張 瑩，王洪巖，遲 程，徐有青

作者單位:100050北京市 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科

在哺乳細胞，Notch信號通路有4種類型的跨膜受體，分別是 Notch1-4及其 5個配體，即Delta-like 1、3、4（Dll1、Dll3、Dll4），Jagged1（Jag1）和Jagged2（Jag2）[1-4]。在多種炎性疾病的發(fā)病過程中，都存在NOTCH信號通路被異常激活[5-7]，但其在ALD的發(fā)病機制中的作用仍不清楚。本研究體外培養(yǎng)HepG2細胞，加入LPS模擬酒精刺激，檢測HepG2細胞Notch信號通路和LPS-TLR4-NF-ΚB信號通路的“會話”表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)Jag1-Notch1信號通路被LPS激活，LPS結(jié)合TLR4可以通過與Notch信號通路相互作用，增加了NF-ΚB及其炎癥因子的表達。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與細胞 DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素等細胞培養(yǎng)液均購自美國Gibico 公司；LPS、DAPT、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、蛋白提取試劑等購自Sigma公司；BCA蛋白濃度測定檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；Western blot超敏發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑以及QPCR試劑均購自TAKARA公司；抗Notch跨膜受體NICD抗體、抗NF-KB和抗β-actin抗體均購自美國Cell Signaling公司；HepG2細胞株購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細胞庫。

1.2 細胞培養(yǎng)和刺激 取20～30代HepG2細胞，用含有10g/L非必需氨基酸、10g/L谷氨酰胺、1g/L丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)液，加入體積分數(shù)10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。加入LPS模擬酒精刺激，處理時間為48 h:①對照組（培養(yǎng)基）；② LPS組（培養(yǎng)基+LPS 2 μg/ml）。DAPT處理HepG2細胞時，分成4組，處理時間為24 h:①對照組（培養(yǎng)基）；② LPS組（培養(yǎng)基+LPS 2 μg/ml）；③DAPT組（培養(yǎng)基+DAPT 10 nM）；④DAPT+LPS組（培養(yǎng)基+LPS 2 μg/ml+DAPT 10 nM）。

1.3 HepG2細胞NOTCH受體和配體mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法，將HepG2細胞分為兩組，其中一組加入 LPS（2 μg/ml）模擬酒精刺激48 h，分別收集對照組和實驗組細胞，采用TRIzol Reagent RNA提取試劑盒分別提取各細胞總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后通過PCR方法分別檢測NOTCH不同的受體和配體在刺激前后mRNA水平的變化。設(shè)計Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4，Jag 1、Jag 2，Dll 1、Dll 3和Dll 4引物和內(nèi)參引物（表1）。首先檢驗各組有無特異性擴增產(chǎn)物，然后在實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增。擴增條件為:95℃ 3 min，94℃ 30 s，55℃退火 30 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán)。以ΔCt(目的基因)-ΔCt（內(nèi)參基因）計算實驗組和對照組的ΔCt，按照ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）計算mRNA相對水平的差值，即2-ΔΔCt。

表1 Q-PCR引物序列

1.4 HepG2細胞NICD和NF-κB蛋白的檢測 采用Western blot法，細胞經(jīng) LPS、DAPT或者 LPS+DAPT培養(yǎng)過夜，24 h后收集細胞，提取總蛋白并進行其濃度測定，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）。脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜30 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，X膠片曝光，記錄條帶。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepG2細胞Jag 1-Notch 1信號通路因被LPS激活而水平增加 結(jié)果顯示，經(jīng)過LPS刺激48 h之后，NOTCH 1 水平顯著高于對照組（P＜0.001）；同時，LPS也顯著提高了NOTCH通路的配體Jag 1水平（P＜0.001）。盡管NOTCH的另一個配體DLL 4水平也增加了，但是增加的程度遠遠不及Jag 1（P＜0.01，圖 1，表 2），表明 DLL 4 是部分被 LPS 激活。這些結(jié)果顯示LPS主要通過激活Jag 1，導(dǎo)致Notch 1信號通路的激活。

2.2 LPS增加Notch信號通路和NF-κB激活 經(jīng)Western blot檢測Notch-NICD表達發(fā)現(xiàn)，LPS能夠激活NICD表達，表明LPS在增加炎癥反應(yīng)的同時上調(diào)了Notch信號通路蛋白表達。同時，我們檢測了LPS對TLR4-NF-κB驗證信號通路的影響，結(jié)果LPS顯著增強了NF-κB的表達。因此，LPS在激活TLR4-NF-κB炎癥信號的同時也激活了Notch信號通路的表達（圖2）。

圖1 各組細胞NOTCH家族受體及其相對應(yīng)配體mRNA水平比較

表2 各組HepG2細胞Jag 1-Notch 1信號通路mRNA水平變化

圖2 細胞NICD和NF-κB蛋白表達情況 經(jīng)LPS刺激后，Notch和NF-κB蛋白表達增強

2.3 抑制Notch信號通路減少了LPS引起的炎癥信號表達 DAPT是一種γ-分泌酶抑制劑，能間接抑制Notch的活性。我們分別給予HepG2細胞LPS和DAPT處理或同時給予LPS聯(lián)合DAPT處理，細胞孵育24 h后觀察Notch信號通路下游分子NICD和LPS-TLR4炎癥通路NF-κB信號表達情況，結(jié)果LPS處理后NF-κB和NICD表達增加，加入DAPT后NICD和NF-κB蛋白表達較前顯著減少，從而說明抑制Notch通路可以顯著改善LPS-TLR4引起的炎癥反應(yīng)。我們還發(fā)現(xiàn)，僅給DAPT處理，與對照組比，對于Notch的配體NICD和NF-κB無明顯影響，進一步說明Notch信號通路是因為LPS被激活，而抑制NOtCH信號通路可以明顯減少LPS引起的炎癥信號表達增強（圖3）。

圖3 各組細胞NICD和NF-κB蛋白表達情況 在有LPS刺激下，因Notch信號通路被抑制顯著降低了NF-κB的活性

3 討論

近年來，隨著對腸道菌群和益生菌等研究的深入，腸源性內(nèi)毒素血癥在酒精性肝炎發(fā)生進展過程中的作用逐漸受到重視[8-11]。越來越多的研究證實腸源性LPS血癥在ALD發(fā)病過程中有重要作用，ALD嚴重程度與血清內(nèi)毒素水平呈正相關(guān)[12-16]，應(yīng)用抗生素清除腸道細菌能減少內(nèi)毒素血癥的來源，緩解因酒精引起的內(nèi)毒素血癥和酒精性肝損傷[17，18]。慢性酒精中毒導(dǎo)致血漿LPS水平增加，目前對其機制研究主要集中在三個方面:1，腸道革蘭氏陰性細菌數(shù)量增加，從而釋放更多的LPS入血；2，腸道粘膜對LPS通透性增加；3，肝臟庫弗細胞對內(nèi)毒素清除能力降低[19]。當(dāng)LPS作用細胞表面時，Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs），比如 TLR2 和 TLR4 立即感應(yīng)到LPS的存在，從而激活下游信號分子，比如IRAK1/4、TRAF6和NF-κB[2]，這些炎癥信號通路的激活加劇了肝臟的損傷。在ALD大鼠模型，注射LPS能導(dǎo)致大鼠脂肪肝病變的加重，甚至引起大鼠肝組織的炎性壞死。相應(yīng)地，如果抑制腸道內(nèi)陰性桿菌的生長以控制血漿LPS水平，則可減輕肝組織的損傷[20]。

肝內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)在ALD發(fā)病過程中有重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)ALD小鼠模型肝內(nèi)Notch1信號通路成分呈現(xiàn)高表達，并激活NF-κB，擴大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而加劇肝損傷。但是，在體外用酒精處理HepG2細胞時，卻并未發(fā)現(xiàn)Notch1-NF-κB的激活，說明在小鼠模型中是其他的因素激活了Notch1-NF-κB，從而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LPS促進TLR4和Jag1/Notch1的活化，從而激活NF-κB，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)（圖4）。綜上所述，TLR4-NF-κB和 Notch1-NF-κB 這兩條信號通路通過LPS而相互促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并且更重要的是抑制Notch信號可以明顯減少LPS引起的炎癥信號反應(yīng)。本研究為進一步闡明ALD發(fā)病機制和治療肝損傷奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

圖4 HepG2細胞Notch與LPS-TLR4-NF-κB信號通路“會話”模式圖