賀榆婷 衛(wèi)云豐 張 潔 郭永正 葉 玲 韓淵懷王興春,3,* 楊致榮,3,*

(1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801；2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西 太谷 030801；3 雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西 太谷 030801；4 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

谷子(SetariaitalicaL.Beauv)為禾本科狗尾草屬一年生草本植物，原產(chǎn)于我國[1-3]。研究表明，谷粒中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)元素[4]。隨著人們生活水平的不斷提高及食品的多樣化和營養(yǎng)化，谷子受到了消費(fèi)者的廣泛青睞。此外，谷子的耐旱能力極強(qiáng)，需水量遠(yuǎn)低于小麥、玉米和高粱等旱生禾本科作物，培育谷子對于應(yīng)對干旱威脅、保障糧食安全具有重要的意義[5-10]。近年來，已有以谷子為模式植物進(jìn)行功能基因組學(xué)研究的報道，但與擬南芥、水稻等模式植物相比，谷子的離體再生困難，遺傳轉(zhuǎn)化效率極低，嚴(yán)重阻礙了谷子基因功能的研究和育種應(yīng)用[11-13]。

1971年Ban等[3]首次利用谷子四分體至單核小孢子期的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出胚性愈傷組織并獲得完整植株。許智宏等[14]于1983年在我國首次以谷子幼穗為外植體進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，并成功獲得了再生植株。此后，Xu等[15]、Rao等[16]和Osuna-Avila等[17]分別以谷子幼穗、成熟胚、莖尖等材料作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)均成功獲得了再生植株。近幾年大量研究者開展了谷子組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的研究[18-20]，其中，Ceasar等[21]利用谷子莖尖直接再生出幼苗，并成功地應(yīng)用于谷子磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究，極大地簡化了谷子組織培養(yǎng)的操作步驟。此外，谷子的近緣野生種狗尾草(Setariaviridis)的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化也取得了成功，為谷子相關(guān)研究提供了借鑒[22-23]。

目前雖然對谷子離體再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立已有相關(guān)研究報道，但谷子離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率仍遠(yuǎn)低于水稻和擬南芥等模式植物[13]。因此，提高谷子離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率對谷子作為模式植物進(jìn)行功能基因組學(xué)研究和遺傳改良具有重要意義[24]。

植物的離體再生可以通過愈傷組織和直接再生2種途徑，與其他植物類似，基因型和培養(yǎng)基成分是決定谷子愈傷組織誘導(dǎo)和離體能否成功的關(guān)鍵[16, 25-28]。因此，本研究選取了90份谷子種質(zhì)資源進(jìn)行離體再生試驗(yàn)，從中篩選出3份高效離體再生材料，進(jìn)一步利用這3份材料進(jìn)行了培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，旨在建立谷子高效離體再生體系，為谷子功能基因組學(xué)研究和遺傳改良奠定一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取中國、印度等19個國家的90份谷子種質(zhì)資源進(jìn)行高效離體再生基因型的篩選。這些材料既包括豫谷1號、晉谷21等生產(chǎn)中大面積栽培的品種，也包括山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧分子育種團(tuán)隊(duì)創(chuàng)制的xiaomi和mop1等超短生育期材料以及一些農(nóng)家品種(具體種質(zhì)信息詳見表1)。

MS培養(yǎng)基購自美國PhytoTechnology Laboratories 公司，貨號 M519。2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D)購自北京Solarbio公司，貨號 D8100。激動素(kinetin, KT)購自德國Sigma-Aldrich公司，貨號 K0753。 反式玉米素(trans-zeatin, ZT)購自北京Solarbio公司，貨號 T8110。萘乙酸(α-naphthalene acetic acid，NAA)購自北京Solarbio公司，貨號 N8010。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(callus induction medium, CIM)采用已報道的谷子或狗尾草組織培養(yǎng)的4個配方，具體配方如下：

CIM1[29]：4.43 g·L-1MS + 30 g·L-1蔗糖 + 35 mg·L-1ZnSO4·7H2O + 0.6 mg·L-1CuSO4·5H2O + 4 g·L-1植物凝膠(phytagel)+ 2 mg·L-12,4-D+ 0.5 mg·L-1KT；

CIM2[26]：4.43 g·L-1MS + 30 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1phytagel + 2 mg·L-12,4-D + 1 mg·L-1ZT；

CIM3[16]：4.43 g·L-1MS + 30 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1phytagel + 2 mg·L-12,4-D + 0.5 mg·L-1KT；

CIM4[30]：4.43 g·L-1MS + 30 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1phytagel + 4.5 mg·L-1NAA + 0.1 mg·L-1KT。

生芽培養(yǎng)基(plant regeneration medium，PRM)和生根培養(yǎng)基(root medium，RM)均采用Eck等[29]的配方。其中，PRM配方為4.43 g·L-1MS + 20 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1phytagel + 0.5 mg·L-1KT；RM培養(yǎng)基的配方為2.215 g·L-1MS + 20 g·L-1蔗糖 + 4 g·L-1phytagel。

培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌20 min，2,4-D、KT、ZT和NAA等激素在滅菌后冷卻至60℃左右時加入。

表1 90份谷子種質(zhì)資源信息Table 1 The information of 90 foxtail millet germplasms

1.2.2 種子消毒及接種 用砂紙將成熟種子表面的谷殼剝?nèi)?注意力度不能太大，以免傷害種子胚)。從中挑選飽滿無損傷的種子進(jìn)行消毒，具體方法：先用75%乙醇浸泡5 min，再用20%次氯酸鈉溶液浸泡20 min，將消毒后的種子在超凈工作臺中用無菌水沖洗5遍，最后將種子置于無菌濾紙上晾干。每個處理組接種5個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿15粒種子，單粒均勻擺放在CIM培養(yǎng)基上，于24～26℃暗培養(yǎng) 20 d 左右。高效離體再生種質(zhì)資源的篩選均采用CIM1進(jìn)行。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 待愈傷誘導(dǎo)15～25 d后統(tǒng)計出愈率，然后挑選質(zhì)量較好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至新的CIM進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每2周繼代1次。按照公式計算出愈率：

出愈率=誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織塊數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

(1)。

1.2.4 芽分化培養(yǎng) 將表面干燥致密，且具有一定硬度的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到PRM上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，光周期為26℃光照16 h/24℃黑暗8 h，光照強(qiáng)度為10 000 Lx。2周繼代1次，1周后愈傷組織的表面開始出現(xiàn)綠點(diǎn)，3至5周綠點(diǎn)逐漸長成綠芽，統(tǒng)計并計算芽分化率：

芽分化率=產(chǎn)生的綠芽數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%

(2)。

1.2.5 根再生培養(yǎng) 當(dāng)綠芽長至1～3 cm時，先將綠芽轉(zhuǎn)接到RM上誘導(dǎo)生根，2周后長出根系。為了增加其成活率，再將其轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)瓶中。苗高約6 cm時，打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋，煉苗1 d。最后，將其移栽到營養(yǎng)土中，統(tǒng)計并計算再生率：

再生率=誘導(dǎo)分化形成的植株數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

(3)。

1.2.6 最佳CIM培養(yǎng)基的篩選 篩選出再生效率較高的谷子品種后，為了提高其出愈率和愈傷的品質(zhì)，需篩選出最適合該品種的培養(yǎng)基。從CIM1、CIM2、CIM3和CIM4這4種不同誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基中篩選出愈率較高，且愈傷組織質(zhì)量好(致密有顆粒狀)的培養(yǎng)基配方。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子成熟胚離體再生

首先，挑選飽滿無霉變的谷子種子，砂紙打磨脫殼(圖1-A)，然后利用75%乙醇和20%次氯酸鈉消毒，接種到CIM培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織。最初誘導(dǎo)的愈傷組織含水較多，質(zhì)地較軟，不適宜直接誘導(dǎo)芽(圖1-B)。繼代培養(yǎng)1～2次后愈傷呈淡黃色、質(zhì)地較硬，且胚性愈傷率較高(圖1-C)。然后將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到PRM培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周左右即出現(xiàn)綠點(diǎn)，3～5周長出綠芽(圖1-D)。將綠芽移栽到裝有RM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中誘導(dǎo)生根(圖1-E)；2周后移栽至裝有RM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)至幼苗出現(xiàn)大量根系，株高5～6 cm時移栽至裝有土壤的盆中(圖1-F、G)。

注：A：未脫殼(上)和脫殼(下)的成熟種子；B：Y41在CIM誘導(dǎo)15 d的愈傷；C：Y41在CIM繼代2周的愈傷組織；D：Y41在PRM上誘導(dǎo)的再生芽；E：Y41在RM上再生出的根；F：培養(yǎng)瓶里的Y41幼苗；G：移栽到土里的Y41再生植株。標(biāo)尺：A：2 mm； B～E：2 cm； F：5 cm； G：20 cm。Note: A: Husked (top) and dehusked (below) mature seeds. B: Callus of Y41 on CIM for 15 days. C: Callus of Y41 subcultured for two weeks on CIM. D: Buds of Y41 induced on PRM. E: Roots of Y41 induced on RM. F: Seedlings of Y41 in culture flasks. G: Regenerated plants of Y41 transplanted into the soil. Bar: A: 2 mm. B-E: 2 cm. F: 5 cm, G: 20 cm.圖1 谷子成熟胚離體再生過程Fig.1 In vitro regeneration process of mature embryo of millet

2.2 不同基因型谷子的離體再生效率分析

由圖2可知，所有基因型都可以形成愈傷組織，但不同基因型谷子的出愈率、芽分化率和再生率差異較大，其中出愈率在80%～90%的最多，有27個品種，占總數(shù)的30%(圖2-A)。但芽分化率和再生率普遍較低，10%以下的分別占54%和68%，僅有少數(shù)種質(zhì)資源芽分化率和再生率在30%以上(圖2-B、C)。由表2可知，Y429出愈率最低，僅為17.67%；Y342出愈率最高，達(dá)93.67%。芽分化率介于0%～78.89%之間，其中以Y108最高，為78.89%；再生率介于0%～40.00%之間，其中以Y41最高，為40.00%。但一些種質(zhì)資源(如Y329)雖然出愈率較高，但芽分化率和再生率均為0%，表明愈傷形成和芽分化之間無相關(guān)性。出愈率高于90%的有11個品種，分別為Y41、Y112、Y113、Y145、Y176、Y238、Y329、Y336、Y342、Y348、Y356；芽分化率高于50%的有6個品種，分別為Y41、Y108、Y112、Y113、Y145、Y176；再生率高于30%的有5個品種，分別為Y41、Y108、Y145、Y176、Y348，其中同時滿足以上3個條件的有3個品種，分別為Y41、Y176、Y145，其出愈率分別為92.67%、90.67%、91.67%，芽分化率分別為62.92%、76.71%、60.76%，再生率分別為40.00%、37.33%、36.00%。

圖2 90種不同種質(zhì)資源的離體再生情況Fig.2 In vitro regeneration of 90 different germplasm resources

2.3 高效品種的培養(yǎng)基篩選

不同基因型的種質(zhì)資源對激素的反應(yīng)存在差異。為了建立Y41、Y145和Y176這3個種質(zhì)資源最佳的離體再生體系，將其分別培養(yǎng)在CIM1、CIM2、CIM3和CIM4這4種谷子或狗尾草愈傷誘導(dǎo)常用的培養(yǎng)基，15 d后統(tǒng)計其愈傷形成情況。結(jié)果表明，這3個品種在4種培養(yǎng)基條件下的愈傷生長情況一致(圖3)。雖然3個品種的出愈率在4種培養(yǎng)基上的差異沒有達(dá)顯著水平，但其愈傷品質(zhì)差異較大(圖4)。其中，Y41、Y145和Y176這3個種質(zhì)在CIM4上的出愈率均最低，愈傷較小，芽較長，因此CIM4不適于Y41、Y145和Y176愈傷的誘導(dǎo)(圖3-D、H、L)。在CIM1培養(yǎng)基上的愈傷較小，且褐化較明顯(圖3-A、E、Ⅰ)；CIM2培養(yǎng)基上的愈傷個別有明顯增大的現(xiàn)象，但整體愈傷質(zhì)量不均勻(圖3-B、F、J)；CIM3培養(yǎng)基上的愈傷組織狀態(tài)最佳，愈傷顏色淡黃，為致密的硬顆粒狀(圖3-C、G、K)，因此可選擇CIM3對篩選出的高效谷子品種進(jìn)行大規(guī)模組織培養(yǎng)。

表2 代表性谷子種質(zhì)資源Table 2 Millet germplasm resources with significant data /%

注：A～D：Y41分別在CIM1、CIM2、CIM3和CIM4培養(yǎng)基上15 d的愈傷情況；E～H：Y145分別在CIM1、CIM2、CIM3和CIM4培養(yǎng)基上15 d的愈傷情況；I～L：Y176分別在CIM1、CIM2、CIM3和CIM4培養(yǎng)基上15 d的愈傷情況。Note: A-D: Callus of Y41 on CIM1,CIM2,CIM3 and CIM4 for 15 days, respectively. E-H: Callus of Y145 on CIM1,CIM2,CIM3 and CIM4 for 15 days, respectively. I-L: Callus of Y176 on CIM1,CIM2,CIM3 and CIM4 for 15 days,respectively.圖3 Y41、Y145和Y176在4種培養(yǎng)基下的愈傷情況Fig.3 The callus of Y41,Y145 and Y176 on four different callus induction media

圖4 Y41、Y145和Y176在不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的出愈率Fig.4 The callus formation rate of Y41, Y145 and Y176 on different callus induction medium

3 討論

谷子既是重要的雜糧作物，又是新興的模式植物，因其獨(dú)特的營養(yǎng)價值和耐旱性受到了人們廣泛的關(guān)注[5-8, 10, 22]。但目前谷子遺傳學(xué)研究面臨著離體再生效率低、遺傳轉(zhuǎn)化困難等諸多技術(shù)挑戰(zhàn)，極大地限制了谷子的生產(chǎn)[13]。本研究對90份國內(nèi)外種質(zhì)資源的離體再生情況進(jìn)行分析，從中篩選出3份(Y41、Y145和Y176)高效離體再生的種質(zhì)資源，并在此基礎(chǔ)上，篩選了適于這3份種質(zhì)資源愈傷形成的培養(yǎng)基(CIM3)，為高效離體再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了基礎(chǔ)。

谷子種子包裹在外稃中，組織培養(yǎng)時很難徹底消毒，污染極其嚴(yán)重，一般都需要多次滅菌步驟[31-32]。Lin等[33]利用不完全去殼的種子簡化了滅菌步驟，但也需要將近7 h，因此，在組織培養(yǎng)前進(jìn)行脫殼處理會簡化滅菌步驟、減少時間。本研究利用砂紙打磨的方法去除外殼[34]，盡管與直接用手剝離外殼相比胚胎損傷率略高，但極大提高了脫殼效率并降低了污染率。此外，本研究發(fā)現(xiàn)谷子種子成熟后及早收獲，減少后期雨水浸泡，也可極大降低組織培養(yǎng)污染的概率，因?yàn)椴涣嫉沫h(huán)境會降低種子活力，更易遭受霉菌侵染[35]。CIM培養(yǎng)基上愈傷培養(yǎng)的時間和繼代次數(shù)對谷子離體再生效率有較大影響。本研究結(jié)果表明，10 d內(nèi)的愈傷較小，呈水浸狀，不適宜進(jìn)行直接誘導(dǎo)芽；隨后，愈傷開始明顯增大、質(zhì)地變硬，15 d后愈傷質(zhì)量較好，但超過25 d的愈傷褐化比較嚴(yán)重，因此要在15～25 d內(nèi)視愈傷情況進(jìn)行繼代。但繼代超過2次，愈傷褐化、老化情況嚴(yán)重，這與柳琳[36]和趙輝等[37]進(jìn)行成熟胚誘導(dǎo)愈傷的情況相似。誘導(dǎo)生根時，可以先移至培養(yǎng)皿里，由于培養(yǎng)皿面積大，光照充足，幼苗發(fā)育較好。2周后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，以利于幼苗生長發(fā)育。

研究表明，基因型是影響植物離體再生效率的首要因素[27-28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，90份谷子種質(zhì)資源出愈率、芽分化率和再生率存在較大差異，出愈率最高為93.67%，最低僅為17.67%；芽分化率最高為78.89%，最低為0%；再生率最高為40.00%，最低為0%，這進(jìn)一步驗(yàn)證了基因型是影響再生率的關(guān)鍵因素。此外，同一品種在不同培養(yǎng)基上的愈傷品質(zhì)不同，這與王節(jié)之等[25]、李惠[30]和Satish等[38]的結(jié)論相似，在培養(yǎng)基中加入玉米素(ZT)，愈傷確實(shí)有膨大現(xiàn)象，與袁進(jìn)成等[26]的結(jié)論一致，但只是個別愈傷膨大。因此，選擇高效離體再生的基因型和合適的培養(yǎng)基可有效提高谷子組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化效率。此外，谷子高出愈率并不一定能保證高再生率，其原因可能是愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基可能不適于這些出愈率較高的品種，如出愈率較高的Y342和Y329愈傷組織呈水浸狀或者膠狀，不易于后續(xù)的繼代和再生，導(dǎo)致再生率較低。因此，在今后的試驗(yàn)中可進(jìn)一步優(yōu)化愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，Y342、Y329等種質(zhì)資源有望獲得高質(zhì)量的愈傷組織，從而提高其再生率。

本研究從90份谷子種質(zhì)資源中篩選出了Y41、Y145和Y176這3個高效離體再生的種質(zhì)資源，為后續(xù)谷子遺傳轉(zhuǎn)化和遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。但這3個種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀較差，種子較小且植株分蘗較多，性狀類似于狗尾草，馴化程度較低。尤其是Y176千粒重僅為2.635 g，不適宜在生產(chǎn)中大面積推廣。后續(xù)研究可將其與晉谷21、豫谷1號和冀谷11號等名優(yōu)品種進(jìn)行雜交，將高效離體再生基因轉(zhuǎn)到名優(yōu)品種中。雖然這3個高效離體再生的種質(zhì)資源在CIM3培養(yǎng)基上出愈率最高，且愈傷質(zhì)量也較好，但CIM3培養(yǎng)基是否適合所有的種質(zhì)資源還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，基因型是影響谷子離體再生效率的重要因素，不同種質(zhì)資源的出愈率介于17.67%～93.67%之間，芽分化率介于0%～78.89%之間，再生率介于0%～40.00%之間。出愈率高的種質(zhì)資源不一定再生率高，但再生率高的種質(zhì)資源一般具有較高的出愈率，因此在篩選高效再生種質(zhì)資源時應(yīng)綜合考慮這2個因素。從90份國內(nèi)外谷子種質(zhì)資源中篩選到3份(Y41、Y145和Y176)出愈率、芽分化率和再生率均較高的種質(zhì)資源，這3個種質(zhì)資源在CIM3愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上具有較高的出愈率，且愈傷組織質(zhì)量較高。本研究結(jié)果為谷子高效離體再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定了一定的理論基礎(chǔ)。