林俊俊 郭懷剛 董潔靜 楊克軍 張海燕 李佐同 趙長江 徐晶宇

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心/黑龍江省普通高校寒地作物種質(zhì)改良與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 大慶 163319)

AGO蛋白(Argonaute proteins)是一類龐大的基因家族，通過與小RNA形成復(fù)合體參與植物生長發(fā)育、組織形成、細(xì)胞增殖凋亡、病毒防御、逆境響應(yīng)等多種生物過程[1-2]。AGO指導(dǎo)的基因沉默可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平，其中轉(zhuǎn)錄水平沉默涉及的24～26 nt siRNA可以指導(dǎo)DNA和組蛋白的甲基化修飾，與AGO蛋白形成復(fù)合體指導(dǎo)異染色質(zhì)的組裝；轉(zhuǎn)錄后水平沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)主要與靶mRNA的降解或翻譯抑制相關(guān)[1]。

在真核生物中，RNA沉默與RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RDRs)、Dicer蛋白及AGO蛋白密切相關(guān)[1]。目前已在擬南芥、水稻[3]、玉米[4]、番茄[5]、本氏煙[6]、谷子[7]、葡萄[8]、歐洲油菜[9]等植物中鑒定出編碼這3個(gè)關(guān)鍵組分的基因家族成員。一般情況下，雙鏈sRNA中的一條單鏈即引導(dǎo)鏈(guide strand)會通過PAZ結(jié)構(gòu)域與AGO蛋白結(jié)合，特異性的引導(dǎo)AGO復(fù)合物定位到靶基因處誘導(dǎo)基因沉默，未結(jié)合的另一條鏈被稱為過客鏈(passenger strand)在隨后被降解，也有一些siRNA雙鏈打開后會分別與不同的RISC結(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)對mRNA的切割或阻斷mRNA的翻譯[2]。AGO蛋白在RNA沉默機(jī)制的最后反應(yīng)階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過對SbAGOs蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，AGO蛋白主要由可變N端、PAZ、PIWI和MID 4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，2個(gè)標(biāo)志性的功能域?yàn)镻AZ結(jié)構(gòu)域和C末端的PIWI結(jié)構(gòu)域[3-5]。研究表明，N端可變區(qū)可以在pre-RISC組裝完成后，促進(jìn)sRNA的雙鏈解旋使過客鏈脫離，并隨后阻礙RNA雙鏈的合成，使成熟的RISC穩(wěn)定地行使其功能[10]；PAZ結(jié)構(gòu)域能特異性識別雙鏈sRNA 3′末端懸垂的2個(gè)核苷酸，起到錨定向?qū)ф湹淖饔茫籔IWI結(jié)構(gòu)域具有切割mRNA的催化中心，切割靶mRNA產(chǎn)生3′羥基和5′磷酸的切割產(chǎn)物，該催化中心與RNaseH類似，包含進(jìn)化上保守的催化三聯(lián)體Asp-Asp-His/Asp (DDH/DDD)，在Mg2+輔助下行使切割功能，但并非所有包含DDH的AGO蛋白都具有切割活性，如擬南芥10個(gè)AGO蛋白都具有催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)域，但僅AGO1、AGO4和AGO7被證實(shí)具有切割活性[3]，人的AGO3蛋白具有DDH，但體外試驗(yàn)顯示不具有切割活性[11]；MID結(jié)構(gòu)域能與sRNA 5′端第一位核苷酸結(jié)合，且該核苷酸的磷酸基對siRNA與AGO的親和力有重要作用，失去該核苷酸則親和力減弱，此外，AGO蛋白會在距離5′端10～11位核苷酸的位置對靶RNA進(jìn)行切割，因此siRNA 5′端與AGO的結(jié)合不僅起到錨定作用，而且與切割位點(diǎn)的定位密切相關(guān)[12]。AGO蛋白會根據(jù)熱穩(wěn)定性選擇其中5′端熱力學(xué)不穩(wěn)定的一條為指導(dǎo)鏈[13]，如擬南芥中不同的AGO蛋白對5′核苷酸的選擇有不同的偏好性，因此，至少存在2種機(jī)制來決定AGO蛋白對sRNA鏈的選擇[14]。

AGO蛋白家族成員在不同物種中分布數(shù)量存在較大差異，如裂殖酵母(Schizosccharomycespombe)中僅有1個(gè)AGO蛋白，秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)中有27個(gè)AGO蛋白[15]。在植物中AGO蛋白分布也不均，如萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中有4個(gè)，水稻(OryzasativaL.)有19個(gè)[16-18]。

高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]為禾本科一年生C4草本植物，染色體數(shù)目為10，基因組為730 Mbp，具有抗旱、耐澇、耐鹽堿等特性，且莖稈中糖以單糖形式存在，具有很大的生物質(zhì)能源發(fā)展?jié)摿?。AGOs基因家族在秀麗線蟲、擬南芥、水稻、玉米、雷蒙德氏棉等物種中都已有研究，但關(guān)于高粱的SbAGOs家族尚未見報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法對SbAGOs基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為深入研究AGO蛋白在高粱中的生物學(xué)功能和挖掘高粱抗逆育種靶向基因資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SbAGOs基因家族成員篩選與鑒定

利用已發(fā)表的擬南芥(Arabidopsisthaliana) AtAGOs蛋白序列[4]，同源比對PYTOZOME數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)、GRAMENE數(shù)據(jù)庫(http://www.gramene.org/)和NCBI數(shù)據(jù)庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，以及利用AGOs典型的PAZ和PIWI保守結(jié)構(gòu)域搜索NCBI數(shù)據(jù)庫和PHYTOZOME數(shù)據(jù)庫2種方法分離鑒定高粱SbAGOs基因家族成員。綜合得到的數(shù)據(jù)，在PHYTOZOME和SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)中對非冗余的蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，同時(shí)將具有PF02170(PAZ)和PF02171(PIWI)序列的候選蛋白鑒定為高粱AGO蛋白家族成員。

1.2 AGOs蛋白進(jìn)化分析

利用MEGA6.0軟件對高粱、擬南芥、水稻、玉米、二穗短柄草等物種AGO蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用鄰接(Neighbor-Joining, NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并設(shè)置bootstrap為1 000進(jìn)行檢驗(yàn)，以分析不同物種蛋白系統(tǒng)間的親緣關(guān)系以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

1.3 SbAGOs蛋白間系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA6.0軟件單獨(dú)對15個(gè)高粱AGO蛋白進(jìn)行多重序列比對。采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值為1 000。

1.4 SbAGOs基因結(jié)構(gòu)分析

在GRAMENE數(shù)據(jù)庫中獲得SbAGOs基因CDS序列和全長序列，利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)標(biāo)注分析[19]。

1.5 SbAGOs基因染色體定位分析

通過作物基因組數(shù)據(jù)庫GRAMENE (http://www.gramene.org/)分析SbAGOs在染色體上的位置并采用基于Perl語言的軟件包Circos進(jìn)行可視化分析[20]。

1.6 復(fù)制基因Ka/Ks分析

利用PGDD (http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)分析SbAGOs家族成員間的Ks (同義替換率)與Ka (非同義替換率)，結(jié)合染色體定位，解析串聯(lián)或片段重復(fù)事件以及復(fù)制發(fā)生時(shí)間[21]。

1.7 SbAGOs蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

采用Predictprotein (https://www.predictprotein.org/)預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)并利用CNRS進(jìn)行SOPMA (http://pbil.ibcp.fr/)預(yù)測蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)所占的比例。應(yīng)用SwissModel(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.8 SbAGOs蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析

蛋白的等電點(diǎn)、分子量采用Expasy ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行分析，并用WoLF PSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析。

1.9 SbAGOs蛋白結(jié)構(gòu)域分析

采用InterProScan 5 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/)進(jìn)行SbAGOs蛋白結(jié)構(gòu)域分析。利用DNAMAN軟件比對擬南芥、高粱和水稻PIWI結(jié)構(gòu)域中的典型催化三聯(lián)體。

1.10 SbAGOs基因在不同組織器官和生長發(fā)育階段的表達(dá)分析

利用PHYTOZOME數(shù)據(jù)庫對注釋的SbAGOs進(jìn)行表達(dá)量FPKM分析，并利用Multiexperiment Viewer 4 (MeV4)進(jìn)行聚類熱圖的繪制，聚類分析的距離矩陣為默認(rèn)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)(pearson correlation)。

1.11 干旱和高溫逆境下SbAGOs表達(dá)分析

利用NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得高粱以盆栽控水的方式持續(xù)干旱14 d、高溫50℃處理3 h及干旱與高溫復(fù)合逆境處理的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)(登陸號: GSE48205)[22]。利用R語言對其進(jìn)行芯片間校正處理(between array normalize)并進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出|logFC|>1、P 值<0.05的SbAGOs，利用pheatmap軟件包進(jìn)行熱圖繪制。

1.12 SbAGOs啟動子區(qū)順式作用元件分析

利用權(quán)重矩陣模型(position weight matrix, PWM)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(transcription factor binding stie，TFBS)預(yù)測，軟件包為Bioconductor-TFBSTools (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/TFBSTools.html)和JASPAR2016(http://jaspar.genereg.net)[23]，運(yùn)行JASPAR2016時(shí)，物種借用最為完善的擬南芥(Taxonomy ID:3702)數(shù)據(jù)庫，相似度分?jǐn)?shù)篩選條件為大于0.95；結(jié)合SbAGOs基因上游2 000 bp序列，基于PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)查找激素相關(guān)的應(yīng)答序列，并利用Multiexperiment Viewer 4(MeV4)進(jìn)行聚類圖的繪制,聚類方式為層次聚類(hierarchical clustering, HCL)，聚類分析的距離矩陣為默認(rèn)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物AGOs蛋白進(jìn)化分析

在高粱全基因組水平鑒定獲得非冗余的SbAGOs蛋白家族成員15個(gè)，根據(jù)它們與擬南芥中同源基因的親緣關(guān)系對它們進(jìn)行命名，然后選擇高粱、水稻、擬南芥、玉米和二穗短柄草總計(jì)77個(gè)AGOs蛋白進(jìn)多重序列比對，并采用NJ算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖1可知，植物AGO蛋白分為3個(gè)亞族，亞族Ⅰ包含11個(gè)SbAGOs、3個(gè)AtAGOs、13個(gè)OsAGOs、9個(gè)BrAGOs和11個(gè)ZmAGOs蛋白；亞族Ⅱ包含2個(gè)SbAGOs、4個(gè)AtAGOs、4個(gè)OsAGOs、4個(gè)BrAGOs和3個(gè)ZmAGOs蛋白；亞族Ⅲ包含2個(gè)SbAGOs、3個(gè)AtAGOs、2個(gè)OsAGOs、3個(gè)BrAGOs和3個(gè)ZmAGOs蛋白。其中，擬南芥AGO分組與以往研究相同，各亞族間分布較為一致，SbAGOs、OsAGOs、BrAGOs和ZmAGOs的分類相似，多數(shù)集中分布于第Ⅰ亞族，第Ⅱ、第Ⅲ亞族數(shù)量分布較少且相似?？傮w來看，供試物種間中SbAGOs和ZmAGOs蛋白親緣關(guān)系最接近。

2.2 基因結(jié)構(gòu)分析

結(jié)合SbAGOs系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2-A)，將SbAGOs家族各成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(圖2-B)，發(fā)現(xiàn)該家族成員基因結(jié)構(gòu)存在相似性，主要分為兩類：第Ⅲ亞族SbAGO3和SbAGO7為一類，只有3個(gè)外顯子；第Ⅱ亞族SbAGO4和SbAGO6為一類，都具有22個(gè)外顯子；其他家族成員屬于第Ⅰ亞族，外顯子數(shù)量介于19～24之間。

2.3 SbAGOs基因在染色體上的定位

15個(gè)SbAGOs分布于高粱Chr1、Chr2、Chr4、Chr6、Chr8、Chr9和Chr10染色體上(圖3)，SbAGOs多數(shù)遠(yuǎn)離中心粒，定位于染色體兩端。其中Chr1上呈簇狀分布，有SbAGO5-1、SbAGO5-3、SbAGO5-4、SbAGO5-6和SbAGO7共5個(gè)基因，Chr4和Chr8僅有1個(gè)SbAGO基因。

2.4 SbAGOs基因Ka/Ks以及復(fù)制發(fā)生時(shí)間分析

鑒定出的3對重復(fù)基因，包括SbAGO1-1和SbAGO1-3、SbAGO1-3和SbAGO1-4、SbAGO5-2和SbAGO5-4，結(jié)合它們在染色體上的分布情況，判斷均以片段重復(fù)的方式實(shí)現(xiàn)進(jìn)化，重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于0.2(表1)，表明片段復(fù)制發(fā)生后高粱基因經(jīng)歷了強(qiáng)烈的純化選擇作用，它們的基因功能并未發(fā)生嚴(yán)重的分化。SbAGOs基因家族基因重復(fù)事件發(fā)生的時(shí)間為80.669 2～224.061 5 Mya(million years ago)。

2.5 SbAGOs蛋白高級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及其二級結(jié)構(gòu)所占比例分析顯示，無規(guī)卷曲所占比例最高，α螺旋所占比例也較多，SbAGOs蛋白N端主要由延長鏈構(gòu)成，C端主要分布為螺旋結(jié)構(gòu)(圖4-A)。三級結(jié)構(gòu)分析也表明，SbAGOs蛋白含有多個(gè)延長鏈、無規(guī)卷曲、螺旋等結(jié)構(gòu)，保守的3個(gè)氨基酸殘基均位于蛋白內(nèi)部凹陷處，與其行使功能的部位相一致，其中第1個(gè)保守氨基酸殘基位于β-折疊內(nèi)部，第2個(gè)保守氨基酸殘基位于β-折疊末端，第3個(gè)保守氨基酸殘基位于α-螺旋內(nèi)部(圖4-B)。

表1 復(fù)制基因信息Table 1 Informations of gene duplication

注：Sb：高粱；At：擬南芥；Os：水稻；Zm：玉米；Bd：二穗短柄草。Note:Sb:Sorghum bicolor. At：Arabidopsis thaliala.Os:Oryza sativa. Zm:Zea mays L. Bd:Brachypodium distachyum (L.).圖1 不同物種AGOs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 AGOs protein phylogenetic tree of different species

2.6 SbAGOs蛋白理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位分析

由表2可知，SbAGOs蛋白長度從867 aa(SbAGO5-6)～1 255 aa (SbAGO5-4)不等，平均分子量113.4 kDa，等電點(diǎn)為8.64～9.75，說明SbAGOs蛋白帶正電荷。亞細(xì)胞定位分析表明，大部分SbAGOs定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，與其他物種中該類蛋白的亞細(xì)胞定位一致；SbAGO1-1、SbAGO1-4、SbAGO5-1、SbAGO5-4和SbAGO5-6部分定位到葉綠體，表明它們可能在葉綠體中行使特殊的功能來發(fā)揮作用。

2.7 SbAGOs蛋白結(jié)構(gòu)域及PIWI中保守催化三聯(lián)體序列分析

利用InterProScan 5分析發(fā)現(xiàn)，SbAGOs同時(shí)具有PIWI(PF02171)、PAZ(PF02170)、Argonaute蛋白N-末端結(jié)構(gòu)域 (PF16486)、DUF1785 (SM01163)、AGO蛋白接頭2結(jié)構(gòu)域 (PF16488)和核糖核酸酶H結(jié)構(gòu)域 (SSF53098)；而Argonaute蛋白甘氨酸富集結(jié)構(gòu)域 (PF12764)為SbAGO1-1、SbAGO1-2和SbAGO1-3所特有；SbAGOs 家族成員中僅有 SbAGO1-3、SbAGO3、SbAGO5-3和SbAGO7不具有MID(PF16487)結(jié)構(gòu)域。通過分析結(jié)構(gòu)域所包含的核苷酸區(qū)域發(fā)現(xiàn)，PIWI結(jié)構(gòu)域與核糖核酸酶H結(jié)構(gòu)域重疊，表明PIWI結(jié)構(gòu)域可能具有核糖核酸酶活性；分析PIWI結(jié)構(gòu)域中保守的催化三聯(lián)體序列發(fā)現(xiàn)，SbAGO5-6缺失第1個(gè)保守氨基酸殘基，后2個(gè)氨基酸殘基為DQ；SbAGO3催化三聯(lián)體部位呈現(xiàn)出的氨基酸殘基為DDD；其余SbAGOs催化三聯(lián)體部位呈現(xiàn)出的氨基酸殘基保守性極強(qiáng)，均為典型的DDH功能性殘基序列(圖5)。

圖2 SbAGOs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化及編碼基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Phylogenetic tree of SbAGOs protein and its gene structure

注：染色體內(nèi)的紅色線段代表SbAGOs所在的位置，藍(lán)色連線代表發(fā)生片段重復(fù)的基因；10個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字分別對應(yīng)高粱的10條染色體。Note: The red line within chromosomes represents the location of SbAGOs, the blue line indicates segmental duplication. 10 Arabic numerals correspond to 10 chromosomes of sorghum, respectively.圖3 SbAGOs基因染色體定位Fig.3 Chromosome location of SbAGOs genes

2.8 SbAGOs在不同組織器官和生長發(fā)育階段的表達(dá)量分析

通過對SbAGOs在不同組織器官和生長發(fā)育階段表達(dá)量的聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，SbAGO1-1、SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO4在高粱生長發(fā)育階段表達(dá)量較高，尤其是SbAGO1-1、SbAGO1-2幾乎在各個(gè)生長階段都有表達(dá)，SbAGO1-1與SbAGO1-2、SbAGO1-3與SbAGO4的表達(dá)時(shí)期以及各時(shí)期的表達(dá)量變化基本一致。

2.9 逆境脅迫下SbAGOs的表達(dá)量分析

下載的GEO數(shù)據(jù)經(jīng)過校正處理后，得到的數(shù)據(jù)再進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出SbAGOs表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行熱圖繪制，高溫處理得到SbAGO1-3、SbAGO1-1、SbAGO5-2、SbAGO3和SbAGO1-4共5個(gè)差異表達(dá)基因(圖7)；僅干旱處理未得到任何SbAGOs差異表達(dá)基因；高溫與干旱復(fù)合逆境處理得到SbAGO1-2、SbAGO5-6、SbAGO1-3、SbAGO1-1、SbAGO3、SbAGO5-2和SbAGO10共7個(gè)差異表達(dá)基因(圖8)；2個(gè)處理組都具有的差異表達(dá)基因?yàn)镾bAGO1-3、SbAGO1-1、SbAGO5-2和SbAGO3，表達(dá)量變化趨勢相同，其中SbAGO1-3、SbAGO1-1呈下調(diào)表達(dá)趨勢，SbAGO5-2、SbAGO3呈上調(diào)表達(dá)趨勢。

表2 SbAGOs蛋白的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位Table 2 Physical and chemical properties and subcellular localization of SbAGOs proteins

注：Chlo: 葉綠體; Mito: 線粒體; Nucl: 細(xì)胞核; Cyto: 細(xì)胞質(zhì); Pero：過氧化物酶體； ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

Note: Chlo: Chloroplast. Mito: Mitochondria. Nucl: Nucleus. Cyto:Cytoplasm. Pero: Peroxisome. ER: Endoplasmic reticulum.

圖4 SbAGOs蛋白二級結(jié)構(gòu)及各結(jié)構(gòu)所占比例(A)和SbAGOs三級結(jié)構(gòu)(B)分析Fig.4 Secondary structure and proportion (A) and teriary structure (B) of SbAGOs proteins

2.10 SbAGOs順式作用元件分析

通過預(yù)測SbAGOs啟動子序列上的TFBS，發(fā)現(xiàn)與干旱和高溫密切相關(guān)的有bZIP、AP2/EREBP、bHLH、WRKY、MYB和NAC轉(zhuǎn)錄因子(表3)；通過分析順式作用元件中與激素相關(guān)的應(yīng)答序列，發(fā)現(xiàn)SbAGOs的表達(dá)可能受到脫落酸、茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素、赤霉素、乙烯等激素的調(diào)節(jié)(圖9)。

注：黑色箭頭所示為PIWI結(jié)構(gòu)域的3個(gè)保守的氨基酸殘基Note: The conserved DDH triad residues of PIWI domain are highlighted with black downward arrows.圖5 AtAGOs、OsAGOs、SbAGOs的3個(gè)保守的氨基酸殘基序列比對分析Fig.5 Sequence alignment analysis of three conserved amino acid residues of AtAGOs, OsAGOs and SbAGOs.

基因名Gene nameAP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子AP2/EREBP transcription factorsbHLH轉(zhuǎn)錄因子bHLH transcription factorsWRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY transcription factorsMYB轉(zhuǎn)錄因子MYB transcription factorsNAC轉(zhuǎn)錄因子NAC transcription factorsbZIP轉(zhuǎn)錄因子bZIP transcription factorsSbAGO1-11148SbAGO1-213SbAGO1-321021SbAGO1-43134SbAGO 3828382SbAGO 4111SbAGO5-1821SbAGO5-24818SbAGO5-3292021SbAGO5-412236112SbAGO5-591225SbAGO 6161SbAGO 713SbAGO 10591

注：空白表示未發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。

Note: Blank indicates no corresponding transcription factors

注：1：開花期下方圓錐花序；2：開花期下方處于生長狀態(tài)的葉片；3：開花期上方處于生長狀態(tài)的葉片；4：谷物成熟期下方處于生長狀態(tài)的葉片；5：花蕾形成期花梗；6：幼嫩期2 mm的莖；7：花蕾形成期上方處于生長狀態(tài)的節(jié)間；8：花蕾形成期圓錐花序；9：營養(yǎng)生長期中部卷葉；10：幼嫩期下方葉片；11：幼嫩期上方葉片；12：營養(yǎng)生長期上方卷葉；13：幼嫩期處于生長狀態(tài)的葉鞘；14：幼嫩期表層根系；15：開花期旗葉1節(jié)間；16：開花期莖中部節(jié)間；17：花蕾形成期上方處于生長狀態(tài)的葉片；18：花蕾形成期下方處于生長狀態(tài)的葉片；19：谷物成熟期旗葉1節(jié)間；20：谷物成熟期莖中部節(jié)間；21：花蕾形成期處于生長狀態(tài)的葉鞘；22：營養(yǎng)生長期1 cm的莖；23：花蕾形成期處于生長狀態(tài)的節(jié)間；24：花蕾形成期成熟節(jié)間；25：開花期上方圓錐花序；26：開花期處于生長狀態(tài)的葉鞘；27：谷物成熟期處于生長狀態(tài)的葉鞘；28：營養(yǎng)生長期下方卷葉；29：營養(yǎng)生長期表層根系；30：幼年嫩期底層根系；31：花蕾形成期中層根系；32：營養(yǎng)生長期底層根系；33：花蕾形 成期底層根系；34：開花期底層根系；35：谷物成熟期底層根系。Note: 1:Below panicle in flowering stage.2:Below growing leaves in flowering stage.3: Upper growing leaves in flowering stage. 4: Below growing leaves in grain maturity stage. 5: Peduncle in floral initiation stage. 6: 2 mm stem in immature stage.7: Upper growing internode in floral initiation stage. 8: Panicle in floral initiation stage. 9:Central rolled leaves in vegetative growth stage .10:Below leaves in immature stage. 11: Upper leaves in immature stage. 12: Upper rolled leaves in vegetative growthstage.13: Growing leaf sheath in immature stage.14: Surface root in immature stage.15: Leaf flag 1 internode in flowering stage.16: Stem mid internode in flowering stage.17: Upper growing leaves in floral initiation stage. 18:Below growing leaves in floral initiation stage.19: Leaf flag 1 internode in grain maturity stage. 20: Stem mid internode in grain maturity stage. 21: Growing leaf sheath in floral initiation stage.22: 1 cm stem in vegetative growth stage.23:Growing leaf sheath in floral initiation stage.24: Mature internode in floral initiation. 25: Upper panicle in flowering stage. 26:growing leaf sheath in flouring stage.27: Growing leaf sheath in grain maturity .28:Below rolled leaves in vegetative growth stage.29: Surface root in vegetative growth stage.30: Bottom root in immature stage.31:Middle root in floral initiation stage.32: Bottom root in vegetative growth stage.33: Bottom root in floral initiation stage.33: Bottom root in flowering stage. 35: Bottom root in grain maturity stage. 圖6 SbAGOs基因在不同組織器官和生長發(fā)育階段表達(dá)譜Fig.6 The expression profile of SbAGOs genes in different tissues and developmental stages

圖7 高溫處理后的高粱SbAGOs表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析Fig.7 Microarray data analysis about SbAGOs under high temperature stress

圖8 干旱與高溫復(fù)合逆境處理后的高粱SbAGOs表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)分析Fig.8 Microarray data analysis about SbAGOs under drought and high temperature stress

圖9 SbAGOs基因啟動子激素相關(guān)順式作用元件分析Fig.9 Cis-acting element related to hormone in SbAGOs promoters

3 討論

在植物的營養(yǎng)生長和生殖生長階段，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)通常與轉(zhuǎn)錄水平的RNA干擾(RNAi)和染色質(zhì)水平的轉(zhuǎn)錄沉默機(jī)制相關(guān)，AGOs蛋白在這2個(gè)過程中均起著重要作用[1]。AGOs蛋白首先于植物中被證實(shí)，家族成員被鑒定出具有PAZ和PIWI結(jié)構(gòu)域。Yigit等[15]鑒定出水稻有19個(gè)AGOs蛋白，約為擬南芥的2倍，玉米有18個(gè)AGOs蛋白，與水稻[4]差異不大。本研究首次在高粱全基因組水平分離15個(gè)SbAGOs蛋白家族成員，數(shù)量僅次于水稻和玉米。

擬南芥是首個(gè)完成基因組序列測定的高等模式植物。植物中有關(guān)對于AGO蛋白的研究主要來源于擬南芥，其基因組編碼10個(gè)AGO基因，歸屬3個(gè)進(jìn)化枝，AtAGO1、AtAGO4和AtAGO7蛋白已被證實(shí)具有切割活性[24]。AGO1參與miRNA通路、PTGS通路、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)通路以及ta-siRNA通路, 是研究最多的AGO蛋白[25]。AtAGO1是第一個(gè)被證實(shí)參與擬南芥葉片發(fā)育的AGO蛋白；AtAGO2通過催化病毒RNA的裂解實(shí)現(xiàn)抗病毒反應(yīng)[26]，擬南芥ago1和ago2突變體植株對核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)的敏感性顯著增強(qiáng)[27]。AGO10與AGO1同源性最高，存在功能冗余現(xiàn)象，并可作為誘餌結(jié)合miR165/166，從而阻礙AGO1-miR165/166復(fù)合物的形成，解除對HDZIPⅢ基因表達(dá)的抑制作用,調(diào)節(jié)頂端分生組織的生長發(fā)育[28]。在對NMPs和MID結(jié)構(gòu)域親和力的研究中發(fā)現(xiàn)，AtAGO1對尿嘧啶的親和力大于胞嘧啶和嘌呤；AtAGO2對腺嘌呤具有很強(qiáng)的偏好性[29]；AtAGO4與組蛋白以及非CpG位點(diǎn)DNA甲基化相關(guān)，推測其通過形成異染色質(zhì)以抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。Zilberman等[30]也證實(shí)小部分siRNA具有優(yōu)先結(jié)合AtAGO4的能力，暗示AtAGO4可能參與miRNA通路。AtAGO6與siRNA的累積以及RNA指導(dǎo)的DNA甲基化(RdDM)相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默中發(fā)揮作用[24]；AtAGO7參與siRNA通路，與miR390有很強(qiáng)的親和力[31]，AtAGO10與AtAGO1、AtAGO4與AtAGO6分別存在部分功能冗余現(xiàn)象[32]。AGOs蛋白在物種間高度保守，編碼多個(gè)蛋白家族成員，本研究的系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明AGO蛋白家族成員在水稻、高粱、擬南芥中高度保守，暗示AGO蛋白在高粱中也具有功能多樣性。AGOs蛋白都具有PIWI結(jié)構(gòu)域，AGO蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域具有與RNaseH相似的折疊情況,其核酸內(nèi)切酶活性主要與PIWI結(jié)構(gòu)域相關(guān)，RNaseH酶的活性位點(diǎn)包括1個(gè)Asp-Asp-Glu/Asp (DDE/DDD)，該段基序與二價(jià)金屬離子結(jié)合從而行使切割功能，DDH為3個(gè)保守的金屬螯合氨基酸，擬南芥10個(gè)AGO蛋白都具有DDD/DDH，其中AtAGO1、AtAGO4、AtAGO7已被證實(shí)具有切割功能，此外在人、擬南芥和水稻中，均已發(fā)現(xiàn)某些具有保守催化三聯(lián)體的AGOs蛋白不具有催化活性[4,11]，推測高粱AGOs中也存在具有這種性質(zhì)的家族成員。通過PIWI結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，SbAGO5-6 模體為*DQ，不具有保守的催化三聯(lián)體，因而推測其不具有核酸內(nèi)切酶活性而以其他的形式行使其生物學(xué)功能。

基于干旱處理、高溫處理、干旱與高溫復(fù)合逆境處理得到的表達(dá)量表明，SbAGO1-1和SbAGO1-3、SbAGO3和SbAGO5-2為2組逆境處理下的共表達(dá)差異基因，尤其是SbAGO1-3、SbAGO3變化明顯,推測其在高溫逆境中扮演重要角色，進(jìn)化樹上SbAGO1-2、SbAGO1-1、SbAGO3和SbAGO5-2分別與ZmAGO1a、ZmAGO1b、ZmAGO2a和ZmAGO5a親緣關(guān)系較近，比較發(fā)現(xiàn)它們在干旱脅迫下變化趨勢相同，其中SbAGO1-2與ZmAGO1a，SbAGO1-1與ZmAGO1b呈下調(diào)表達(dá)趨勢，SbAGO3與ZmAGO2a，SbAGO5-2與ZmAGO5a呈上調(diào)表達(dá)趨勢[4]，表明該類蛋白參與高粱對高溫、干旱等逆境脅迫的調(diào)控。此外，SbAGOs啟動子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn)，該類基因可能受到AP2/EREBP、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，可能參與植物逆境應(yīng)答調(diào)控。研究表明，SbDREB2可以響應(yīng)外源脫落酸、干旱、高溫、鹽等脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)[33]，DREB在抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中上調(diào)表達(dá)[34-36]；bZIP為堿性亮氨酸拉鏈類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)反應(yīng)，在干旱、鹽脅迫、低溫、高溫[37-38]等逆境脅迫下發(fā)揮作用，其中干旱、低溫和脫落酸脅迫會誘導(dǎo)bZIP表達(dá)上調(diào)，鹽脅迫則誘導(dǎo)其表達(dá)下調(diào)。本研究結(jié)果表明，SbAGOs上分布有與赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯、生長素、水楊酸、乙烯等激素相關(guān)的順式作用元件，植物通過轉(zhuǎn)錄因子、激素等調(diào)節(jié)方式調(diào)節(jié)基因前的順式作用元件，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，SbAGOs上廣泛分布的轉(zhuǎn)錄因子以及激素結(jié)合位點(diǎn)，在一定程度上暗示了SbAGOs可能會受到相應(yīng)的反式作用因子調(diào)節(jié)，進(jìn)而參與植物的抗逆反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高粱15個(gè)SbAGOs編碼基因分別定位于7條染色體上，編碼蛋白序列被分成3個(gè)亞家族，進(jìn)化上發(fā)生過復(fù)制事件。其中，SbAGO1-3、SbAGO1-1、SbAGO5-2和SbAGO3在高粱響應(yīng)高溫和干旱逆境脅迫時(shí)發(fā)揮重要功能；SbAGO1-1、SbAGO1-2、SbAGO1-3和SbAGO4在高粱生長發(fā)育過程中起著重要作用。本研究結(jié)果為揭示SbAGO蛋白功能和發(fā)掘高粱的抗逆育種靶向基因資源提供了一定的理論依據(jù)。