楊 旭 楊志玲 譚 美 程小燕

(中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所/浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 富陽 311400)

厚樸(Houpo?aofficinalis)為木蘭科(Magnoliaceae)重要的藥用植物[1]，以干皮和根皮入藥，主要成分為厚樸酚與和厚樸酚，現(xiàn)代藥理研究表明，其酚類成分能有效對抗各類炎癥[2-4]和癌癥[5-7]、保護(hù)心腦血管[8]、抗焦慮[9]、抗驚厥[10]、預(yù)防和治療阿爾茲海默[11]、治療脂肪肝等[12]。厚樸酚與和厚樸酚為新木脂素類成分[13]，有關(guān)其生物合成的分子機(jī)理，調(diào)控該類化合物合成的主要調(diào)控因子及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子等的研究尚鮮見報(bào)道。此外，厚樸為我國傳統(tǒng)的藥用植物，栽培歷史悠久，存在著大量的栽培品種，但大多是未經(jīng)選育的地方品種，遺傳育種基礎(chǔ)研究嚴(yán)重滯后，育種效率較低。因此，開發(fā)合適的生物學(xué)工具以選育優(yōu)良品種對厚樸的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[14]。前人主要針對厚樸藥理學(xué)、栽培技術(shù)等方面進(jìn)行了大量的研究[15-16]，但NCBI網(wǎng)站公布的GenBank數(shù)據(jù)庫顯示，厚樸僅有92個葉綠體基因、4個ITS序列及少量核基因被報(bào)道，基因組數(shù)據(jù)的缺乏、適宜的分子標(biāo)記的缺失嚴(yán)重阻礙了厚樸分子育種工作的進(jìn)程。

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅猛發(fā)展，使植物的遺傳育種工作有了較大的突破[17]。目前，分子標(biāo)記技術(shù)已被成功應(yīng)用于親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析[18]、圖譜構(gòu)建[19]、重要性狀基因的連鎖標(biāo)記[20-21]、關(guān)鍵經(jīng)濟(jì)性狀的輔助育種[22-23]等，且已有關(guān)于運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)對厚樸種群遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系進(jìn)行研究的報(bào)道，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA, RAPD)[24]、擴(kuò)增性片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)[25]、簡單重復(fù)序列間區(qū)標(biāo)記技術(shù)(inter-simple sequence repeat，ISSR)[26]、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)[27]、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related amplified polymorphism，SRAP)[28]及端粒重復(fù)序列擴(kuò)增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)[29]等。由于厚樸SSR標(biāo)記的缺乏，目前僅有13對鵝掌楸的SSR被應(yīng)用于厚樸群體遺傳多樣性的分析研究[30]。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對非模式植物的基因挖掘和分子標(biāo)記的開發(fā)均具有重要意義[31-33]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，大量表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)已成為開發(fā)SSR標(biāo)記的重要資源[34-35]。與傳統(tǒng)的SSR位點(diǎn)開發(fā)技術(shù)相比，以EST為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記具有開發(fā)簡便、信息量高和通用性好等優(yōu)點(diǎn)[35]。EST-SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于藥用植物的種群遺傳分析和圖譜構(gòu)建等研究，如滇重樓(Parispolyphyllavar.Yunnanensis)[36]、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)[37]、大果越橘(Vacciniummacrocarpon)[38]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[39]等。作為重要的藥用植物，厚樸EST-SSR標(biāo)記技術(shù)的研究尚鮮見報(bào)道。本研究基于厚樸轉(zhuǎn)錄組文庫高通量測序結(jié)果，利用MicroSAtellite(MISA)軟件搜索厚樸SSR位點(diǎn)，分析其分布和組成特征，并進(jìn)行初步可用性評價，對厚樸中厚樸酚、和厚樸酚等重要化合物生物合成機(jī)理進(jìn)行探索，以期為厚樸分子輔助選育良種及其基因工程應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所木蘭園栽培的3株不同植株厚樸的根皮、莖皮及葉構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為材料。17個厚樸驗(yàn)證材料來源于中國南部不同省區(qū)的厚樸單株，詳見表1。

表1 17個厚樸來源地地理信息Table 1 Information on seventeen natural populations of H. officinalis

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取、cDNA文庫的構(gòu)建及功能注釋 于2015年5月分別用采樣管采集3個厚樸植株的根皮、莖皮及葉為作為樣本，并立即投入液氮中速凍，-80℃ 保存?zhèn)溆?。RNA的提取選用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物)。將提純后不同組織的厚樸分別在Illumina技術(shù)平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

剔除所有的低質(zhì)量的序列(質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個read的20以上)。測序產(chǎn)生的讀取片段序列經(jīng)過拼接組裝，生成基因組的堿基序列。獲得的測序序列與參考基因組比對后，全面獲得轉(zhuǎn)錄組文庫的特征。

將獲得的轉(zhuǎn)錄組序列與公共數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性分析，并對所得轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能性注釋，所涉及的數(shù)據(jù)庫包括NCBI蛋白質(zhì)序列非冗余(Nr)、Swiss-Prot、GO(gene ontology)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫以及KOG (euKaryotic Ortholog Groups)數(shù)據(jù)庫，通過選擇BLAST參數(shù)E-value≤10-5，對Unigene進(jìn)行功能和代謝通路的注釋[40-41]。

1.2.2 引物的開發(fā) 以厚樸轉(zhuǎn)錄組測序得到的大量序列為參考，利用MISA軟件分析厚樸轉(zhuǎn)錄組的分布頻率和重復(fù)單元特征類型，采用軟件primer3-2.3設(shè)計(jì)引物，主要使用參數(shù)：引物為18～28 bp，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為80～300 bp，退火溫度為55～65℃。引物篩選條件：引物不存在SSR；引物的5′端允許有3個堿基的錯配，3′端允許有1個堿基的錯配；刪除比對到不同Unigene上的引物；SSR finder校驗(yàn)結(jié)果與MISA結(jié)果相同的引物。

1.2.3 基因組總DNA的提取、檢測及引物篩選 采用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物)從葉片中提取總DNA，在NanodropND-2000超微量蛋白核酸測定儀(美國Nanodrop公司)上測定DNA濃度及純度。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果，隨機(jī)挑選出180對退火溫度相近，長度大小合適的SSR引物進(jìn)行初步篩選，引物由上海生工生物工程公司合成，模版為不同來源地厚樸居群核DNA。PCR反應(yīng)體系 25 μl，包括50 ng·μL-1模板DNA 1 μL，10 μmol·L-1引物1 μL，10×Taq Plus PCR Buffer(含20 mmol·L-1Mg2+)2.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL，1 U·μL-1Taq酶1 μL和去離子水19 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性15 s，61～52℃退火15 s，72℃延伸1 min，以上各1個循環(huán)；94℃變性15 s，52℃退火15 s，72℃延伸1 min，23個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在全自動核酸蛋白分析系統(tǒng)Qsep100 進(jìn)行分析。

采用GenAlEx 6.501計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(percentage of polymorphic loci， PIC)、觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles，Na)、有效等位基因數(shù)(effective number of alleles， Ne)、觀測雜合度(observed heterozygosity，Ho)及期望雜合度(expected heterozygosity，He)[42]，并將篩選出的引物序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于Illumina平臺的厚樸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝分析

從厚樸不同組織中分離RNA，并對原始的單端序列(Reads)過濾和組裝，共構(gòu)建了9個cDNA文庫。由表2可知，各組織中Q20的比例均高于Q20規(guī)定的極限值(>80%)，表明測序質(zhì)量較好，盡管厚樸不同組織和個體間序列數(shù)量差異明顯，但序列的長度并不存在顯著差異，各組織平均序列長度為125 kb。

表2 厚樸轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果Table 2 Summary for H. officinalis transcriptome

由圖1可知，9個cDNA文庫中的Unigenes篩選組裝后共得到109 526條非冗余的Unigenes，其有效序列長度大部分介于201～1 644 bp之間，平均長度為 1 023 bp，總長度為112.15 mb。在所有的109 526條基因中，有73 268 條長度介于200～1 000 bp之間，所占比例為66.91%，20 747條的長度在介于1 000～ 2 000 bp之間，所占比例為18.95%，15 478條的長度大于2 000 bp，所占比例為14.14%。

圖1 厚樸轉(zhuǎn)錄組的長度分布Fig.1 Frequency distribution of contig size from H. officinalis

2.2 功能注釋分析

與Nr和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫具有同源性的基因分別有60 361(55.11%)條和39 942(36.47%)條。對所有的序列進(jìn)行根據(jù)GO、KOG和KEGG的功能注釋，共有65 535條序列可注釋到GO數(shù)據(jù)庫，可分為生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分3個不同類別(圖2)。在生物學(xué)過程中，DNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(regulation of transcription，DNA dependent)占據(jù)主導(dǎo)地位，其次是DNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄(transcription， DNA dependent)及防御反應(yīng)(defense response)，主要的分子功能包括ATP綁定(ATP binding)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase)，主要的細(xì)胞組分包括完整的膜(integral membrane)、細(xì)胞核(nucleus)及原生質(zhì)膜(plasma membrane)。共有51 351個Unigene被注釋到25個KOG 功能分類中(圖3)。其中功能預(yù)測(function prediction)為最主要的功能分類，其次是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(signal transduction mechanisms)及翻譯后修飾(posttranslational modification)，蛋白翻轉(zhuǎn)(protein turnover)、分子伴侶(chaperones)，僅有極少數(shù)Unigenes被注釋到細(xì)胞運(yùn)動(cell motility)、 核構(gòu)成和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)(nuclear structure and extracellular structures)。共有273 410個Unigene被注釋到KEGG代謝通路中(圖4)，其中最主要的生物代謝途徑為碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、 氨基酸代謝(amino acid metabolism)和 能量代謝(energy metabolism)。與代謝相關(guān)的序列有 8 107 個，包括氨基酸(15.99%)、核苷酸(6.69%)、碳水化合物(24.98%)、輔酶(4.21%)、脂質(zhì)(16.59%)、無機(jī)鹽(12.72%)等物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝以及次生代謝產(chǎn)物(18.82%)的合成、運(yùn)輸和分解代謝。在次級代謝亞類，有多條途徑參與藥用代謝產(chǎn)物的生物合成，如萜類化合物的生物合成、吲哚類生物堿的合成、黃酮類的生物合成以及苯丙氨酸的生物合成等，其代謝途徑及相關(guān)關(guān)鍵酶在厚樸藥用成分合成中的作用尚有待于進(jìn)一步研究。

2.3 厚樸轉(zhuǎn)錄組中EST-SSR的頻率及分布特點(diǎn)

厚樸轉(zhuǎn)錄組的109 526個Unigene序列中發(fā)現(xiàn)有 25 925 條序列存在27 721個SSR位點(diǎn)，SSR的發(fā)生頻率(含有SSR的Unigene數(shù)目與總Unigene數(shù)目的比值)為23.67%。大部分Unigene只含有1個SSR位點(diǎn)，而3 355個Unigene含有2個及以上的SSR位點(diǎn)，SSR的分布頻率(SSR位點(diǎn)數(shù)與總Unigene數(shù)目的比值)為25.31%。厚樸轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)以二核苷酸重復(fù)單元(48.04%)最多，其次為單核苷酸重復(fù)(26.46%)和三核苷酸重復(fù)(20.45%)，四、五和六核苷酸重復(fù)數(shù)量較少，分別占總數(shù)的1.59%、2.33%和1.11%。厚樸SSR基元的重復(fù)次數(shù)為4～24，其中4～10次重復(fù)為主要類型，有20 027個，占總SSR的72.24%，11～15次重復(fù)的有4 448個，占總SSR的16.06%，16～20次重復(fù)的有3 064個，占總SSR的11.05%，21～24次重復(fù)的有476個，占總SSR的1.71%(圖5)。

圖2 厚樸轉(zhuǎn)錄組的GO注釋Fig.2 Gene ontology classification of assembled unigenes

重復(fù)類型Type of repeatsSSR 數(shù)量Number of SSR頻率Frequency/%平均距離Averagedistance/kb平均長度Averagelength/bp主要重復(fù)單元Main repeat motif單核苷酸Mono-nucleotide7 3366.7015.2915.62A/T、C/G二核苷酸Di-nucleotide13 31812.168.4216.47AG/TC、CT/GA,、AC/TG三核苷酸Tri-nucleotide5 6695.1619.7817.08AGA/TCT、AAG/TTC、CTT/GAAAAT/ATT、ACC/TGG、AAC/GTT四核苷酸Tetra-nucleotide4400.40254.8821.49AAAT/TTTA、AATA/TATT、ATAA/TTAT、GAAA/TTTC五核苷酸Penta-nucleotide6470.59173.3420.16AAAAG/TTTTC、 AGAAA、TGTATTTTAT/AAATA,、AAGAA,六核苷酸Hexa-nucleotide3110.28360.6124.00ATGAAA、GAGCTG、 GCTACG

厚樸轉(zhuǎn)錄組25 924個SSR位點(diǎn)中共包含有374種重復(fù)單元，二～六核苷酸重復(fù)各有12、58、60、108、136種單、二、三核苷重復(fù)基序平均長度較短，分別為15.62、16.47、17.08 bp，四、五、六核苷酸平均長度稍長，分別為21.49、20.16、24.00 bp(表3)。出現(xiàn)頻率最高的2個重復(fù)類型為CT/GA和AG/TC，其次是AGA/TCT和AC/TG(表3)。

由圖6可知，厚樸SSR位點(diǎn)重復(fù)基元長度介于12～275 bp之間，平均長度為19.61 bp，大部分重復(fù)基元長度在12～22 bp范圍內(nèi)，占SSR位點(diǎn)重復(fù)基元總數(shù)的88.21%，長度在23～100 bp之間的SSR位點(diǎn)重復(fù)基元有1 124個，占SSR位點(diǎn)重復(fù)基元總數(shù)的4.39%，長度在100 bp以上的SSR位點(diǎn)重復(fù)基元有341個，占SSR位點(diǎn)重復(fù)基元總數(shù)的1.70%。

圖3 厚樸轉(zhuǎn)錄組的KOG注釋Fig.3 Eukaryotic orthologous groups (KOG) function classification of H. officinalis

圖4 厚樸轉(zhuǎn)錄組的KEGG注釋Fig.4 KEGG pathway classification of H. officinalis transcription

2.4 厚樸轉(zhuǎn)錄組SSR引物的有效性檢測

根據(jù)不同退火溫度、擴(kuò)增產(chǎn)物長度，從最終過濾出的引物中隨機(jī)挑選了180對引物。這些SSR位點(diǎn)包括二～六核苷酸重復(fù)單元。選用17份差異較大的厚樸資源的核DNA為模板對180對引物進(jìn)行擴(kuò)增檢測。180對引物中有104對引物擴(kuò)增出特異性條帶，擴(kuò)增效率為57.78%。從104對篩選出的引物中進(jìn)一步選出21對具有多態(tài)性、條帶清晰、重復(fù)性較好、且所得擴(kuò)增片段與預(yù)期相符的引物。將這21對引物的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank的登陸號分別為(JZ969903～JZ969915，MF420341～MF420343)。這21對EST-SSR引物涵蓋了13個SSR位點(diǎn)。在21對SSR引物中，有些具有一定的細(xì)胞組成，如H630、H687、H696；部分與重要化合物的生物學(xué)合成相關(guān)，如H387、H501和H693，其余引物無明顯的生物學(xué)功能。這些引物被用來評估17個來源于不同種源的厚樸單株的多樣性。21對引物共產(chǎn)生了233個等位基因，Na介于5～18之間，平均值為9，Ne介于2.67～8.73之間，平均值為6.70，He介于0.54～0.89之間，平均值為0.85，Ho介于0～0.68之間，平均值為0.25，PIC介于0.35～0.92之間，平均值為0.83(表4)，表明開發(fā)的厚樸EST-SSR具有很高的多態(tài)性。

表4 厚樸EST-SSR引物序列及特征Table 4 Characterization of 21 EST-SSRs among 17 H. officinalis accessions

表4(續(xù))

圖5 SSR位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)的分布Fig.5 Distribution of the number of repeats

圖6 SSR重復(fù)長度的分布Fig.6 Distribution of the length of repeats

3 討論

隨著生物技術(shù)的不斷更新，越來越多物種的基因組信息得到揭示，包括木蘭科植物鵝掌楸(Liriodendron)[43]、武當(dāng)木蘭(Magnoliasprengeri)[44]等。本研究在厚樸中共挖掘了109 526非冗余Unigenes，經(jīng)與Nr、Swiss-Prot、GO、KOG、KEGG五個數(shù)據(jù)庫比對后，大量的Unigenes獲得了基因注釋。與其他木本植物相比[45-47]，厚樸的轉(zhuǎn)錄獲得的基因數(shù)量及注釋率均較高。近年來，隨著生物學(xué)技術(shù)在藥用植物次生代謝產(chǎn)物研究中的廣泛運(yùn)用，大量藥用植物的生長發(fā)育狀態(tài)和次生代謝產(chǎn)物合成機(jī)理通過轉(zhuǎn)錄組分析得到闡明[48-51]。本研究中KEGG分析結(jié)果顯示，共有1 526條基因被注釋到次生代謝產(chǎn)物合成途徑，這些注釋信息的完成為基因組信息缺乏的厚樸次生代謝產(chǎn)物的生物合成的研究提供了新的方向。

本研究發(fā)現(xiàn)厚樸轉(zhuǎn)錄組中含有SSR位點(diǎn)的序列中，二核苷酸重復(fù)基元是最常見的EST-SSR類型，這與前人對松科(Pinaceae)[52]、鵝掌楸屬(Liriodendron)[53]及木瓜屬(Papaya)[54]等植物的研究結(jié)果一致。在厚樸所有的二核苷酸重復(fù)基元類型中，(AG)n類型最為常見，而(CG)n則相對較少，這與前人對茄子(Solanummelongena)[55]、灰棗(Ziziphusjujube)[56]及鵝掌楸屬等植物的研究結(jié)果一致。三核苷酸重復(fù)基元類型中，(AGA)n最為常見，這與前人對石斛屬(Dendrobium)[57]和蠅子草屬(Silene)[58]的研究結(jié)果一致。厚樸SSR重復(fù)類型中GA)/(AGA)n數(shù)量最多，而(CG)/(CGG)n不常見與已報(bào)道的雙子葉植物的ESTs結(jié)果類似[59-60]。

本研究中，隨機(jī)挑選的SSR引物中有57.70%能擴(kuò)增出清晰的條帶，11.67%的引物具有豐富的多態(tài)性，多態(tài)性信息含量(PIC)為0.83，屬于高PIC等級(PIC>0.5)[61]，表明篩選出的引物具有豐富的多態(tài)性。本研究在厚樸轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)了25 949個SSR位點(diǎn)，大量位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為厚樸及其近緣種遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、比較基因組學(xué)、重要基因的分子結(jié)構(gòu)和功能分析及遺傳育種等工作奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用新一代高通量測序技術(shù)對厚樸不同組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了109 526條厚樸轉(zhuǎn)錄組序列，且大部分可被NR、Swiss-Prot、GO、KOG和KEGG等數(shù)據(jù)庫注釋。通過對厚樸轉(zhuǎn)錄組表達(dá)信息進(jìn)行高通量SSR位點(diǎn)的發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)了25 925條含SSR位點(diǎn)的序列，SSR出現(xiàn)的頻率為23.67%，共發(fā)現(xiàn)了374種堿基重復(fù)模式，CT/GA和AG/TC是主要的雙堿基重復(fù)序列，AGA/TCT和AAG/TTC是主要的三堿基重復(fù)序列。通過對17個厚樸基因型的驗(yàn)證試驗(yàn)，挑選出了21對具有多態(tài)性的引物。本試驗(yàn)結(jié)果為厚樸及近緣種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建及比較基因組等研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。