唐 艷 胡 熠 周 偉 徐大倫 樓喬明 楊文鴿 張進杰

(寧波大學食品與藥學學院/浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211)

可食膜是以天然可食性生物大分子為主要成膜基質，通過流延、吹塑、自然干燥等工藝，借助分子之間的相互作用而形成的一種具有一定力學性能和阻隔性能的薄膜[1]，能夠阻止溶質、水分和氣體等的遷移，保持食品品質，延長食品貨架期。目前，國內外關于可食性膜材料的研究已有大量報道，如用糖類、蛋白質、脂類等生物大分子制膜，其中玉米淀粉可降解購物袋[2]已經完成工業(yè)生產，走進了人們的日常生活。而植物蛋白質因具有安全無毒、生物相容性高及環(huán)境友好等特點，已成為制作新型可食性膜的優(yōu)選材料之一，如大麥醇溶蛋白膜[3]、大豆分離蛋白膜[4]、高粱醇溶蛋白膜[5]等。其中，高粱醇溶蛋白中含有較多的疏水性氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸等)，在水中的溶解度低，制備的蛋白膜對水和氣體均具有良好的阻隔性能[6]。但單一的高粱醇溶蛋白膜較脆，塑性較差，限制了其在食品包裝領域中的應用。為改善高粱醇溶蛋白膜的性能，Giteru等[7]在高粱醇溶蛋白膜中添加活性物質檸檬醛和槲皮素，發(fā)現二者均可改善其性能；后來Giteru等[5]進一步將檸檬醛/槲皮素-高粱醇溶蛋白復合膜用于新鮮雞肉的包裝與儲藏，與對照組相比，復合膜組具有維持和改善雞肉品質的潛力。

研究表明，多酚類物質可與蛋白質發(fā)生相互作用[2]，使得蛋白材料的性能得到改善。郭叢珊等[8]在大豆分離蛋白膜中加入茶多酚，發(fā)現復合膜的拉伸強度和阻水性能顯著提升；張慧蕓等[9]在玉米醇溶蛋白膜中加入丁香酚類物質，改善了蛋白膜的機械性能，增強了蛋白膜的阻隔性和透濕性。丁香酚是自然界中較為常見的一種天然多酚，具有抗菌、抗真菌、殺蟲和抗氧化等良好的生物活性，且酚類化合物和蛋白質共價鍵的交聯(lián)作用很強，熱穩(wěn)定性能更好[2]。目前有關于酚類化合物對高粱醇溶蛋白膜的研究報道非常有限，且主要集中在理化性能，而有關膜的光學屬性、熱特性、微觀結構等反映其變化機理的研究鮮見報道。因此，本研究以高粱醇溶蛋白為原料，甘油、聚乙二醇為增塑劑，添加具有交聯(lián)作用的丁香酚，制備丁香酚-高粱醇溶蛋白可食膜，分析不同濃度丁香酚對可食性高粱醇溶蛋白膜物理性能及微觀結構的影響，并探討其變化機理，旨在為高粱醇溶蛋白應用于可降解、可食性膜新材料的后續(xù)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白高粱粉(食品級，粉末)，購自西安晉恒化工有限公司；丁香酚(純度> 98%，食品級)、無水乙醇(分析純)、焦亞硫酸鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(分析純)，均購自航景生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備

0～10 mm千分測厚規(guī)，蘇州明哲量具有限公司；SpectraMax- i3酶標儀，美國Molecular Devices公司；TA.XT Plus-01質構儀，英國SMSTA公司；200-F3型差示掃描量熱儀(differential scanning calorimentry, DSC)，德國NETZSCH公司；Tensor-27型傅里葉紅外(fourier transform infrared, FTIR)光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高粱醇溶蛋白的提取 參照李曉暉等[10]的方法。取0.5 kg白高粱粉，加入2 L 70%(v/v)乙醇溶液、7 g氫氧化鈉(0.35%，w/v)和10 g焦亞硫酸鈉(0.5%，w/v)作為還原劑，在70℃水浴條件下恒溫振蕩浸提4 h。將所得混合液離心(5 000 r·min-1，10 min)，保留上清液，上清液中加入蒸餾水[<10℃，1∶1(v/v)]沉淀蛋白，用1 mol·L-1鹽酸調節(jié)溶液pH值至5.5 左右，緩慢攪拌溶液直至白色絮狀沉淀逐漸析出。靜置一夜后離心(5 000 r·min-1，10 min)取沉淀，冷凍干燥蛋白沉淀(-20℃)，蛋白沉淀再經正己烷[1∶10(w/v)]脫脂后得到高粱醇溶蛋白，儲藏于干燥器中，備用。

1.3.2 可食用膜的制作 取6.0 g高粱醇溶蛋白，加入1.48 g增塑劑(聚乙二醇∶甘油=1∶1,v/v)和60 mL 85%乙醇溶液，緩慢攪拌均勻后置于80 ± 2℃的水浴鍋中攪拌15 ± 2 min，再于40 ± 2℃的恒溫水浴鍋中冷卻，最后用85%乙醇溶液補充揮發(fā)的乙醇溶液。各試驗組中分別加入0%(對照，CK)、2%、4%、6%、8%(w/w)丁香酚，均質(6 000 r·min-1)2 min后于40℃、100 r·min-1條件下攪拌10 min，以除去氣泡。將成膜溶液緩慢倒在玻璃板上(0.09 g·cm-2)，50 ± 2℃靜止12 h。將干燥成型的膜剝落，在進行理化試驗之前，將膜置于干燥器中48 h，以平衡水分。

1.3.3 可食用膜厚度的測定 利用千分測厚規(guī)測量膜的厚度(精確度：± 0.001 mm)。以膜中心為基準點，在距離中心點等距離的四角隨機取8個點測量膜的厚度，結果取平均值，單位μm。

1.3.4 可食用膜機械性能的測定 利用質構儀測量膜的拉伸應力(tensile stress, TS)、斷裂伸長率(elongation at break, EAB)。將膜剪成60 mm×10 mm的條狀，初始夾距設為40 mm，拉伸速度設為1 mm·s-1。試驗之前將樣品提前24 h放于干燥器中平衡水分。

1.3.5 可食用膜吸光度值的測定 用打孔器取直徑為6 mm的膜樣品緊貼于微孔底部，利用酶標儀測定樣品在200～800 nm范圍內的吸光度值，掃描波長間隔5 mm。

1.3.6 可食用膜水蒸氣透過系數測定 參照McHugh等[11]的方法。在5 mL的小燒杯中加入5 mL去離子水，用可食用膜(4 cm×4 cm)密封燒杯口，然后置于干燥器中。間隔1.5 h稱重一次，得到樣品質量相對于時間變化的斜率。按照公式計算水蒸氣透過系數(water vapor permeability，WVP)：

(1)

式中，WVTR(water vapor transmission rate)為膜的水蒸氣透過率(g·h-1·m-2)，由質量隨時間的變化率除以膜的封口面積(m2)得到；L是膜的平均厚度(mm)；ΔP為膜兩側水蒸氣分壓差(kPa)。

1.3.7 可食用膜的溶解性 參照Ahmad等[12]的方法。取28～32 cm2膜樣品，于105 ± 2℃鼓風干燥箱中烘干至恒重，記為Wi。將樣品浸沒在40 mL去離子水中，用封口膜封住容器口，室溫下浸泡24 h后用濾紙過濾溶液，將濾紙和濾渣于105 ± 2℃鼓風干燥箱中烘干至恒重，記為Wf。按照公式計算膜的水溶性(water solubility，WS)：

(2)

式中，Wi為膜初始重量，Wf為濾渣最終重量。

1.3.8 可食用膜DSC測定 參照Chen等[13]的方法。用分析天平稱取10～15 mg樣品，置于鋁制坩堝中壓片封口，放入DSC儀中。用空鋁皿作為參照，氮氣作為保護氣和吹掃氣，流量分別為60 mL·min-1、20 mL·min-1。以10℃·min-1的升溫速率從20℃加熱至140℃。

1.3.9 可食用膜FTIR光譜儀測定 參照Gu等[14]的方法。稱取0.2 mg干燥至恒重的樣品，加入2 mg溴化鉀在研缽中研磨，取適量研磨均勻樣品壓片，在波長400～4 000 cm-1的范圍內進行掃描，得到樣品在不同波長下的吸光度。

1.3.10 可食用膜二級結構分析 對樣品紅外光譜進行傅里葉變換去卷積，用PeakFit 4.11進行二階導數擬合，得到子峰數目在8～12之間，其殘差(r2)大于0.999。確認峰位歸屬，計算各分峰面積的相對百分含量。

1.3.11 可食用膜掃描電鏡分析 參考鄒小波等[15]的方法。取1 cm×4 cm膜樣品，液氮浸沒后進行人工折斷，將樣品粘貼于金屬圓臺上，真空狀態(tài)下噴金，然后置于掃描電鏡中，電子束加速電壓設為10.0 kV，在放大倍數1.0 K下拍照記錄。

1.3.12 數據分析 試驗數據均為3次重復的平均值，采用SPSS 17.0軟件對數據進行處理，用AVOVA法對數據進行方差分析，Duncan多重檢驗進行數據間的差異顯著性分析(P<0.05)。應用Origin 9.0繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 丁香酚濃度對高梁醇溶蛋白膜機械性能的影響

2.1.1 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜厚度的影響 由表1可知，高粱醇溶蛋白膜的厚度在116.56～136.11 μm范圍內，符合美國材料與實驗協(xié)會(ASTM)的標準(≤250 μm)[16]。隨著丁香酚濃度的增加，蛋白膜的厚度呈先降低后增加的趨勢，當丁香酚濃度為4%時，膜厚度有最小值(116.56 μm)，這是因為在一定濃度范圍內添加丁香酚，高粱醇溶蛋白各組分間的疏水性相互作用降低，蛋白分子與多酚之間的氫鍵作用加強，從而膜內部交聯(lián)更加緊密，膜的厚度降低。結果表明，4%濃度的丁香酚更有利于蛋白分子之間的交聯(lián)。

表1 丁香酚濃度對高梁醇溶蛋白膜厚度、機械性能的影響Table 1 Effect of eugenol concentration on the thickness and mechanical properties of kafirin film

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著 (P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatment at 0.05 level.

2.1.2 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜拉伸強度、斷裂伸長率的影響 由表1所示，對照組(CK)高粱醇溶蛋白膜的TS為111.68 N·mm-1，當丁香酚濃度≤4%時，隨著丁香酚濃度的增加，復合蛋白膜的TS增大；當丁香酚濃度大于4%，隨著丁香酚濃度的增加，復合蛋白膜的TS減小。添加4%丁香酚時，復合蛋白膜的TS值為127.19 N·mm-1，與CK相比，增加了13.89%，這是因為多酚中的羥基和蛋白分子中的氨基酸殘基和羧基結合形成氫鍵，故分子間的作用力增加[17]。丁香酚濃度為4%時，復合蛋白膜的EAB值為190.07%，較CK增加了70.54%。綜上，丁香酚濃度為4%時，丁香酚/高粱醇溶蛋白復合膜的機械性能有最優(yōu)值。

2.2 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜吸光度的影響

由圖1可知，在紫外波長(230～400 nm)范圍內，CK和試驗組蛋白膜均出現一個吸收峰，這是因為高粱醇溶蛋白中含有帶苯環(huán)結構的芳香族氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)，其對紫外光具有一定的吸收能力[2]。添加不同濃度的丁香酚后，吸收峰的吸光度值更高，這是因為丁香酚中的苯環(huán)結構和不飽和鍵對紫外光也具有一定的吸收能力。在可見光波長范圍(400～800 nm)內，隨著波長的增加，蛋白膜的吸光度值逐漸降低，添加不同濃度的丁香酚后，蛋白膜的吸光度值均有不同程度的增加。

注：a、b、c、d、e分別表示0%(CK)、2%、4%、6%、8%丁香酚。Note: a, b, c, d and e indicate 0%(control), 2%, 4%, 6% and 8% eugenol, respectively.圖1 丁香酚濃度對高梁醇溶蛋白膜吸光度的影響Fig.1 Effect of eugenol concentration on absorbance of kafirin film

2.3 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白膜水溶性和水蒸氣透過系數(WVP)的影響

由圖2可知，隨著丁香酚濃度的增大，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的水溶性顯著增加(P<0.05)，當丁香酚濃度為4%時，相比CK，膜的水溶性增加了7.1%，增幅最小，更適合作為高粱醇溶蛋白膜的改性劑。添加不同濃度的丁香酚后，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的水蒸氣透過系數(WVP)無顯著變化，這是因為膜的WVP不僅與膜的性能相關，也受到醇溶蛋白分子中極性基團的共價鍵、丁香酚分子內部羥基及膜中水分子擴散路徑的影響[18]。

注：不同小寫字母表示相同指標不同處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different treatments of the same index.圖2 丁香酚濃度對醇溶蛋白膜水溶性、水蒸氣透過系數的影響Fig.2 Effect of eugenol concentration on water solubility and WVP of kafirin film

2.4 差式掃描量熱儀分析結果

由圖3可知，CK醇溶蛋白膜的Tg值為76.97℃，隨著丁香酚濃度的增加，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的玻璃態(tài)轉變溫度(glass-transition temperture，Tg)值呈先下降后上升的變化趨勢。其中，Tg值下降是因為加入丁香酚，多酚中的羥基與蛋白分子結合形成氫鍵，混合體系的疏水性降低、親水性增加。當丁香酚濃度為4%時，高粱醇溶蛋白復合膜的Tg值有最小值，為60.16℃。

圖3 丁香酚/高粱醇溶蛋白膜DSC熱譜圖Fig.3 DSC thermograms of kafirin films incorporated with eugenol

2.5 傅里葉紅外光譜分析結果

由圖4可知，CK高粱醇溶蛋白膜的酰胺A峰(O-H伸縮振動峰[10])在3 407 cm-1處，隨著丁香酚濃度的逐漸增大，復合膜的酰胺A峰先紅移再藍移，分別為3 398、3 383、3 395、3 397 cm-1。添加不同濃度丁香酚，酰胺B峰(-CH3和-CH的反對稱伸縮振動峰[19])由2 944.8 cm-1小幅度紅移至 2 943.8、2 942.8、2 943.8、2 944.8 cm-1。Herrero等[20]研究發(fā)現-CH峰的位移受氨基酸殘基的疏水性影響，由此表明，添加丁香酚影響了高粱醇溶蛋白氨基酸殘基的疏水性，該結果印證了復合膜的水溶性增加及Tg值降低的變化趨勢。

圖4 丁香酚高粱醇溶蛋白膜傅里葉紅外光譜Fig.4 FTIR spectra of kafirin edible films incorporated with eugenol

2.6 丁香酚濃度對高粱醇溶蛋白二級結構的影響

1 600～1 640 cm-1、1 640～1 650 cm-1、1 650～1 660 cm-1及1 660～1 700 cm-1之間的峰面積分別表征β-折疊、無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉角含量[19]。由圖5可知，隨著丁香酚濃度的增加，復合膜的β-轉角含量增加，當丁香酚濃度為4%時，β-轉角含量出現最大值；α-螺旋、無規(guī)則卷曲含量隨著丁香酚濃度的增加而降低，當丁香酚濃度為4%時，兩者有最小值。這是因為添加丁香酚改變了復合膜內部蛋白質的二級結構，α-螺旋、無規(guī)則卷曲結構轉化成β結構[10]。

圖5 丁香酚高粱醇溶蛋白膜二級結構Fig.5 Content of secondary of kafirin films containing eugenol

2.7 掃描電鏡分析結果

由圖6可知，CK膜的表面和截面粗糙，有較多蛋白顆粒和小孔，蛋白溶解性不好；添加2%丁香酚，膜截面平滑度增加，蛋白顆粒減少了，小孔數量降低了，表明丁香酚與蛋白相容性較好；添加4%丁香酚，膜的微觀結構發(fā)生變化，膜表面小孔數量明顯降低，截面光滑緊致，表明醇溶蛋白與丁香酚分子間結合良好，膜內部分子排列有序；繼續(xù)增加丁香酚濃度，膜截面變得疏松，小孔增多。該結果與機械性能和二級結構的結果相對應，蛋白膜內部小孔數量越少，膜表面越平滑，二級結構中的β結構含量越多，機械性能相對越好[21]。

3 討論

本試驗結果表明，當丁香酚濃度為4%時，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的厚度、水溶性均有最優(yōu)值，同時，顯著提升了膜的TS、EAB，增加了膜對紫外光和可見光的阻隔性，且基本不影響復合膜的WVP。添加一定濃度的丁香酚后，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的TS、EAB增大，表明隨著丁香酚濃度的增加，高粱醇溶蛋白分子間的疏水性相互作用減弱，多酚類物質中的羥基與醇溶蛋白分子中的氨基酸殘基和羧基結合形成氫鍵占據主導，故膜基質內部交聯(lián)更加緊密，膜的強度增加。但當丁香酚濃度超過4%后，蛋白分子周圍聚集大量酚類物質的羥基，打斷了原有醇溶蛋白分子間的有序排列，多肽鏈間的流動性增大，因此膜內部分子之間的交聯(lián)減弱，拉伸應力降低，延展性持續(xù)增加。丁香酚濃度為4%時，膜的EAB值為190.07%，優(yōu)于Giteru等[7]制備的檸檬醛、槲皮素高粱醇溶蛋白膜的EAB(147.0%)。高粱醇溶蛋白是一種疏水性蛋白質，用其制成的蛋白膜結構致密，對環(huán)境中的水蒸氣有很好的阻隔性能，較已經商業(yè)化生產的大豆分離蛋白膜、魚鱗明膠膜，高粱醇溶蛋白膜的阻水性能更好。Otoni等[22]在大豆分離蛋白中加入丁香酚，復合膜的水蒸氣透過系數為1.06 ×10-10g·s-1·m-1·pa-1，是本試驗中高粱醇溶蛋白膜水蒸氣透過系數的13.6倍；Nazmi等[23]用雞皮明膠制作明膠膜，其水蒸氣透過系數高達1.36×10-4g·s-1·m-1·pa-1，為本試驗中高粱醇溶蛋白膜的106倍。膜的吸光度值越高，透光率值越低，光阻隔性能越好。當丁香酚濃度為4%時，丁香酚/高粱醇溶蛋白膜對紫外、可見光的阻隔性能均出現最優(yōu)值。綜上表明，添加4%丁香酚的高粱醇溶蛋白復合膜的性能最優(yōu)。

蛋白分子間的疏水性相互作用使得蛋白分子聚集在一起[24]，從而保證膜內部結構的完整性。在高梁醇溶蛋白中加入丁香酚，隨著多酚濃度的增加(2%、4%)，醇溶蛋白分子中的氨基與羰基同多酚物質中的羥基形成氫鍵，增加了蛋白多肽鏈間的連接，因此FTIR圖中的O-H峰低波數位移，宏觀表現為丁香酚/高粱醇溶蛋白膜的機械性能增大、水溶性增加。Iman等[25]指出，蛋白分子間作用力增強時，會伴隨著吸收峰的紅移，本試驗中分子間相互作用呈現先增強后減弱的趨勢，這與復合膜的拉伸強度變化相一致。本研究中，添加丁香酚后，復合膜的Tg值呈現先降低后增加的變化趨勢。Ghanbarzadeh等[26]研究發(fā)現，親水性強的乳清蛋白膜的Tg值低于玉米醇溶蛋白膜的Tg值，基于此研究，Huo等[27]指出，Tg值和材料的疏水性能成正比。因此，本試驗中添加丁香酚后醇溶蛋白膜的Tg值降低印證了添加丁香酚后復合膜水溶性略微變大的結果。

本研究結果表明，各試驗組膜的表面和截面均含有不同數量的小孔，這是因為高粱醇溶蛋白中含有較多的疏水性氨基酸，在成膜過程中添加的親水能力較強的甘油、聚乙二醇很難與高粱醇溶蛋白中的疏水集團結合[28]，使得部分甘油和聚乙二醇從膜內部遷移到膜的表面，從而在膜的內部形成孔徑，表現為膜截面的小孔。在一定濃度范圍內添加小分子物質丁香酚，復合膜中的氫鍵能較好地降低混合體系內部的吉布斯自由能，使各組分很好的相容[22]，因此，膜表面小孔數量降低。添加4%丁香酚與高粱醇溶蛋白相容性良好，膜截面光滑緊致，表面平整。

4 結論

本試驗結果表明，添加4%(w/w)丁香酚后，丁香酚/高粱醇溶蛋白可食性復合膜的水溶性略微增加，但復合膜的拉伸應力(TS)和斷裂伸長率(EAB)提升，且對紫外光和可見光的阻隔性增加，表明添加丁香酚有利于開發(fā)機械性能高、阻隔性能好、熱穩(wěn)定性能優(yōu)良的高粱醇溶蛋白膜材料，這解決了高粱醇溶蛋白膜材料黏性、延伸性及抗拉強度差的問題，其機械性能可滿足實際生產需要?，F有技術的研究主要是試驗室規(guī)模的操作和在食品中的應用，接下來需進一步優(yōu)化蛋白質膜制備技術，提高可食性膜的物化性質。