引言

維生素B2，是人體必需的營養(yǎng)元素[1]，是嬰幼兒等配方奶粉的重要添加物。為了保障科學(xué)定量攝入，準(zhǔn)確定量檢測奶粉中維生素B2對監(jiān)管奶粉營養(yǎng)成分及安全具有重要意義[2]。研制奶粉中維生素B2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不僅可保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，還能為食品、營養(yǎng)學(xué)的分析檢測和研究提供量值溯源保障[3]。本文按照ISO導(dǎo)則35[4]，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察、定值分析和不確定度評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀，美國Agilent；高壓滅菌鍋；恒溫水浴鍋；HCl、NaOH、三水乙酸鈉、冰乙酸，優(yōu)級純；甲醇，色譜純；木瓜蛋白酶；高峰淀粉酶；維生素B2（C17H20N4O6） 標(biāo) 準(zhǔn) 品，CAS號：83-88-5， 純 度≥98%。

1.2 定值方法

取2.0 g樣品于具塞比色管中，加入60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，搖勻，放入高壓滅菌鍋，121℃下保持30min，冷卻。用1 mol/LNaOH調(diào)pH至6.0～6.5，加2 mL混合酶（稱2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶，加水溶解定容至50 mL），搖勻，置37℃恒溫水浴鍋過夜。酶解液加水定容至100 mL，濾紙過濾，取濾液過0.45 μm濾膜待測。

HPLC條 件： C18色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙酸鈉溶液（0.05 mol/L），甲醇溶液（65：35）；流速，1 mL/min；柱溫：30℃；激發(fā)波長462 nm，發(fā)射波長522 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

經(jīng)篩查，選取一款市售奶粉，將奶粉均勻化并分裝為30克/瓶的包裝，置于棕色廣口瓶中，密封，低溫保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值

國內(nèi)10家權(quán)威實(shí)驗(yàn)室采用HPLC法聯(lián)合定值，向各機(jī)構(gòu)隨機(jī)發(fā)送2個(gè)包裝樣品，每個(gè)包裝取3個(gè)子樣，測定平均值作為檢測結(jié)果。按ISO Guide 35(2006)，對定值結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 均勻性檢驗(yàn)

隨機(jī)抽取15個(gè)包裝，進(jìn)行瓶間均勻性檢驗(yàn)；每個(gè)包裝取2個(gè)子樣，進(jìn)行瓶內(nèi)均勻性檢驗(yàn)。用方差分析法判別標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性。

1.6 穩(wěn)定性考察

按照先密后疏的原則，在一定時(shí)間間隔內(nèi)選擇定值方法檢測在規(guī)定條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值隨時(shí)間的變化情況。用t檢驗(yàn)法判別標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性。

長期穩(wěn)定性：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于-20℃儲存，分別在第1、2、3、5、7個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。每次取5個(gè)包裝，每個(gè)包裝取一個(gè)子樣，測3次，計(jì)算平均值，5個(gè)包裝測定結(jié)果平均值作為檢測結(jié)果。

短期穩(wěn)定性：各隨機(jī)抽取5個(gè)包裝分別置于60℃烘箱（模擬運(yùn)輸最高溫度）和-30℃冷凍箱（模擬運(yùn)輸最低溫度），分別在第1、7、13、19天取出進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。檢測方法與長期穩(wěn)定性檢測相同。

1.7 不確定度評價(jià)

1.7.1 均勻性與穩(wěn)定性相對不確定度

用均勻性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，分別計(jì)算均勻性、長期和短期穩(wěn)定性引入的不確定度ubb、urel(lts)、urel(sts)。

1.7.2 定值過程引入的不確定度

由維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品的相對不確定度urel(c)和聯(lián)合定值的相對不確定度u0rel(char)引入。

標(biāo)準(zhǔn)品的相對不確定度來源有：標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量引入的不確定度urel(m)；線性擬合引入的不確定度u1rel(C0)；標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度u2rel(C0)；稀釋引起的不確定度urel(V0)。

1.7.3 擴(kuò)展不確定

擴(kuò)展不確定度通過均勻性、穩(wěn)定性和合成定值過程對特性值總不確定度的貢獻(xiàn)來估算的。

式中，k=2，m為定值的總體平均值。

2 結(jié)果與分析

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2.1 定值結(jié)果

10家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值結(jié)果和定值引入的相對不確定度見表1。統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)全部服從正態(tài)分布，格拉布斯法檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)異常值且無顯著性差異，柯克倫法等精度檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是等精度的，即定值結(jié)果的總體平均值為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果。

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2.2 均勻性檢驗(yàn)

均勻性檢驗(yàn)結(jié)果及其引入的不確定度ubb的結(jié)果見表2。F值＜F0.01(14，15)=3.75，表明在0.01顯著性水平標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中維生素B2含量是均勻的。

2.3 穩(wěn)定性考察

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期、短期穩(wěn)定性考察結(jié)果及其引入的不確定度結(jié)果見表3和4。結(jié)果t值均小于臨界值t(0.05，4)=2.776，認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是穩(wěn)定可靠的。

2.4 不確定度評價(jià)

2.4.1 定值過程引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程引入的不確定度結(jié)果見表5。

2.4.2 擴(kuò)展不確定度

按式（3）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擴(kuò)展不確定度為UCRM=2.445，本文研制的奶粉中維生素B2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為15.7±2.4 mg/kg（k=2）。

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3 結(jié)論

本文研制的奶粉中維生素B2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，定值結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察和不確定度評價(jià)，確保在不同時(shí)間、使用不同包裝的該種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，所使用的量值及不確定度是準(zhǔn)確可靠的。