陳德喜

作者單位:100069北京市 首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科（王爽）；首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院北京市肝病研究所（許堅吉，劉曉霓，陳德喜）

熒光素酶（luciferase）報告系統(tǒng)是生物發(fā)光最常見的系統(tǒng)之一，是luciferase以熒光素（luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2為底物，在Mg2+存在時發(fā)生酶促反應產(chǎn)生光子的過程，其公式如下:luciferase+ATP+luciferin+O2→AMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+light。生物發(fā)光分子成像（bioluminescene molecular imaging，BLI）技術(shù)利用生物發(fā)光原理，能夠重復性地實時監(jiān)測實驗動物腫瘤的生長情況。與熒光方法相比，BLI表現(xiàn)出很小的背景信號以及較高的信噪比，具有更高的敏感度及特異度[1-3]。將體外能穩(wěn)定表達luciferase的細胞株植入動物體內(nèi)，當采用腹腔或靜脈注射等外源方法給予luciferin時，可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，利用光學系統(tǒng)即可檢測出光強度，能夠間接地反映出細胞數(shù)量的變化以及細胞的定位情況。同時，luciferase的表達和生物發(fā)光系統(tǒng)本身不會對腫瘤生長產(chǎn)生影響[4]。BLI技術(shù)能夠無創(chuàng)傷地直接快速測量各種模型動物腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，并可對治療后腫瘤細胞的變化進行實時觀測和評估[5-7]。本研究選擇帶有l(wèi)uciferase基因的肝癌HepG2細胞，摸索出適合細胞的體外最適底物濃度以及在此濃度下的最適ATP緩沖液濃度，并將此優(yōu)化配比系統(tǒng)應用于荷瘤裸鼠進行驗證實驗，以提高這一報告系統(tǒng)在檢測小動物體內(nèi)腫瘤的靈敏度。

1 對象與方法

1.1 細胞、動物、儀器與試劑 帶有l(wèi)uciferase報告基因的肝癌HepG2-Luc細胞來自軍事醫(yī)學科學院九所，培養(yǎng)條件為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（含200 ng/ml嘌呤霉素），在5%CO2、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；雄性Balb/C裸鼠，6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實驗技術(shù)有限公司。多功能酶標儀（美國PerkinElmer），多模式活體成像系統(tǒng)In-vivo Fx Pro（美國柯達Carestream醫(yī)療集團）；熒光素（D-luciferin）購自美國GOLDBIO公司；ATP-2Na干粉購自美國Amerasco公司；戊巴比妥鈉為自德國進口分裝；GlyGly和MgSO4購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 HepG2-Luc細胞luciferin最佳反應濃度的優(yōu)化 培養(yǎng)HepG2-Luc細胞至對數(shù)生長期，胰酶消化并計數(shù)細胞，以每孔1×104個細胞鋪于黑色平底96孔培養(yǎng)板內(nèi)。將luciferin溶液1：2倍比稀釋為12個濃度，使luciferin的使用濃度從20 mg/ml到0.01 mg/ml，每個濃度設定一個復孔。避光并于酶標儀內(nèi)檢測96孔板相應位置的發(fā)光每秒鐘發(fā)光計數(shù)（CPS）。同時，使用活體成像儀在生物發(fā)光模式下拍攝。

1.3 ATP最佳反應濃度的優(yōu)化 配置ATP緩沖反應液（50 mM GlyGly，30 mM MgSO4，pH 7.5），調(diào)整ATP溶液濃度為5 mM，取0.2 μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。以每孔1×104個細胞鋪于黑色平底96孔板內(nèi)，使luciferin處于檢測的最佳發(fā)光濃度條件下。將ATP濃度從200 μM，按照1：2倍比稀釋至11個濃度，分別加至含有l(wèi)uciferin最佳濃度的各孔中，最后一孔不加ATP溶液，設為陰性對照，每個濃度設定一個復孔。避光并于酶標儀內(nèi)檢測各孔的CPS值，同時使用活體成像儀進行生物發(fā)光模式拍攝。

1.4 裸鼠腫瘤皮下注射 首先培養(yǎng)足夠數(shù)量的HepG2-Luc細胞，胰酶消化后用PBS洗2遍。計數(shù)細胞并調(diào)整細胞數(shù)，重懸于冷的PBS緩沖液中。將細胞置于冰盒內(nèi)并攜帶至動物房。隨機選取體質(zhì)量接近的兩只裸鼠，用1 ml注射器吸取適量的細胞懸液，并注射于裸鼠的右側(cè)腋下，右前肢腋下接種細胞數(shù)為2×105個，右后肢接種細胞數(shù)為2×106個，每個接種部位的注射量為100 μl。

1.5 活體成像儀檢測 稱量荷瘤裸鼠體質(zhì)量，根據(jù)對應劑量向裸鼠腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉動物。待無意識后，向兩只裸鼠腹腔內(nèi)注射由生理鹽水配制的無菌luciferin溶液（15 mg/ml）200 μl。隨機選取一只裸鼠作為實驗鼠，腹腔內(nèi)注射優(yōu)化后的ATP緩沖溶液200 μl，同時向?qū)φ帐笞⑸?00 μL無菌生理鹽水，5 min后將動物擺放于觀察盒內(nèi)，在小動物活體成像儀上進行生物發(fā)光模式的觀察和拍攝。依次拍攝生物發(fā)光模式圖片和X光模式圖片，保存并進行圖片疊加。輸出疊加的圖片，獲取生物發(fā)光圖像的相關(guān)信息，對發(fā)光區(qū)域進行總發(fā)光強度（sum intensity）的分析。

2 結(jié)果

2.1 Luciferin最佳濃度的篩選情況 向各孔HepG2-Luc細胞（1×104）中加入不同濃度的luciferin溶液，在多功能酶標儀上進行發(fā)光模式檢測。根據(jù)平均值，繪制各濃度下的發(fā)光強度曲線，結(jié)果可見隨著底物濃度的增加，發(fā)光強度也在逐漸增強，最大發(fā)光強度和飽和luciferin水平處在1.25 mg/ml濃度時（圖1A），濃度大于1.25 mg/ml時會出現(xiàn)發(fā)光強度下降趨勢?；铙w成像儀的檢測結(jié)果與酶標儀檢測結(jié)果一致（圖1B）。

2.2 ATP緩沖液最佳濃度的篩選情況 在各孔HepG2-Luc細胞（1×104）鋪板后，將 luciferin反應濃度調(diào)整為1.25 mg/ml（即處于不限制水平），以此為條件檢測最佳ATP緩沖液的使用濃度。ATP在0～200 μM范圍內(nèi)，在luciferin濃度一致的情況下，隨著ATP緩沖液濃度的逐漸提高，發(fā)光強度是逐漸增高的，最高的發(fā)光強度是ATP在12.5 μM條件下（圖 2A）。同時發(fā)現(xiàn)，過量的 ATP（＞50 μM）會明顯抑制發(fā)光強度，說明過量的ATP緩沖液會抑制熒光素酶體系反應，或是過量的ATP對細胞產(chǎn)生毒性作用，使發(fā)光水平急劇下降?；铙w成像儀的檢測結(jié)果也與酶標儀檢測結(jié)果是一致的（圖2B）。

圖1 Luciferin最佳濃度的篩選

圖2 ATP緩沖液最佳濃度的篩選

2.3 熒光素酶優(yōu)化報告系統(tǒng)對裸鼠皮下接種腫瘤細胞活體成像靈敏度的影響 向裸鼠皮下接種腫瘤細胞后，再腹腔注射熒光素酶底物（濃度為15 mg/ml）200 μl。根據(jù)細胞實驗的優(yōu)化配比，計算出裸鼠注射的ATP緩沖液適宜濃度為150 μM，注射量為200 μl。隨機選擇一只裸鼠注射ATP緩沖反應液，10 min后開始行活體成像儀檢測。從生物發(fā)光與X光模式疊加圖像可見，裸鼠皮下接種的細胞在與底物反應后能夠檢測到發(fā)光信號，成像圖顯示兩只裸鼠均能夠直接檢測到右后肢接種的腫瘤細胞的存在（圖3A）。光強度分析數(shù)據(jù)顯示，同時注射ATP溶液的裸鼠右后肢腫瘤細胞的發(fā)光強度值為1483024，相比對照鼠的發(fā)光強度484645，表現(xiàn)出明顯增強（圖3B）。另一方面，觀察裸鼠右前肢接種2×105個腫瘤細胞的位置，在注射ATP緩沖反應溶液的實驗鼠可以檢測到弱信號的存在，而對照裸鼠則檢測不到信號，說明外源給予150 μM的ATP緩沖液后能夠明顯提高裸鼠皮下接種腫瘤細胞的發(fā)光強度和檢測靈敏度。

圖3 熒光素酶優(yōu)化報告系統(tǒng)對裸鼠皮下接種HepG2-Luc細胞活體成像的影響

2.4 熒光素酶優(yōu)化報告系統(tǒng)對裸鼠皮下移植瘤生物發(fā)光成像的影響 取現(xiàn)有HepG2-Luc細胞皮下荷瘤裸鼠，進行熒光素優(yōu)化報告系統(tǒng)的驗證分析。由于熒光素酶報告系統(tǒng)的發(fā)光過程遵循一種閃光動力學[8]，發(fā)光速度非?？?，在注射熒光素后的不同時間檢測到的發(fā)光強度會有差異，為了減少拍攝前后本身的信號差異，將其中一只荷瘤裸鼠作為對照鼠（未經(jīng)條件優(yōu)化），對實驗裸鼠進行條件優(yōu)化與否的處理，并同時與對照裸鼠一起進行生物發(fā)光模式拍攝。拍攝分2次進行。第1次，對照與實驗荷瘤鼠均只注射 luciferin（15 mg/mL，200 μl），10 min 后進行拍攝（圖4A）。隨后給予實驗荷瘤鼠優(yōu)化條件—注射 ATP 緩沖反應液（150 μM，200 μl），10 min后與對照荷瘤鼠同時進行第2次拍攝。將實驗鼠和對照鼠腫瘤部位的兩次發(fā)光信號強度進行比較，觀察到不經(jīng)過優(yōu)化的對照鼠第2次拍攝的發(fā)光強度比第1次略有下降，說明隨著時間的延長，生物發(fā)光信號有衰減趨勢；同時，觀察實驗鼠的發(fā)光強度，采用優(yōu)化條件后，實驗鼠腫瘤部位的發(fā)光強度要顯著高于未優(yōu)化時（圖4B）；將對照鼠作為參照，實驗鼠與同時拍照的對照鼠進行信號強度前后比較發(fā)現(xiàn)，未優(yōu)化時的實驗鼠與對照鼠的信號強度比值為0.11，優(yōu)化后的比值為0.67（圖4C），說明采用熒光素優(yōu)化報告系統(tǒng)能夠顯著提高荷瘤裸鼠的生物發(fā)光信號強度，同時能延長活體成像的發(fā)光時間，提高了成像檢測的效率。

圖4 熒光素酶優(yōu)化報告系統(tǒng)對裸鼠皮下移植瘤生物發(fā)光成像的影響

3 討論

早期腫瘤的檢測對于腫瘤發(fā)生學研究和有效的腫瘤治療是至關(guān)重要的。傳統(tǒng)方法主要是通過機械或電子卡尺等物理測量來評估裸鼠接種人類腫瘤后的生長情況。然而，這種方法僅適用于在動物皮下生長的可捫及的腫瘤，而對于較深的腫瘤腫塊或組織原位瘤，則不適合直接測量。經(jīng)典的原位模型對于評價藥物的功效是不切實際的，因為它們需要在每一時間點處死大量動物。同樣，腫瘤轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)和腫瘤負荷的定量需要詳盡的和冗長的組織學分析[1，5]。

有很多熒光素酶生物發(fā)光成像檢測方面的優(yōu)化方法[6-10]，還有針對各種疾病模型的方法學研究改進[11-17]。我們在實際研究中發(fā)現(xiàn)，目前的活體成像檢測過程是僅向目標動物體內(nèi)注射底物溶液，依靠體內(nèi)自身的ATP，即可產(chǎn)生生物發(fā)光現(xiàn)象，再對光信號通過儀器檢測，但當熒光素酶標記細胞構(gòu)建的不是很理想、熒光素酶的表達比較弱或需要深度探測時，其信號就比較弱。經(jīng)過優(yōu)化的熒光素報告系統(tǒng)可以放大檢測信號，縮短前期弱信號的首次出現(xiàn)時間。我們采用內(nèi)源性熒光素酶，分別篩選luciferin和ATP緩沖液的最佳濃度，建立了優(yōu)化的luciferin和ATP緩沖液的最佳配比方法。實驗發(fā)現(xiàn)，無論是在細胞水平還是動物在體內(nèi)，加入適當配比的外源性ATP緩沖液能夠顯著增強生物發(fā)光現(xiàn)象，提高活細胞的檢測靈敏度。