琚澤亮， 趙桂琴， 柴繼寬

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， 甘肅省草業(yè)工程實驗室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

裸燕麥(AvenanudaL.)又稱莜麥，具有抗旱、抗寒和耐貧瘠等特點，在我國高寒、干旱和半干旱地區(qū)的雜糧生產(chǎn)中占有重要地位[1]。禾谷類作物中裸燕麥蛋白質(zhì)含量最高，且富含膳食纖維和多種礦質(zhì)元素；籽粒中不飽和脂肪酸較多，是優(yōu)質(zhì)的保健食品；另外，較少的糖分也使其備受糖尿病患者的喜愛[2]。近年來，裸燕麥產(chǎn)品在國內(nèi)市場上已形成一定規(guī)模[3]。

在裸燕麥的大面積種植生產(chǎn)過程中，草害是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素，規(guī)?；纳a(chǎn)離不開對田間雜草的控制，化學(xué)除草仍然是目前主要的雜草控制手段。苯氧羧酸類激素型除草劑2,4-D丁酯因為殺草譜廣、活性高、生產(chǎn)成本低等特點，至今仍然是防除闊葉雜草的主要除草劑[4]。2,4-D丁酯的作用機(jī)理是在進(jìn)入植物體后酯解生成2,4-D，進(jìn)而發(fā)揮作用[5]。張小衛(wèi)[6]在進(jìn)行冬小麥(TriticumaestivumL.)田雜草防除研究中，發(fā)現(xiàn)噴施不同濃度的2,4-D丁酯后，小麥拔節(jié)后受藥害輕，而拔節(jié)前冬小麥對2,4-D丁酯比較敏感，當(dāng)用量超過1500 mL·hm-2會產(chǎn)生藥害，造成減產(chǎn)，損失較大。Mario等[7]研究了不同除草劑對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)在小麥田施用2,4-D、草胺膦、草胺膦+二甲四氯和百草枯后，小麥的千粒重和產(chǎn)量不受影響。李巍等[8]對適用于苧麻(Boehmerianivea)田的除草劑進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)2,4-D鈉鹽可抑制多倍體1號、中苧1號和湘苧3號的生長，降低了苧麻的產(chǎn)量和品質(zhì)?？梢姡?,4-D丁酯對作物的影響受作物種類、生長時期和除草劑的用量[9]等因素的影響。

農(nóng)藥田間使用過程中的殘留及其對農(nóng)作物的藥害問題也備受關(guān)注，除草劑使用不當(dāng)會對農(nóng)田環(huán)境造成污染，使作物產(chǎn)生一系列藥害，尤其是激素類除草劑[10-11]。裸燕麥較其他禾谷類作物對除草劑更加敏感，常因此而發(fā)生藥害。苯氧羧酸類除草劑及苯甲酸類除草劑對作物藥害的典型癥狀是使作物致畸，根、莖、葉、花及穗均產(chǎn)生明顯的畸形現(xiàn)象，長久不能恢復(fù)正常[12]。Large等[13]發(fā)現(xiàn)施用2,4-D丁脂可造成燕麥及大麥(HordeumvulgareL.)生育期延長，部分器官畸形扭曲，穗異常等現(xiàn)象。宋旭東等[14]以低、中和高3個濃度(600，900和1 200 mL·hm-2)研究了2,4-D丁酯對裸燕麥田雜草的控制及裸燕麥帶殼率的影響，結(jié)果顯示2,4-D丁酯顯著增加了裸燕麥帶殼率。

盡管2,4-D丁酯在裸燕麥田的使用已有研究，但其在裸燕麥中的殘留和消解動態(tài)尚未見報道，對燕麥安全性的影響也值得探究。因此本文在不同的2,4-D丁酯施用劑量下測定裸燕麥中2,4-D丁酯及其分解產(chǎn)物2,4-D的殘留動態(tài)，探討2,4-D丁酯施用劑量對裸燕麥安全性的影響，以期為合理使用除草劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

試驗于2015年在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗站大田(103°41′ E，36°05′ N)進(jìn)行。前茬作物為燕麥，試驗前試驗地未檢測到土壤中含有2,4-D丁酯。試驗材料為裸燕麥白燕2號(AvenanudaL.‘Baiyan No. 2’)。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，共12個小區(qū)，小區(qū)面積20 m2(5 m × 4 m)，小區(qū)之間設(shè)置1 m寬的隔離帶。燕麥條播，播種深度為4～5 cm，行距0.2 m。燕麥于2015年3月28日播種，播種量為150 kg·hm-2。待燕麥長至3到4葉期，噴施2,4-D丁酯，濃度分別為450 mL·hm-2(A1)，750 mL·hm-2(A2)和1 050 mL·hm-2(A3)，未添加2，4-D的自來水做對照(CK)，每個處理3次重復(fù)。施藥后對1 d，7 d，14 d，21 d，28 d，38 d(開花期)、58 d(灌漿期)植株以及78 d(籽粒)中2,4-D丁酯及其分解產(chǎn)物2,4-D含量進(jìn)行測定。

1.2 測定內(nèi)容與方法

1.2.1 2,4-D丁酯殘留量的測定 隨機(jī)多點采集燕麥全株10株，剪碎混勻后分樣保存于_80℃冰箱中備用。樣品處理參照周艷明等[15]的方法，測定方法參照趙桂琴等[16]的方法，最低檢出限為0.002 mg·kg-1，采用安捷倫1260高效液相色譜儀和G1321B紫外熒光檢測器(Agilent，美國)對2,4-D丁酯殘留量進(jìn)行分析。2,4-D丁酯標(biāo)準(zhǔn)品濃度≥99%，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2.2 2,4-D含量的測定 樣品處理及分析參照耿志明等[17]的方法，最低檢出限為0.002 mg·kg-1。采用安捷倫1260高效液相色譜和G1321B紫外熒光檢測器(Agilent，美國)對2,4-D殘留量進(jìn)行分析。2,4-D標(biāo)準(zhǔn)品濃度≥98%，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2.3 安全性調(diào)查 從施藥開始至燕麥成熟，每隔7 d觀察燕麥生長狀況，記錄燕麥葉片斑點、莖葉扭曲、生長速度變化、抽穗異常等現(xiàn)象，并按照黃春燕[18]的分級標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行等級劃分。灌漿期每小區(qū)隨機(jī)挑選10株測定株高。燕麥成熟后于田間隨機(jī)取樣，每個小區(qū)隨機(jī)取3個1 m樣段，進(jìn)行脫粒，統(tǒng)計脫粒后種子的總粒數(shù)和帶殼粒數(shù)，計算帶殼率。分別收集各處理的帶殼種子，次年穴播于試驗地中，統(tǒng)計后代帶殼率。

表1 藥害分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The phytotoxicity classification standard

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、初步整理和作圖，用SPSS 17.0對不同施藥量的除草劑殘留量及安全性數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，結(jié)合Duncan法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2,4-D丁酯與2,4-D的消解用半衰期表示，用圖示法表征其消解動態(tài)。即以2,4-D丁酯與2,4-D殘留量為縱坐標(biāo)，以時間作為橫坐標(biāo)繪制消解曲線圖，擬合出2,4-D丁酯與2,4-D的消解方程，計算消解曲線的相關(guān)系數(shù)R。半衰期用一級反應(yīng)動力學(xué)方程式計算(CT=C0e-KT，CT表示時間T時的農(nóng)藥殘留量；C0表示施藥后的原始沉積量；K表示消解系數(shù)；T表示施藥后時間；半衰期為T1/2=ln 2/K)。

2 結(jié)果與分析

2.1 2,4-D丁酯在燕麥體內(nèi)的殘留消解動態(tài)

2,4-D丁酯在燕麥植株上的消解殘留動態(tài)結(jié)果見表2，消解動態(tài)均符合一級反應(yīng)動力學(xué)模式(圖1)，動力學(xué)方程分別為A1：CT=0.677e-0.070T，R=-0.97，T1/2= 8.66 d；A2：CT= 1.011e-0.062T，R=-0.95，T1/2= 11.18 d；A3：CT= 1.413e-0.064T，R=-0.98，T1/2= 10.83 d。對照中均未檢測出2,4-D丁酯。

從圖1可以看出，3個劑量下2,4-D丁酯在裸燕麥上的殘留規(guī)律基本類似。但在各測定時間點，不同處理的2,4-D丁酯殘留量差異顯著，這是由于2,4-D丁酯在不同噴施濃度下原始沉積量不同。2,4-D丁酯在燕麥上的原始沉積量由擬合的消解方程得到，即CT=C0e-KT中的C0。A1、A2和A3處理下的原始沉積量分別為0.677，1.011和1.413 mg·kg-1。由擬合的消解方程可以計算出，3個濃度下2,4-D丁酯的半衰期分別為8.66，11.18和10.83 d，平均為10.22 d?？梢钥闯?，2,4-D丁酯屬于易水解除草劑，水解速度很快。

總體來看，隨著時間的推移，3個噴施劑量下2,4-D丁酯的殘留量都不斷降低，處理后58 d在燕麥植株中的消解率均達(dá)到97%以上。78 d時，種子中均未檢測出2,4-D丁酯，其含量低于最低檢測限。不同劑量2,4-D丁酯處理下，裸燕麥上的殘留量和消解率又有所區(qū)別。2,4-D丁酯殘留量在A1處理下最低，7 d后殘留量為0.324 mg·kg-1，消解率為70.86%，14 d后殘留量為0.168 mg·kg-1，消解率為84.89%。而A3處理下，7 d后殘留量為0.802 mg·kg-1，較A1處理上升了147.53%，消解率僅為60.16%；A2劑量下，14 d后殘留量為0.318 mg·kg-1，較A1處理上升了89.29%，消解率為82.36%。

2.2 2,4-D在燕麥體內(nèi)的殘留消解動態(tài)

2,4-D是2,4-D丁酯分解后的產(chǎn)物，其在燕麥植株上的消解殘留動態(tài)結(jié)果見表3，對照中均未檢測出2,4-D。從表3可以看出，各濃度處理下2,4-D殘留消解動態(tài)均符合一級反應(yīng)動力學(xué)模式，動力學(xué)方程分別為A1：CT= 0.094e-0.074T，R=-0.95，T1/2= 9.37 d；A2：CT=0.207e-0.070T，R=-0.95，T1/2= 9.90 d；A3：CT= 0.323e-0.075T，R=-0.96，T1/2= 9.24 d。擬合的2,4-D在燕麥植株上的消解曲線見圖1，方程的相關(guān)系數(shù)在0.906～0.913之間。

從表2和3中可知，作為2,4-D丁酯的分解產(chǎn)物，2,4-D的殘留消解規(guī)律在一定程度上與2,4-D丁酯類似，即隨著施藥天數(shù)的增加，3個劑量下2,4-D的殘留量都不斷降低，原因是2,4-D丁酯殘留量減少，其水解產(chǎn)物亦減少。處理后58 d，2,4-D在燕麥植株中的消解率均達(dá)到97%以上，A1處理下2,4-D殘留量僅為0.002 mg·kg-1，消解率已達(dá)98.96%。78 d時，種子中均未檢測出2,4-D，同一時間點2,4-D丁酯亦未檢出，說明本試驗中3個劑量的2,4-D丁酯在裸燕麥田使用不會導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)。

圖1 2,4-D丁酯及2,4-D在燕麥植株上的消解殘留動態(tài)Fig.1 The degradation dynamic curve of 2,4-D butyl ester and 2,4-D in oat

2,4-D丁酯的施用劑量雖然不同，但其分解產(chǎn)物2,4-D的半衰期基本一致，分別為9.37，9.90和9.24 d，平均半衰期為9.50 d。說明2,4-D的半衰期與除草劑的施用劑量無關(guān)。但是，各處理及測定時間點下，2,4-D在燕麥中的殘留量差異顯著，原始沉積量明顯不同。A3劑量下達(dá)0.323 mg·kg-1，較A1和A2處理下的0.094和0.207 mg·kg-1分別高出242.68%和56.32%，平均為0.209 mg·kg-1。最大殘留量指實際檢測樣品中農(nóng)藥殘留量的最高值，該值出現(xiàn)在1 d時。3個不同濃度除草劑處理下，2,4-D在裸燕麥上的最大殘留量分別為0.193，0.253和0.341 mg·kg-1，A3處理下最高，顯著(P<0.05)高于A1和A2處理。14 d后殘留量仍以A3處理為最高，達(dá)0.183 mg·kg-1；而同時期A1處理的殘留量為0.034 mg·kg-1，較前者降低了438.24%，A2處理下殘留量為0.035 mg·kg-1，比高濃度降低了422.86%。

2.3 2,4-D丁酯對燕麥安全性的影響

2,4-D丁酯噴施后對燕麥的安全性影響顯著(表4)，且不同噴施劑量的影響程度也不同。A2和A3劑量下，白燕2號均表現(xiàn)出藥害，A3處理下癥狀為葉尖發(fā)紅、出現(xiàn)藥斑及葉面畸形，A2處理下癥狀為葉頂端下垂。A1噴施劑量下未出現(xiàn)藥害現(xiàn)象，與對照植株無異。

噴施2,4-D丁酯對燕麥帶殼率和株高影響也非常顯著(表4)。除草劑明顯(P<0.05)提高了裸燕麥的帶殼率，且?guī)ぢ孰S著噴施劑量的增加而升高。A3處理下帶殼率達(dá)到最大，為5.61%，顯著(P<0.05)高于對照；A1和A2處理下帶殼率分別為2.23%和4.72%。各小區(qū)帶殼種子在2015年收獲后，2016年穴播于試驗地，成熟后收獲脫粒，發(fā)現(xiàn)種子均為裸粒，帶殼率為零。2,4-D丁酯對燕麥株高的影響亦達(dá)到顯著(P<0.05)水平。噴施不同濃度2,4-D丁酯后，燕麥的株高均有不同程度的降低，尤其是A3處理下，較對照降低了12.90%(P<0.05)。

表2 2,4-D丁酯在燕麥植株上的殘留消解動態(tài)Table 2 The residue dynamics of 2,4-D butyl ester in oat

注：不同小寫字母表示同一采樣時間不同處理差異顯著(P<0.05)，ND表示殘留量低于方法的檢測限，下同

Note:Values with different small letters show significant differences among treatments in the different sampling time (P<0.05),ND means pesticide residues was lower than the minimal detectable level,the same as below

表3 2,4-D在燕麥植株上的殘留消解動態(tài)Table 3 The residue dynamics of 2,4-D in oat

表4 2,4-D丁酯對燕麥安全性的影響Table 4 The influence of 2,4-D Butyl ester on oat security

注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)

Note:Values with different small letters show significant differences among treatments at the 0.05 level

3 討論

Singh和Uller[19]用同位素示蹤法研究了2,4-D、磺草靈和殺草強(qiáng)在水葫蘆中的運(yùn)移情況，發(fā)現(xiàn)2,4-D進(jìn)入水葫蘆體內(nèi)后一部分被代謝，一部分通過木質(zhì)部和韌皮部運(yùn)輸，從母本植株轉(zhuǎn)移至子體的量在子體植株2葉階段最大。14C標(biāo)記結(jié)果顯示，施藥后6 d，水葫蘆中仍有72.1%的2,4-D未代謝。本試驗中2,4-D丁酯的研究與之類似，即部分分解代謝，部分積累在體內(nèi)。2,4-D丁酯進(jìn)入植物體后水解生成2,4-D進(jìn)而發(fā)揮作用[5]，從施藥后直到灌漿期(藥后58 d)，燕麥植株中均檢測出一定濃度的2,4-D丁酯和2,4-D。

2,4-D類除草劑除直接作用于植物的各類生理代謝過程外，也與植物體中的天然激素相互作用進(jìn)而參與對植物生理生化過程的調(diào)控。2,4-D丁酯會刺激禾本科植物，使其體內(nèi)乙烯合成相關(guān)基因超表達(dá)，生成大量乙烯[20]。不同于天然植物生長素通過形成共軛結(jié)構(gòu)和降解，很快就失去活性[21]，2,4-D丁酯作用時間很長，乙烯的合成量會比正常生長情況下高，從而抑制莖的伸長生長、促進(jìn)莖和根的增粗、促進(jìn)莖的橫向增長[20]。本試驗中燕麥植株矮化現(xiàn)象明顯，尤其是1 050 mL·hm-2劑量下，燕麥株高降低了12.90%，即使是低濃度處理株高也略有降低。此外，2,4-D丁酯還會刺激脫落酸(abscisic acid，ABA)的生物合成。ABA生物合成的限速酶是9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶(nine-cis-epoxy carotenoid dioxygenase，NCED)，而具有催化作用的NCED前體物質(zhì)由NCED家族基因編碼[22]。Hansen等[23]用0.5 mM吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)處理豬殃殃(Galiumaparine)，發(fā)現(xiàn)IAA可以誘導(dǎo)乙烯觸發(fā)NCED基因家族的表達(dá)，從而促進(jìn)ABA的合成，即豬殃殃芽組織中IAA誘導(dǎo)氨基環(huán)丙烷羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)合酶基因過表達(dá)，導(dǎo)致乙烯大量合成進(jìn)而促進(jìn)ABA的生物合成，ABA介導(dǎo)氣孔關(guān)閉導(dǎo)致植物死亡。本試驗中，2,4-D是生長素類似物，與IAA有著相似的作用機(jī)理，1 050 mL·hm-2施用劑量下，燕麥短期內(nèi)出現(xiàn)頂端萎蔫、下垂、葉尖發(fā)紅和藥斑等現(xiàn)象即是這一生理過程的表觀體現(xiàn)。

有研究[14]報道了不同濃度的2,4-D丁酯會導(dǎo)致裸燕麥帶殼率上升，本研究結(jié)果與之一致，2,4-D丁酯處理明顯增加了裸燕麥的帶殼率。燕麥的皮和裸是一對相對性狀，其遺傳模型國內(nèi)外均有研究。葉福鈞等[24]通過多個正反交試驗得出，燕麥的外稃性狀是核質(zhì)基因互作的結(jié)果，不僅受三對獨(dú)立核基因的控制，也被細(xì)胞質(zhì)基因所影響。尹大海等[25]則支持四位點模型，該模型由Jenkins和Hanson[26]提出，即Nn為一對主基因，而N1n1、N2n2和N3n3為修飾基因，N3基因與N1和N2基因的作用方向相反，主基因位點為雜合而N3為純合顯性時產(chǎn)生完全帶皮型籽粒。后續(xù)研究中，多數(shù)學(xué)者支持單基因控制多基因修飾模型，即皮、裸性狀的遺傳受一對顯性主基因N1的控制，并由多對基因進(jìn)行修飾，且受外界環(huán)境因素的影響[26-31]。本試驗中，2,4-D丁酯顯著增加了裸燕麥帶殼率，可能是2,4-D丁酯干擾了該性狀的正常表達(dá)；同時，帶殼種子次年種植收獲后，種子均為裸粒，說明帶殼性狀不是基因突變造成的，不能遺傳，很可能是2,4-D丁酯處理后的生理失調(diào)，帶殼率的升高可能是相關(guān)基因的表達(dá)變化所致，但具體的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

由于裸燕麥品種大多數(shù)是通過與皮燕麥雜交育成的，盡管一般要通過5～6代的嚴(yán)格選擇，但并不能保證完全裸粒，仍然有極少量的帶殼籽?；蛑虚g型存在[14]，本試驗中對照組1.33%的種子帶殼率也說明了這一點。李憲章等[32]研究了2,4-D丁酯誘導(dǎo)野燕麥不孕的原因，發(fā)現(xiàn)施用810 mL·hm-22,4-D丁酯，在5～6葉期野燕麥的不孕率最高，因此認(rèn)為這一時期是野燕麥對2,4-D丁酯敏感的第一個時期；第二個敏感期可能是在性細(xì)胞開始發(fā)育的時期，2,4-D丁酯影響了雌蕊組織中的某些生理過程，致使受精作用不能正常進(jìn)行，從而不能形成正常種子。但是花期并未施用2,4-D丁酯，因此很可能是前期施用2,4-D丁酯在植株體內(nèi)的殘留物造成的。本研究結(jié)果可以很好地解釋2,4-D丁酯殘留量與生育時期之間的關(guān)系，5～6葉期(分蘗期)對應(yīng)于14 d采樣時間點，高濃度下2,4-D殘留量為0.183 mg·kg-1，這與1 d時低濃度下0.193 mg·kg-1的2,4-D含量基本持平，但植株開始出現(xiàn)畸形等藥害現(xiàn)象，說明5～6葉期燕麥對2,4-D丁酯的敏感性更強(qiáng)，與李憲章等[32]結(jié)果一致?；ㄆ趯?yīng)于38 d采樣時間點，花期各處理2,4-D殘留量已經(jīng)很低(≤0.012 mg·kg-1)，但最后的帶殼率顯著上升，說明花期對2,4-D丁酯極其敏感，會造成生殖過程紊亂，影響種子的正常發(fā)育。2,4-D丁酯影響裸燕麥帶殼率的具體分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

750 mL·hm-2以上濃度2,4-D丁酯處理下，2,4-D丁酯殘留量較高，且2,4-D的殘留量與2,4-D丁酯的用量呈正相關(guān)關(guān)系。750 mL·hm-2以上濃度2,4-D丁酯會使裸燕麥產(chǎn)生藥害，苗期出現(xiàn)葉尖發(fā)紅、藥斑、葉面畸形，灌漿至成熟期出現(xiàn)帶殼率升高等癥狀。本試驗3個2,4-D丁酯濃度處理使裸燕麥株高均有一定程度的降低，尤其是1 050 mL·hm-2，裸燕麥株高顯著低于對照。450 mL·hm-2濃度2,4-D丁酯處理下2,4-D丁酯殘留量較低，未產(chǎn)生藥害，對裸燕麥安全。通過2,4-D丁酯殘留量的分析，能夠清楚的解析除草劑殘留劑量與作物藥害之間的關(guān)系，在農(nóng)事活動中應(yīng)科學(xué)使用除草劑，保證豐產(chǎn)增收。