張凡凡, 尉小霞, 段宏偉, 于 磊*, 張文舉
(1. 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 新疆 石河子 832000; 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院, 北京 100083)
天然草地的牧草是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)生產(chǎn)的重要來源[1]。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中,準(zhǔn)確、快速、實(shí)時(shí)獲取天然草地牧草營養(yǎng)信息,可為有效評估天然草地營養(yǎng)供給和營養(yǎng)載畜量奠定基礎(chǔ)[2]。目前,近紅外光譜技術(shù)(Near infrared reflectance spectroscopy,NIRS)已成為國內(nèi)外牧草成分鑒定和品質(zhì)分析的一種可靠方法[3]。豆科牧草方面的研究表明,紫花苜蓿(Medicagosativa)、紅花車軸草(Trifoliumpratense)、白花車軸草(Trifoliumrepens)和百脈根(Lotuscorniculatus)4種混合豆科牧草建立的粗蛋白(Crude protein,CP)、酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)營養(yǎng)成分的NIRS模型決定系數(shù)(Rc2)均≥0.93[4]。劉哲等[5]除了利用NIRS技術(shù)準(zhǔn)確測定苜蓿的CP、鈣(Ca)的含量外,還預(yù)測了粗灰分(Ash)的含量。此外,很多國內(nèi)外學(xué)者利用NIRS技術(shù)對豆科牧草的營養(yǎng)品質(zhì)均進(jìn)行了預(yù)測,其營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)(Rp2)均可達(dá)到0.92以上[6-8]。對于其他種類牧草的研究表明,利用NIRS技術(shù)建立老芒麥(Elymussibiricus)CP,ADF,NDF的預(yù)測模型,其模型驗(yàn)證Rc2≥0.80,Rp2≥0.94[9]。Ruano等[10]建立了半干旱草地草本植物、禾本科、豆科、雜類草混合的Ca、P等微量元素NIRS模型。我國學(xué)者也利用NIRS建立了天然草地牧草CP、NDF、粗脂肪(Ether extract,EE)的定量分析模型[11]??v觀以往研究發(fā)現(xiàn),NIRS技術(shù)可以很好地進(jìn)行牧草營養(yǎng)品質(zhì)的快速檢測,并且針對各項(xiàng)營養(yǎng)價(jià)值指標(biāo)均可建立可信的預(yù)測模型。所以目前在在天然草地營養(yǎng)品質(zhì)評價(jià)方面,利用NIRS技術(shù)建立快速的營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)模型可滿足不同地區(qū)的實(shí)際生產(chǎn),而目前研究尚未建立不同地區(qū)、不同草地類型天然牧草營養(yǎng)成分定量分析模型。
由于新疆牧區(qū)是我國當(dāng)前放牧經(jīng)營發(fā)展的重要區(qū)域,因此牧草營養(yǎng)價(jià)值的快速評價(jià)變得尤為重要,對天然草地營養(yǎng)價(jià)值的快速定量分析,不僅有益于天然草地放牧經(jīng)營的成效性,且直接影響放牧家畜營養(yǎng)攝入的水平。而由于新疆天然草地牧草種類和組成復(fù)雜多樣,利用NIRS技術(shù)對其營養(yǎng)品質(zhì)的各項(xiàng)主要指標(biāo)進(jìn)行快速檢測是否可行?將各科、屬主要牧草進(jìn)行混合測定分析,其光譜特征如何?鑒于此,本研究以新疆昭蘇縣境內(nèi)的沙爾套山為研究區(qū)域,對其分布的主要混合牧草進(jìn)行營養(yǎng)品質(zhì)(CP,NDF,ADF,Ash,Ca,P)的NIRS分析,以期運(yùn)用NIRS技術(shù)對新疆天然草地牧草營養(yǎng)品質(zhì)的快速檢測方面有一個(gè)新的突破,并為建立適用、準(zhǔn)確的新疆天然草地NIRS模型提供基礎(chǔ)資料。
研究區(qū)域位于新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣域內(nèi)的沙爾套山,該山屬天山山脈西段分支,是形成昭蘇盆地的主體山脈之一。其山脈大體呈東西走向,主體山脈西、北兩側(cè)與哈薩克斯坦接壤,南側(cè)延伸至昭蘇盆地的特克斯河岸,向東延伸到康蘇河溝與昭蘇馬場草地相鄰。山脈東西長41.5 km;南北寬26~28 km,地理坐標(biāo)為東經(jīng)80°15′~80°54′,北緯42°54′~43°11′,山脈整體海拔高度為1 650~3 400 m,山嶺脊線海拔高度為3 200~3 400 m。整個(gè)昭蘇盆地氣候?qū)僦袦貛絽^(qū)半濕潤、半干旱冷涼氣候,年均溫2.9℃,具有降水多、積溫少等氣候特征[1,12]。
于2016年在研究區(qū)內(nèi)各季節(jié)牧場選擇植被發(fā)育完整地段,設(shè)置固定圍欄保護(hù),或在原有的圍欄內(nèi)再設(shè)置小圍欄保護(hù)。圍欄內(nèi)設(shè)置1 m×1 m樣方,根據(jù)牧草生長季節(jié)(6—11月),以及不同的生境(低山半陽坡/半陰坡、低山丘陵陽坡面、低山緩陰坡/灘地、中山和緩和坡面、中山帶緩陰坡面、山麓帶及低山殘丘、特克斯河岸階地、亞高山大陽/陰坡面、高山帶坡面)進(jìn)行采樣,收集樣方框內(nèi)的全部飼草,并剔除有毒植物及牲畜不食植物。共采集到32種主要飼草,其中禾本科牧草14種:芨芨草(Achnatherumsplendens)、冰草(Agropyroncristatum)、巨序剪股穎(Agrostisgigantea)、無芒雀麥(Bromusinermis)、短芒短柄草(Brachypodiumpinnatum)、鴨茅(Dactylisglomerata)、披堿草(Elymusdahuricus)、垂穗披堿草(Elymusnutans)、麥薲草(Elymustangutorum)、羊茅(Festucaovina)、假梯牧草(Phleumphleoides)、細(xì)葉早熟禾(Poaangustifolia)、長芒大穗鵝觀草(Roegneriaaboliniivar.divaricans)、針茅(Stipacapillata)。豆科牧草12種:草原山黧豆(Lathyruspratensis)、塊莖山黧豆(Lathyrustuberosus)、西伯利亞山黧豆(Lathyruspisiformis)、黃花苜蓿(Medicagofalcata)、羅馬苜蓿(Medicagofalacatavar.romanica)、西伯利亞驢食豆(Onobrychistanaitica)、米爾克棘豆(Oxytropismerkensis)、野火球(Trifoliumlupinaster)、白花車軸草(Trifoliumrepens)、紅花車軸草(Trifoliumpratens)、線葉野豌豆(Viciatenuifolia)、廣布野豌豆(Viciacracca)。鳶尾科1種:紫花鳶尾(Irisruthenica)。莎草科2種:細(xì)果苔草(Carexstenocarpa)、線葉嵩草(Kobresiacapillifolia)。牻牛兒苗科1種:草原老鸛草(Geraniumpratense)。薔薇科2種:西伯利亞羽衣草(Alchemillasibirica)、高山地榆(Sanguisorbaalpina)。其中除西伯利亞羽衣草、細(xì)果苔草、線葉嵩草、高山地榆所處于高海拔的地帶,僅在7—8月測定采樣外,其他種類牧草每月均分別采樣[13],每種牧草采集2份(即至少從2個(gè)楊方框中采集到),共計(jì)118份。采集完將上述飼草按照其在樣方框內(nèi)的自然分布頻度混合,以反映該天然草地牧草實(shí)際生長情況。將采集的混合樣品稱重后帶回實(shí)驗(yàn)室放入烘箱65℃烘48 h,粉碎過40目篩(孔徑為0.425 mm)后裝入自封袋用于近紅外光譜掃描和營養(yǎng)物質(zhì)測定。
1.3.1 主要儀器與分析軟件 試驗(yàn)使用近紅外光譜分析儀(DS2500,F(xiàn)OSS公司)進(jìn)行光譜掃描。工作參數(shù):波長范圍,400~2 500 nm;雙檢測器系統(tǒng),硅檢測器(400~1 100 nm),硫化鉛檢測器(1 100~2 500 nm);數(shù)據(jù)采集頻率,掃描2/s;波長準(zhǔn)確度<0.05 nm;光譜分辨率:0.5 nm;定標(biāo)軟件為Win ISI Ⅲ;數(shù)據(jù)采集形式為lg(1/R)。工作條件:穩(wěn)定25℃室溫[11]。
1.3.2 營養(yǎng)物質(zhì)測定方法 采用國標(biāo)法進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)測定[14]。其中粗蛋白質(zhì)(CP)采用凱氏定氮法測定,粗灰分(Ash)采用灰化法測定,酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)采用Van Soest分析法測定,鈣(Ca)采用EDTA絡(luò)合滴定法測定,磷(P)采用鉬銻抗比色法測定。
1.3.3 樣本近紅外光譜掃描 將處理好的樣品裝入樣品杯,大約為杯容量的3/4,每個(gè)樣品重復(fù)掃描6次,每次均掃描背景,取平均光譜為樣品光譜圖,消除由裝樣密度及樣品粒度不均勻造成的誤差。
1.3.4 近紅外光譜模型的建立與驗(yàn)證 將樣品均按3∶1隨機(jī)分為定標(biāo)集和驗(yàn)證集。驗(yàn)證集樣品化學(xué)值均在定標(biāo)集樣品化學(xué)值的范圍內(nèi)。利用定標(biāo)分析軟件(Win ISI Ⅲ),采用修正偏最小二乘法(MPLS),結(jié)合散射處理、導(dǎo)數(shù)、平滑等不同的光譜預(yù)處理和數(shù)學(xué)處理方法,用定標(biāo)集樣品建立模型。建模時(shí)用馬氏距離對光譜異常值進(jìn)行檢驗(yàn);絕對偏差對測定值(實(shí)驗(yàn)室實(shí)測值)進(jìn)行檢驗(yàn),以提高模型的準(zhǔn)確度。同時(shí),采用交叉驗(yàn)證防止過擬合現(xiàn)象。模型的評價(jià)根據(jù)定標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard error of calibration,SEC)、交叉檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard error of cross validation,SECV)、交叉驗(yàn)證決定系數(shù)(1-VR)、預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard error of prediction,SEP)等確定最優(yōu)模型。驗(yàn)證集樣品對最優(yōu)模型進(jìn)行外部驗(yàn)證,評價(jià)其外部預(yù)測能力。最后,用交叉驗(yàn)證相對分析誤差(Relative prediction deviation for cross validation,RPDCV)(RPDCV=標(biāo)準(zhǔn)偏差/SECV)和外部驗(yàn)證相對分析誤差(Relative prediction deviation of prediction,RPDP)(RPDP=SD/SEP)對模型進(jìn)一步評價(jià),其中RPDCV和RPDP均>3,說明建立的模型可以用于精準(zhǔn)的定量分析;RPDP<2.5,說明難于進(jìn)行NIRS定量分析;2.5≤RPDP<3,模型的預(yù)測精度有待進(jìn)一步提高[11]。
試驗(yàn)采集32種不同生育期和生境環(huán)境的天然牧草來,這使得牧草樣本各營養(yǎng)物質(zhì)含量(化學(xué)成分含量)產(chǎn)生較大不同,其中CP,Ash,Ca和P含量最大值分別為19.18%,13.9%,3.35%和0.34%,NDF和ADF最小值分別為32.50%和20.21%,這些極端值主要出現(xiàn)在6月采集的樣本中;CP,Ash,Ca和P含量最小值分別3.87%,4.00%,0.33%和0.09%,NDF和ADF含量最大值分別為69.82%和43.21%,這些極端值主要出現(xiàn)在10—11月采集的牧草樣本中。定標(biāo)集變異系數(shù)按大小排序?yàn)椋篊a>CP=P>NDF>ADF>Ash。驗(yàn)證集變異系數(shù)按大小排序?yàn)椋篊a>P>CP>ADF>NDF=Ash(表1)。
表1 牧草樣品營養(yǎng)物質(zhì)含量分析Table 1 Nutrient content analysis results of calibration and validation samples
本研究全年牧草樣品光譜圖如圖1。由于牧草樣本的種類和數(shù)量均不同,因此總體光譜響應(yīng)曲線有一定的變化范圍,呈現(xiàn)光譜帶,牧草樣品光譜在全波長范圍內(nèi)(400~2500 nm)存在多個(gè)吸收峰,為其營養(yǎng)成分的定量分析提供了豐富的信息,其中最大吸收峰出現(xiàn)在以450 nm為中心的藍(lán)波段(圖1,A點(diǎn))和670 nm為中心的紅波段(圖1,B點(diǎn))。
圖1 全年牧草樣品光譜圖Fig.1 The spectra of grass
運(yùn)用Win ISI Ⅲ定標(biāo)軟件中MPLS法,通過不同光譜預(yù)處理和數(shù)學(xué)處理,對定標(biāo)集樣品建模,選出最佳定標(biāo)模型。建立的CP,NDF和ADF定標(biāo)模型1-VR系數(shù)較大。此外,本研究對CP,NDF和ADF的校正模型進(jìn)行了內(nèi)部交叉檢驗(yàn),并剔出了異常樣品,得到了CP,NDF,ADF的最佳校正模型。經(jīng)過4種不同處理選擇的最優(yōu)模型所得出的數(shù)據(jù),其SEC,SECV,1-VR,RPDCV的結(jié)果如表2所示。由表2可以看出,CP,NDF,ADF,Ash,Ca和P的SECV分別為2.36,6.17,3.87,0.85,0.24和0.07,1-VR分別為0.82,0.80,0.78,0.50,0.72和0.65,其中1-VR較高的為CP,NDF和ADF(均>0.75),但只有CP的RPDCV>2.5;NDF,ADF,Ash,Ca和P的RPDCV均<2.5。根據(jù)建議的模型評價(jià)標(biāo)準(zhǔn),建立的CP可進(jìn)行NIRS定量分析,其余指標(biāo)的定量分析模型還需要進(jìn)一步完善和優(yōu)化[15]。
表2 定標(biāo)樣本各營養(yǎng)指標(biāo)光譜模型參數(shù)Table 2 The parameters of the spectrum model of the calibration samples on each nutrition index
注:NT為無散射處理。SNV+De為標(biāo)準(zhǔn)正常化+去散射處理。1,4,4,1為一階導(dǎo)數(shù)處理,數(shù)據(jù)間隔點(diǎn)為4,平滑處理間隔點(diǎn)為4,二次平滑處理間隔點(diǎn)為1;2,4,4,1為二階導(dǎo)數(shù)處理處理,數(shù)據(jù)間隔點(diǎn)為4,平滑處理間隔點(diǎn)為4,二次平滑處理間隔點(diǎn)為1
Note:NT:Non-scattering treatment. SNV+De:Standard normalization treatment + detrend. 1,4,4,1:first derivative,the data interval and smooth processing interval is four,the second smooth treatment interval is one. 2,4,4,1:second derivative,the data interval and smooth processing interval is four,the second smooth treatment interval is one
校正模型建立后,為了進(jìn)一步驗(yàn)證所建模型的預(yù)測效果,選用SEP、RPDP等參數(shù),用驗(yàn)證集樣品對預(yù)測模型進(jìn)行外部驗(yàn)證,以評價(jià)模型的實(shí)際預(yù)測效果。結(jié)果表明,各營養(yǎng)指標(biāo)實(shí)測值和預(yù)測值間差異均不顯著(P>0.05),但從外部驗(yàn)證結(jié)果表明,建立的預(yù)測模型對于牧草的各項(xiàng)營養(yǎng)指標(biāo)的預(yù)測結(jié)果不夠理想,其中預(yù)測相關(guān)系數(shù)R2較高的為0.84(ADF)、NDF(0.73)和0.66(CP)(表3)。圖2為實(shí)測值與光譜預(yù)測值關(guān)系,其中ADF實(shí)測值(X)和預(yù)測值(Y)間關(guān)系為:Y=0.87X+6.25(R2=0.84),NDF為:Y=0.61X+24.75(R2=0.73),CP為Y=0.82X+2.19(R2=0.66),所以采用NIRS技術(shù)可在一定程度上預(yù)測天然草地牧草CP、ADF和NDF含量,而對于Ash,Ca和P的相關(guān)度較低,不能進(jìn)行定量分析。此外,通過RPDP值進(jìn)一步評價(jià),僅CP含量滿足NIRS定量分析要求,但預(yù)測精度有待提高,其余指標(biāo)均不能滿足NIRS定量分析條件。
表3 驗(yàn)證樣本的預(yù)測結(jié)果Table 3 The result of prediction of validation sample
注:實(shí)際測定值和光譜預(yù)測值差異性分析采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較,差異顯著性水平為0.05
Note:The difference between the actual measured value and the spectral predicted value was analyzed by Duncan method,and the difference significance level was 0.05
圖2 實(shí)際測定值與光譜預(yù)測值關(guān)系分析Fig.2 Relationship between the actual measured value and the NIRS predictive value
沙爾套山天然草地主要組成牧草為禾本科(14種)和豆科(12種)牧草。以往利用NIRS技術(shù)在單一禾本科牧草(黑麥草Loliumperenne、燕麥Avenasativa、羊草Leymuschinensis)營養(yǎng)價(jià)值快速評價(jià)的研究結(jié)果表明,不同地域、品種和成熟期黑麥草CP含量預(yù)測值和測定值間的相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.99[16];燕麥全株干草可建立穩(wěn)定的CP、NDF和ADF含量的矯正模型,且CP和NDF的決定系數(shù)在0.95以上[17];羊草(干草)CP、NDF和ADF含量的矯正模型,其相關(guān)系數(shù)均可達(dá)到0.95以上[18]。對于單一豆科牧草,眾多學(xué)者建立了苜蓿鮮草、干草、草顆粒營養(yǎng)物質(zhì)(CP,NDF,ADF)的NIRS模型,其相關(guān)系數(shù)均可達(dá)到0.92以上[5,7,8]。由此表明,NIRS技術(shù)可以建立單一牧草的營養(yǎng)價(jià)值快速檢測模型。而由于天然草地牧草組成成分較為復(fù)雜,利用NIRS技術(shù)是否能建立穩(wěn)定的營養(yǎng)價(jià)值預(yù)測模型,學(xué)者們也進(jìn)行了相關(guān)研究,采用禾本科、豆科混合牧草樣品建立的CP定標(biāo)模型,可以很好預(yù)測牧草的CP值[19];采用紫花苜蓿、百脈根、紅花車軸草、鴨茅和梯牧草(Phleumpratense)建立的CP,NDF,ADF定標(biāo)模型,也可以很好地預(yù)測混合牧草營養(yǎng)物質(zhì)含量[4]。
本研究中,對于CP、NDF和ADF含量建立的NIRS模型,其均可在一定程度上進(jìn)行預(yù)測,但預(yù)測精度還有待提高。其主要原因?yàn)椴杉旌夏敛莘N類較多(32種),樣品采集地點(diǎn)較廣泛,海拔也不同,包括山地的不同坡面,這使得樣品中化學(xué)成分形成較大的含量梯度,從而使模型具有較廣的預(yù)測范圍,但精度還需要繼續(xù)優(yōu)化。另外,采集的牧草處于不同的生育期,營養(yǎng)指標(biāo)含量變幅較大,CP為2.25%~27.60%,NDF為30.50%~90.50%,ADF為17.50%~68.30%,各營養(yǎng)成分的含量變幅基本上可以涵蓋不同種類牧草樣品可能會(huì)出現(xiàn)的含量水平。因此,從這個(gè)角度看,試驗(yàn)樣品具有很好的代表性,但同時(shí)樣品間存在很大差異,對預(yù)測結(jié)果也有一定影響。有學(xué)者[20]也證實(shí)建立天然草地牧草NIRS模型時(shí),建模樣品的年份、品種、產(chǎn)地以及組分模型的化學(xué)值分布等情況會(huì)影響建模樣品的代表性和所建模型的性能。此外,本研究建模樣本和驗(yàn)證集樣本數(shù)量較少,且在建模優(yōu)化過程中剔除了一定數(shù)量的樣本(表2),這也使得建模的精確度和準(zhǔn)確度降低,從而使得建立的模型不夠理想,因此在今后研究中還需要加大天然草地樣本量的選取,進(jìn)一步提高模型準(zhǔn)確性。
以往研究利用NIRS技術(shù)對Ash,Ca和P等無機(jī)物的快速檢測結(jié)果表明,利用NIRS技術(shù)可以很好地預(yù)測不同木本植物葉片中Ash,Ca和P的含量,其中Ca和P的相關(guān)系數(shù)分別為0.95和0.94,其主要原因是由于無機(jī)物和蛋白質(zhì)等有機(jī)物結(jié)合,這使得結(jié)合物質(zhì)中的各種基團(tuán)在一定的波長下產(chǎn)生了吸收峰,所以礦物質(zhì)元素與蛋白質(zhì)等有機(jī)物之間的鍵為NIRS的檢測提供了一定基礎(chǔ)[21]。此外,應(yīng)用NIRS技術(shù)也可以滿足半干旱草地草本植物、禾本科、豆科、雜類草Ca、P元素分析[22]。而也有研究認(rèn)為NIRS檢測礦物質(zhì)的能力有限[23]。本研究利用NIRS技術(shù)建立的混合牧草樣本Ash、Ca和P的模型精確度和準(zhǔn)確度均不能達(dá)到建模要求,其一方面可能由于礦質(zhì)元素在植物體內(nèi)的含量低,達(dá)不到NIRS的檢測范圍;另一方面有機(jī)分子與礦物質(zhì)的結(jié)合體會(huì)隨著季節(jié)而變化,其因牧草種類不同,使測定結(jié)果不穩(wěn)定;另外礦質(zhì)元素在植物體中也多以離子態(tài)存在,NIRS無法對其進(jìn)行有效檢測。所以應(yīng)用NIRS分析牧草中礦物質(zhì)元素含量還有待進(jìn)一步研究和改進(jìn)。雖然建模效果不理想,但使用多科屬混合牧草建立的預(yù)測模型,在研究中少見,其作為新疆天然草地牧草研究的一個(gè)突破點(diǎn),還需要對定標(biāo)集進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)充和完善,以提高預(yù)測準(zhǔn)確度。此外,試驗(yàn)中對牧草微量元素測定還沒有涉及,在今后的工作中需要通過測定多種指標(biāo)和擴(kuò)充樣本量以及降低實(shí)際測定誤差等多種方法對定標(biāo)方程進(jìn)行逐步的校正,從而實(shí)現(xiàn)牧草利用價(jià)值的準(zhǔn)確應(yīng)用,最終建立各地區(qū)天然牧草營養(yǎng)價(jià)值數(shù)據(jù)庫并實(shí)現(xiàn)共享,為草原牧草營養(yǎng)價(jià)值監(jiān)測和草食家畜精準(zhǔn)飼喂管理提供便利。
利用近紅外光譜檢測技術(shù)可以建立沙爾套山天然草地32種主要混合牧草粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的檢測模型,其交叉驗(yàn)證決定系數(shù)分別為0.82,0.80和0.78;外部驗(yàn)證相對分析誤差分別為2.67,2.20和2.28,相關(guān)性分別為0.66,0.73和0.84其模型精確度和驗(yàn)證準(zhǔn)確度還有待提高。利用近紅外光譜檢測技術(shù)不能建立粗灰分、鈣和磷的檢測模型。