尚小紅 嚴(yán)華兵 曹 升 肖 亮王 艷 歐昆鵬,*

(1 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西 南寧 530007；2 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

葛根(PuerariaDC.)為豆科多年生植物，是國(guó)家衛(wèi)生部首批公布的藥食同源植物，享有“北參南葛”、“亞洲人參”的美譽(yù)[1]。葛根含有葛根素、黃酮、多糖等多種藥用成分，具有生津止渴、解表退熱、止瀉等功效[2]，且具有維護(hù)心血管系統(tǒng)、抗癌、降血糖等多種藥理活性[3]。此外，葛根還富含淀粉，可作為非糧生物質(zhì)新能源，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。葛根是廣西傳統(tǒng)種植的農(nóng)作物，種質(zhì)資源豐富且具有一定的種植規(guī)模。其中，廣西梧州市藤縣和平鎮(zhèn)是中國(guó)著名的“葛根之鄉(xiāng)”，目前葛根種植面積占全國(guó)的20%，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源和增收渠道[4-5]。同時(shí)，廣西野生葛根資源在各市縣均有廣泛分布，但因過(guò)度采挖導(dǎo)致流失嚴(yán)重。因此，開(kāi)展廣西葛根種質(zhì)資源收集、遺傳多樣性評(píng)價(jià)及利用，對(duì)于推動(dòng)葛根產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，葛根種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析大多采用田間形態(tài)指標(biāo)，如葉形、葉長(zhǎng)、葉寬、葉花紋、葉面皺紋、葉柄色、葉柄粗、節(jié)間長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、莖粗、分枝數(shù)、莖皮色、塊根形狀等進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)[6-8]，但其易受到環(huán)境、主觀判斷等因素的影響，導(dǎo)致鑒定評(píng)價(jià)結(jié)果并不準(zhǔn)確，而分子標(biāo)記鑒定具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(random amplified polymorphic，RAPD)標(biāo)記[9-11]、內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列(inter-simple sequence repeat，ISSR)標(biāo)記[12-13]、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標(biāo)記[14]等技術(shù)已應(yīng)用于葛根遺傳多樣性方面的研究，但目前尚未有針對(duì)廣西地方品種的相關(guān)報(bào)道。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記(start condon targeted polymorphism，SCoT)是首先在水稻上提出的，是以植物基因中的ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性設(shè)計(jì)單引物并對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用簡(jiǎn)單的瓊脂糖分離檢測(cè)的目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù)[15]。SCoT分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、通用性強(qiáng)、成本低廉、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)[16]，目前已廣泛應(yīng)用在桃兒七[17]、葡萄[18]、芒果[19]、土豆[20]、枸杞[21]、龍眼[22]、菠蘿[23]、蘭[24]、柑橘[25]、柳枝稷[26]、鐵皮石斛[27]、菊花[28-29]、南瓜[30]、木薯[31]等多種作物的遺傳多樣性分析、差異表達(dá)基因篩選[32-34]等分子生物學(xué)研究中，但在葛根遺傳多樣性分析上尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究收集了分布于廣西各地的葛根共44份種質(zhì)資源，應(yīng)用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分析，以期為廣西葛根種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)、利用及進(jìn)一步加快廣西葛根品種改良及選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用的試驗(yàn)材料共計(jì)44份葛根種質(zhì)資源(詳見(jiàn)表1)，收集自廣西河池、百色、桂林、賀州、玉林、梧州、來(lái)賓、南寧、防城港和柳州等地，包括5個(gè)栽培品種和39個(gè)野生品種，種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科學(xué)研究基地及廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所育種基地。SCoT引物參照文獻(xiàn)[15]，由上海生工生物工程股份有限公司合成(表2)。植物基因組DNA提取試劑盒、DL M2000、瓊脂糖、核酸染料GelRed、ExTaqDNA聚合酶、50×TAE buffer等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

表 1 供試葛根材料及來(lái)源Table 1 Tested Pueraria materials and their origins

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè) 于2017年5月采集每份葛根種質(zhì)資源的3～5個(gè)無(wú)病蟲(chóng)害單株生長(zhǎng)頂端的幼嫩葉片，置于寫(xiě)好編號(hào)的自封袋后放置于冰盒，帶回廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，-40℃保存?zhèn)溆?。混合葉片并用液氮研磨成粉末后，按照植物基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa，日本)說(shuō)明書(shū)提取各材料的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度及完整性，并用UV-2700紫外分光光度計(jì)(日本島津)檢測(cè)其濃度，稀釋成終濃度為50 ng·μL-1，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選 從供試材料中選取4份形態(tài)學(xué)差異較大的樣品DNA，對(duì)36條SCoT引物進(jìn)行篩選，最終確定穩(wěn)定性、多態(tài)性好且?guī)颓逦?5條引物用于所DNA擴(kuò)增。

1.2.3 SCoT-PCR擴(kuò)增與檢測(cè) 葛根SCoT-PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包括DNA 50 ng，dNTPs 0.25 mmol·L-1，Mg2+1.5 mmol·L-1，引物0.8 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶0.5 U，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL PCR產(chǎn)物，與1 μL 6×Loading buffer混勻后用含有GelRed核酸染色劑的1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，緩沖液為1×TAE，在110 Ⅴ恒電壓下電泳約25 min。電泳結(jié)束后利用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)44份葛根種質(zhì)資源SCoT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，按同一分子量大小的DNA條帶的有無(wú)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，構(gòu)建44份材料的分子標(biāo)記結(jié)果的數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS-pc2.10e軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建樹(shù)狀聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用25條SCoT引物對(duì)44份葛根種質(zhì)資源的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分布在200～3 000 bp之間，共擴(kuò)增出223條清晰的條帶，每條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)在3～15之間，平均每條引物能擴(kuò)增出8.92條。多態(tài)性條帶合計(jì)194條，平均每條引物擴(kuò)增出7.76條差異性條帶，多態(tài)性比率高達(dá)86.99%。其中，SC2、SC4、SC5、SC12、SC13和SC21這6條引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶比率達(dá)到100%，引物SC35擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性比率最低，為50%(表2)。擴(kuò)增結(jié)果表明，利用SCoT標(biāo)記對(duì)葛根種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物表現(xiàn)出條帶豐富、背景清晰干凈、重復(fù)性好且多態(tài)性高的特點(diǎn)(圖1)。

表2 25條SCoT引物的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息Table 2 Amplification results and polymorphism information of 25 SCoT primes

注：1～44編號(hào)同表1。下同。Note: 1-44 are the same as table 1. The same as following.圖1 引物SC22的SCoT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 SCoT-PCR amplification by primer SC22

2.2 相似性分析

將25個(gè)引物對(duì)44份葛根材料擴(kuò)增的條帶對(duì)應(yīng)的原始數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入NTSYS-pc2.10e軟件中，計(jì)算出各材料之間的遺傳相似系數(shù)，所有葛根供試材料之間的遺傳相似系數(shù)范圍在0.587～0.982之間。25號(hào)與26號(hào)材料的相似系數(shù)最高，為0.982，二者與24號(hào)材料的相似系數(shù)均為0.973，三者均為來(lái)自廣西百色老山的材料；其次為28號(hào)與29號(hào)材料，二者的相似系數(shù)高達(dá)0.973，二者與27號(hào)材料的相似系數(shù)均為0.946，三者均為來(lái)自桂林會(huì)仙的材料，同時(shí)，27號(hào)材料與來(lái)自桂林平樂(lè)的30號(hào)材料相似系數(shù)高達(dá)0.955；來(lái)自廣西百色田林的7號(hào)與8號(hào)材料，相似系數(shù)為0.951；來(lái)自梧州藤縣的10號(hào)材料與來(lái)自桂林陽(yáng)朔的11號(hào)材料，相似系數(shù)為0.946。14號(hào)與37號(hào)材料的遺傳相似系數(shù)最低，僅為0.587，表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；37號(hào)與4號(hào)材料的遺傳相似系數(shù)為0.601；37號(hào)與12號(hào)材料的遺傳相似系數(shù)為0.605。

2.3 聚類(lèi)分析

由圖2可知，在遺傳相似系數(shù)為0.65水平時(shí)，可將44份葛根材料分為兩大類(lèi)，第一類(lèi)只包含一個(gè)材料，即37號(hào)材料，其他43份材料歸為一類(lèi)。在遺傳相似系數(shù)為0.74水平時(shí)，可將第二大類(lèi)的43份葛根材料分為5個(gè)亞組，其中，第Ⅰ亞組包含了32份材料，占所有種質(zhì)資源的72.7%；第Ⅱ亞組包含2號(hào)、4號(hào)、20號(hào)、6號(hào)和9號(hào)共5份材料；第Ⅲ亞組包含35號(hào)、36號(hào)和39號(hào)共3份材料；第Ⅳ亞組包括21號(hào)和22號(hào)共2份材料；第Ⅴ組只有14號(hào)1份材料。綜上，通過(guò)SCoT標(biāo)記技術(shù)可以將44份廣西葛根種質(zhì)資源完全區(qū)分。

3 討論

種質(zhì)資源是進(jìn)行品種選育的材料基礎(chǔ)，遺傳多樣性的高低決定了物種的基因豐富程度。分子標(biāo)記技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析[21]。SCoT分子標(biāo)記技術(shù)為通用型引物，適用于各種作物，如多態(tài)性條帶比率在葡萄中高達(dá)93.1%[18]，在菊科作物中高達(dá)90.43%[27]，在柳枝稷中達(dá)到90.3%[26]，多態(tài)性條帶比率在柑橘中最低，為54.8%[25]。周精華等[11]利用RAPD技術(shù)對(duì)來(lái)自湖南和江西的8份葛根種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析，平均多態(tài)性比率為65.65%；景戌等[9]利用RAPD標(biāo)記對(duì)12份重慶地區(qū)的葛根進(jìn)行了遺傳多樣性分析，平均多態(tài)性比率為64.41%；郭艷艷等[12]利用ISSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自廣西、云南、江西和湖北4個(gè)地區(qū)的11份葛根種質(zhì)資源進(jìn)行了多態(tài)性及聚類(lèi)分析，平均多態(tài)性比率為63.9%；陳大霞等[14]利用SRAP標(biāo)記對(duì)18個(gè)粉葛栽培種進(jìn)行遺傳多樣性分析，平均多態(tài)性比率為63.9%。本研究采用25條SCoT引物對(duì)44份廣西葛根種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，檢測(cè)出了豐富的差異條帶，平均多態(tài)性比率高達(dá)86.99%。本研究采用SCoT技術(shù)所獲得的多態(tài)性比率高于利用RAPD、ISSR和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，說(shuō)明SCoT標(biāo)記對(duì)葛根種質(zhì)資源具有較高的鑒別能力，可進(jìn)一步應(yīng)用于葛根遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種等研究。

圖2 44份葛根材料的SCoT分子聚類(lèi)圖Fig.2 Dendrogram of 44 Pueraria accessions by SCoT molecular markers

本研究中44份供試葛根材料來(lái)自廣西不同區(qū)域，SCoT聚類(lèi)結(jié)果表明，葛根種質(zhì)資源的親緣關(guān)系與其來(lái)源地具有一定的相關(guān)性，但并不完全相關(guān)。如來(lái)自河池的1號(hào)與3號(hào)材料，來(lái)自百色田林的7號(hào)與8號(hào)材料，來(lái)自百色老山的24號(hào)、25號(hào)和26號(hào)材料，來(lái)自桂林會(huì)仙的27號(hào)、28號(hào)、29號(hào)和30號(hào)材料，分別聚類(lèi)在一起。但來(lái)自同一地域的材料，如來(lái)自河池的1號(hào)、36號(hào)和37號(hào)材料，來(lái)自桂林的4號(hào)和16號(hào)材料，均未聚類(lèi)在一起，而來(lái)自不同地域的材料，如梧州藤縣的10號(hào)材料和桂林陽(yáng)朔的11號(hào)材料相似度較高，反而聚類(lèi)在一起，表明廣西葛根材料具有一定的豐富度，但不同地域的葛根材料可能存在相互引進(jìn)及交流的現(xiàn)象。這與前人研究結(jié)果[12，14]一致。本研究中，5份栽培葛根材料(10號(hào)、13號(hào)、18號(hào)、38號(hào)和40號(hào))全部聚類(lèi)到第一大類(lèi)的第Ⅰ亞組，其遺傳相似系數(shù)介于0.74～0.89之間，可能是由于長(zhǎng)期馴化和定向選擇導(dǎo)致其遺傳背景較為接近。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)栽培葛根與野生葛根資源聚類(lèi)相互交叉，這與袁燦等[13]的研究結(jié)果一致。其中，栽培種10號(hào)、13號(hào)、18號(hào)和40號(hào)材料分別與野生種11號(hào)、12號(hào)、27號(hào)和41號(hào)材料的遺傳相似系數(shù)均達(dá)到0.90以上，其原因可能是因?yàn)樵耘喔鸶菑倪@些野生葛根資源的優(yōu)良材料中選育而成。37號(hào)材料單獨(dú)聚到一類(lèi)，與其他種質(zhì)資源均有較大的遺傳差異，田間表型鑒定發(fā)現(xiàn)該種質(zhì)資源的葉片為墨綠色，且完全無(wú)毛，與其他種質(zhì)資源的差異性較大，可進(jìn)一步通過(guò)表型鑒定挖掘其在其他方面的特性，開(kāi)發(fā)與葛根相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記等。此外，廣西葛根種質(zhì)間遺傳相似度較高，大部分均達(dá)到0.72以上，說(shuō)明其遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，需要進(jìn)一步加大種質(zhì)資源引種力度，廣泛引進(jìn)區(qū)內(nèi)外葛根種質(zhì)資源及創(chuàng)制新種質(zhì)，豐富種質(zhì)資源的多樣性，為培育優(yōu)良葛根品種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用25條SCoT引物對(duì)44份廣西葛根材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，平均每條引物獲得7.76個(gè)多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為86.99%。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，44份葛根種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)介于0.587～0.982之間。在系數(shù)為0.65處，44份葛根分為兩大類(lèi)，37號(hào)材料單獨(dú)成為一類(lèi)；在系數(shù)為0.74處，可聚為六類(lèi)，表明SCoT分子標(biāo)記適用于葛根種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。本研究結(jié)果為廣西葛根種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)和新品種選育奠定了一定的理論基礎(chǔ)。