李 波， 方志堅(jiān)， 鄔婷婷， 李 紅，楊 曌， 趙宇佳

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

土地鹽堿化是非常重要的非生物脅迫，嚴(yán)重影響作物的生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力[1]。土壤鹽漬化問題在世界范圍內(nèi)廣泛存在，已成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[2]。高濃度鹽堿會(huì)導(dǎo)致植物體缺水，對(duì)植株有一定的離子毒害作用，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致植株的死亡。在當(dāng)今日益稀缺的土地資源中，鹽堿地的改良利用已成為全球科研界研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一[3]。近年來，以耐鹽植物改善鹽堿土壤的技術(shù)逐漸受到關(guān)注。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一種重要的多年生豆科牧草[4]，除作為飼料牧草外，還可以用作綠肥使用[5]。因其葉片具有排鹽機(jī)制，是一種耐鹽性較強(qiáng)的牧草[6]。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是細(xì)胞生理功能的執(zhí)行者，多個(gè)蛋白質(zhì)通過協(xié)同作用來應(yīng)對(duì)細(xì)胞的一系列生理生化的變化[7]。而植物的耐鹽機(jī)理與多種大分子密切相關(guān)，是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程[8]。同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantization，iTRAQ)技術(shù)是在2004年推出的一種通過對(duì)氨基酸N端及賴氨酸殘基酶解并用同位素標(biāo)記的技術(shù)。該技術(shù)的原理是采用同重同位素標(biāo)簽進(jìn)行肽段標(biāo)記，可同時(shí)對(duì)多達(dá)4(或8)種蛋白樣品進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)定量及差異蛋白功能的生物信息學(xué)分析的蛋白質(zhì)測(cè)定技術(shù)[9]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，iTRAQ技術(shù)因其具有高定量精度的特點(diǎn)而在蛋白組學(xué)中應(yīng)用廣泛[10]。近年來，不斷完善的蛋白組學(xué)技術(shù)在紫花苜蓿的耐鹽分子機(jī)制研究也受到重視，裴翠明[11]等發(fā)現(xiàn)了417個(gè)差異蛋白參與苜蓿幼苗葉片耐NaCl脅迫；馬進(jìn)[12]等人發(fā)現(xiàn)有534個(gè)差異蛋白響應(yīng)鹽脅迫。本研究利用iTRAQ技術(shù)從分子水平上研究紫花苜蓿葉片抗鹽堿機(jī)理，篩選響應(yīng)鹽堿脅迫的差異表達(dá)蛋白，對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋和KEGG注釋，分析在鹽堿脅迫下紫花苜蓿葉片差異表達(dá)蛋白具體的代謝途徑，發(fā)掘抗鹽堿的應(yīng)答機(jī)制，對(duì)鹽堿地的改良、苜蓿耐鹽植株的篩選和植物抗鹽堿功能蛋白的發(fā)掘具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用由黑龍江省畜牧研究所提供的紫花苜蓿WL343HQ種子為試驗(yàn)材料。本實(shí)驗(yàn)Hoagland培養(yǎng)液所用的無機(jī)鹽均購(gòu)自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，RNA采用TRIZOL方法進(jìn)行提取(Cheng D)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)材料及處理 挑選籽粒飽滿的WL343HQ紫花苜蓿種子，用1% HgCl2消毒10 min，40℃溫水浸泡2 h，用無菌水清洗3次將包衣清洗干凈，播種到塑料花盆中，每盆播種50粒。待其幼苗長(zhǎng)到三葉一心期，將長(zhǎng)勢(shì)一致的紫花苜蓿幼苗取出用清水反復(fù)清洗根部，置入稀釋一倍的改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)3 d。將幼苗分為兩組，對(duì)照組(WL-CK)用無菌水培養(yǎng)72 h,實(shí)驗(yàn)組(WL-EG)用150 mmol/L的NaHCO3，Na2CO3摩爾比為9∶1的混合溶液脅迫72 h。選取葉片大小相近的2組紫花苜蓿葉片混合，—80 ℃冷凍保存。培養(yǎng)條件，光照16 h，黑暗8 h，生長(zhǎng)溫度25℃。

1.2.2 蛋白提取、酶解與iTRAQ標(biāo)記 采用丙酮沉淀法提取對(duì)照和鹽堿脅迫苜蓿葉片蛋白，取WH-CK和WH-EG兩個(gè)樣本各0.1 g加到機(jī)械拋光(Mechanically Polished,MP)粉碎管中，各管中加入600 μl裂解液，冰上裂解10min，MP震蕩儀震蕩后冰上裂解15 min，高速冷凍離心機(jī)20 000 g，4℃離心20 min，取上清。利用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，用SDS-PAGE法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，取100 μg樣品加入裂解液補(bǔ)充體積到100 μL，加50 mM DTT，37℃反應(yīng)30 min，再加入10 mM碘乙酰胺室溫避光反應(yīng)30 min，加入丙酮—20℃沉淀2 h后10 000 rpm·min-1離心20 min，取沉淀加入100 μL 100 Mm TEAB充分溶解，按照質(zhì)量比 1∶50(酶∶蛋白)加入Trypsin在 37℃酶解過夜。用iTRAQ 8-113和iTRAQ 8-115分別標(biāo)記無菌水培養(yǎng)和150 mmol·L-1的NaHCO3，Na2CO3混合脅迫培養(yǎng)的葉片蛋白，等量混合后利用C18反相柱對(duì)肽段進(jìn)行預(yù)分離，聯(lián)合LPC-MS-MS進(jìn)行分析。

1.2.3 差異蛋白功能分析 使用Protein Discoverer TM Software 2.1軟件鑒定蛋白質(zhì)，與uniprot-Medicago truncatula-3880.fasta數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用Goatools(http:github.com/tanghaiban/Goatools)軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行顯著性富集分析，當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)大于1.2倍或小于0.83倍且P值小于0.05視為不同樣品間的差異蛋白，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能分析。

1.2.4 qRT-PCR數(shù)據(jù)驗(yàn)證 隨機(jī)選取8個(gè)差異表達(dá)基因用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。提取對(duì)照組(WL-CK)與實(shí)驗(yàn)組(WL-EG)的葉片RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以EF-α基因作為內(nèi)參，設(shè)置三組平行計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 蘇打鹽堿脅迫條件下紫花苜蓿8個(gè)差異表達(dá)基因qRT-PCR引物Table 1 Primers of eight differentially expressed genes used for quantitative real-time PCR in alfalfa under salt-alkali stress

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)鑒定基本信息

為從分子水平上揭示紫花苜蓿的耐鹽機(jī)理，利用iTRAQ技術(shù)對(duì)經(jīng)混合鹽堿脅迫處理后的紫花苜蓿葉片蛋白質(zhì)組進(jìn)行差異性分析，其中鑒定151 683個(gè)二級(jí)圖譜，匹配到圖譜數(shù)為52 760個(gè)；共鑒定到肽段數(shù)為12 373條，蛋白質(zhì)有6 435個(gè)，差異蛋白有3 178個(gè)，篩選統(tǒng)計(jì)共有318個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)蛋白172個(gè)，下調(diào)蛋白146個(gè)。

2.2 差異蛋白GO注釋

GO注釋使基因分為3個(gè)本體，分別為生物過程(Biological Process)，細(xì)胞組分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)。這些蛋白質(zhì)涉及17個(gè)生物過程：其中代謝過程(metabolic process)占53.14%(up 91，down 78)，單一生物過程(single-organism process)占30.19%(up 53，down 43)，細(xì)胞過程(cellular process)占34.91%(up 44，down 67)，刺激響應(yīng)(response to stimulus)占9.43%(up 17，down 13)，生物調(diào)節(jié)(biological regulation)占7.86%(up 9，down 16)，細(xì)胞定位過程(establishment of localization)占5.66%(up 8，down 10)；參與14個(gè)細(xì)胞組分，其中細(xì)胞(cell)占26.73%(up 33，down 52)，細(xì)胞組分(cell part)占26.42%(up 32，down 52)，細(xì)胞器(organelle)占19.18%(up 25，down 36)，細(xì)胞膜成分(membrane part)占18.55%(up 24，down 35)，復(fù)雜大分子(macromolecular complex)占12.58%(up 17，down 23)；包含9個(gè)分子功能，其中催化活性(catalytic activity)占46.54%(up 93，down 55)，結(jié)合(binding)占39.31%(up 58，down 67)，抗氧化活性(antioxidant activity)占3.14%(up 8，down 2)，結(jié)構(gòu)性分子活性(structural molecular activity)占2.52%(up 7，down 1)，轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity)占2.83%(up 5，down 4)，電子載體活性(electron carrier activity)占2.20%(up 3，down 4)。結(jié)果如圖1所示。

2.3 差異蛋白GO富集

通過GO富集發(fā)現(xiàn)，差異蛋白富集在生物過程的有細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)(cellular response to chemical stimulus，11)，活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process,10)，細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(cellular response to oxidative stress,9)，細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)(cellular response to reactive oxygen species,9)，細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)(cellular response to oxygen-containing compound,10)，光合作用(photosynthesis,19)，對(duì)活性氧的反應(yīng)(response to reactive oxygen species，9)，細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)(cellular response to stimulus，20)，蛋白質(zhì)-發(fā)色團(tuán)連接(protein-chromophore linkage，8)，細(xì)胞對(duì)壓力的反應(yīng)(cellular response to stress，10)，光合作用，光捕獲(photosynthesis,light harvesting，6)，細(xì)胞對(duì)過氧化氫的反應(yīng)(cellular response to hydrogen peroxide，6)，過氧化氫分解代謝過程(hydrogen peroxide catabolic process，6)，過氧化氫代謝過程(hydrogen peroxide metabolic process，6)，應(yīng)對(duì)壓力(response to stress，23)，對(duì)過氧化氫的反應(yīng)(response to hydrogen peroxide，6)，對(duì)無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)(response to inorganic substance，9)，防御響應(yīng)(defense response，8)，對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress，10)，對(duì)含氧化合物的反應(yīng)(response to oxygen-containing compound，10)，細(xì)胞對(duì)氧自由基的反應(yīng)(cellular response to oxygen radical，3)，對(duì)氧自由基的反應(yīng)(response to oxygen radical，3)，對(duì)超氧化物的反應(yīng)(response to superoxide，3)，超氧代謝過程(superoxide metabolic process，3)，去除超氧自由基(removal of superoxide radicals，3)，細(xì)胞對(duì)超氧化物的反應(yīng)(cellular response to superoxide，3)，植物型細(xì)胞壁組織(plant-type cell wall organization，2)，對(duì)刺激的反應(yīng)(response to stimulus，30)和對(duì)生物刺激的反應(yīng)(response to biotic stimulus，6)；細(xì)胞組分包括光合作用(photosystem，16)和光系統(tǒng)I(photosystem I，10)；分子功能包括四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding，21)，葉綠素結(jié)合(chlorophyll binding，9)，血紅素結(jié)合(heme binding，12)，金屬離子結(jié)合(metal ion binding，56)，陽(yáng)離子結(jié)合(cation binding，56)，超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activity，3)，作為受體作用于超氧自由基氧化還原酶活性(oxidoreductase activity,acting on superoxide radicals as acceptor，3)，鐵離子結(jié)合(iron ion binding，9)，抗氧化活性(antioxidant activity，10)，甲酰四氫葉酸脫甲酰酶活性(formyltetrahydrofolate deformylase activity，2)，O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性(O-methyltransferase activity，3)，作用于碳水化合物和衍生物的消旋酶和差向異構(gòu)酶活性(racemase and epimerase activity,acting on carbohydrates and derivatives，3)，核酮糖-二磷酸羧化酶活性(ribulose-bisphosphate carboxylase activity，3)，半胱氨酸型肽酶活性(cysteine-type peptidase activity，3)，序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(sequence-specific DNA binding transcription factor activity，2)，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity，2)，過氧化物酶活性(peroxidase activity，7)，消旋酶和差向異構(gòu)酶活性(racemase and epimerase activity，3)，作為受體作用于過氧化物的氧化還原酶活性(oxidoreductase activity,acting on peroxide as acceptor，7)，羧酸結(jié)合(carboxylic acid binding，4)和有機(jī)酸結(jié)合(organic acid binding，4)。結(jié)果如圖2所示。

圖1 蘇打鹽堿脅迫紫花苜蓿葉片組織上調(diào)和下調(diào)蛋白質(zhì)GO注釋Fig.1 GO annotation of up-regulated and down-regulated protein in alfalfa leaf tissue under soda salt-alkali stress

圖2 蘇打鹽堿脅迫紫花苜蓿葉片差異蛋白GO富集Fig.2 GO enrichment of alfalfa leaf differential protein under soda salt-alkali stress

2.4 差異蛋白Pathway富集

通過Pathway富集發(fā)現(xiàn)，53.46%差異蛋白共參與76條代謝通路中，具有顯著性差異(P<0.05)的代謝途徑包括光合作用途徑(3.18%，10)(Photosynthesis)，苯丙素生物合成途徑(2.83%，9)(Phenylpropanoid biosynthesis)，苯丙氨酸代謝途徑(2.52%，8)(Phenylalanine metabolism)和類黃酮生物合成途徑(0.94%，3)(Flavonoid biosynthesis)，結(jié)果如表2所示。

表2 紫花苜蓿鹽堿脅迫下差異蛋白Pathway富集信息Table 2 Pathway enrichment information of alfalfa differential proteins under salt-alkali stress

2.5 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取8個(gè)差異表達(dá)基因，以EF-α為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其中包含6個(gè)上調(diào)表達(dá)基因(c55183_g1，c65586_g1，c68420_g4，c54763_g1，c66291_g3，c48910_g1)和2個(gè)下調(diào)表達(dá)基因(c59095_g1，c70714_g3)。結(jié)果如表3所示。

表3 鹽堿脅迫處理紫花苜蓿差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證Table 3 qRT-PCR verification of differentially expressed genes in alfalfa under salt-alkali stress

3 討論

全球鹽堿地土壤面積在不斷擴(kuò)大，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力產(chǎn)生重大影響，鹽堿脅迫會(huì)導(dǎo)致植物組織損傷，甚至是整個(gè)機(jī)體的紊亂，所有的這些變化均可以在蛋白組學(xué)中進(jìn)一步得到體現(xiàn)。在本研究中，我們主要描述耐壓苜蓿植物對(duì)鹽堿的反應(yīng)，以識(shí)別與壓力相關(guān)的蛋白質(zhì)，并了解應(yīng)激適應(yīng)的可能機(jī)制。蛋白質(zhì)在參與應(yīng)激反應(yīng)的過程中不是單獨(dú)執(zhí)行功能的，而是與其他蛋白質(zhì)之間相互作用來實(shí)現(xiàn)應(yīng)答過程[13]。通過Pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，在鹽堿脅迫處理下紫花苜蓿葉片組織差異表達(dá)蛋白主要參與光合作用途徑、苯丙素生物合成途徑、苯丙氨酸代謝途徑和類黃酮生物合成代謝途徑等。

光合作用途徑中的氧化磷酸化過程在植物體中起重要的作用。在鹽堿脅迫處理下，植物體的光合作用最先受到影響。光合作用是植物生長(zhǎng)發(fā)育所需能量的來源，而氧化磷酸化能夠?qū)⒐夂献饔煤铣傻奶妓衔镅趸瘯r(shí)釋放的能量提供給ADP，進(jìn)而通過偶聯(lián)反應(yīng)合成ATP[14]。能量的儲(chǔ)存與釋放，使植物體的生長(zhǎng)發(fā)育得以進(jìn)行。鹽堿脅迫對(duì)光合作用的影響既可以通過氣孔和葉肉的擴(kuò)散來限制光合代謝過程，也可以是由多重脅迫疊加產(chǎn)生的氧化脅迫進(jìn)行抑制[15]。本研究光合作用涉及的十種蛋白質(zhì)中，葉綠素a/b結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素c氧化酶、ATP合成酶受鹽堿脅迫顯著下調(diào)，這些蛋白與光反應(yīng)密切相關(guān)。鹽堿脅迫可以抑制CO2的固定，使卡爾文循環(huán)中相應(yīng)酶的活性降低，這些酶包括碳酸酐酶(CA)，磷酸核糖激酶(PRK)，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)和鐵氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶(FTR)等[16]。CA可以提高葉綠體中CO2的濃度使RuBisCO的羧化速率加快[17]。參與光反應(yīng)的下調(diào)蛋白質(zhì)可以降低還原力、減少活性氧的產(chǎn)生，使紫花苜蓿在遭受鹽堿脅迫時(shí)擁有更活躍的光合作用能力和氧化磷酸化進(jìn)程，從而加快植物體的新陳代謝，增強(qiáng)植物的耐鹽性。

苯丙素生物合成途徑是植物中重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑，苯丙素類是具有生理活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由苯丙氨酸代謝途徑衍生，在非生物和生物脅迫的反應(yīng)中起作用[18]。苯丙是由氨基酸苯丙氨酸合成的次生代謝產(chǎn)物[19-20]，苯丙素生物合成途徑主要的終產(chǎn)物之一是木質(zhì)素，木質(zhì)素是酚類雜聚物，是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)組分，可提高機(jī)械強(qiáng)度，抵御逆境脅迫造成的傷害[21]。除了木質(zhì)素之外，該途徑產(chǎn)生各種各樣的代謝物，執(zhí)行生物體大量的生物功能[22]。研究表明，逆境脅迫下植物體內(nèi)的苯丙素生物合成途徑被激活，苯丙氨酸氨基裂解酶的活性迅速上升。在苯丙氨酸代謝途徑中，過氧化物酶參與生物的合成，可催化氧化胺類、酚類和過氧化氫，從而降低植物體內(nèi)的酚類和胺類化合物毒性，降低過氧化氫含量，從而減輕活性氧損害，提升植物的抗逆能力[23]。本研究中苯丙素生物合成和苯丙氨酸代謝涉及的十種蛋白質(zhì)中，過氧化物酶、巢菜甙水解酶、咖啡酰-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶、甘露醇脫氫酶和轉(zhuǎn)氨酶活性在鹽堿脅迫處理下顯著上調(diào)，提高植物抵御逆境脅迫的能力。

類黃酮是植物多酚次級(jí)代謝產(chǎn)物，類黃酮的主要分為花青素，黃酮醇，黃烷醇和原花色素(PA)，在不同植物種類的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段以化合物的形式廣泛分布[24]。它們具有廣泛的功能，如抗氧化活性，紫外線防護(hù)，防御植物病原體和生長(zhǎng)素的調(diào)控等[25]。在許多植物中，類黃酮生物合成過程在應(yīng)激脅迫中起關(guān)鍵作用。在鹽脅迫下，過表達(dá)AtROS1轉(zhuǎn)基因煙草編碼類黃酮生物合成和抗氧化途徑相關(guān)的酶表達(dá)較高，增加了對(duì)鹽脅迫的耐受性[26]。在大豆中根中，鹽脅迫加強(qiáng)了黃酮化合物的積累，黃酮類化合物可以在大豆對(duì)鹽脅迫的耐受性下游發(fā)揮重要作用，確定了三種查爾酮異構(gòu)酶表達(dá)水平顯著增加[27]。海馬齒在響應(yīng)鹽脅迫時(shí)，根和葉片中的黃酮類和糖脂協(xié)調(diào)反應(yīng)，誘導(dǎo)高滲物，最大限度減少鹽誘導(dǎo)的損害[28]。本研究類黃酮生物合成途徑涉及的三種蛋白質(zhì)中，查爾酮異構(gòu)酶的表達(dá)顯著上調(diào)，使紫花苜蓿在應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)啟動(dòng)防御機(jī)制，從而防止植物受到氧化和離子脅迫。

4 結(jié)論

采用iTRAQ技術(shù)分析鹽堿脅迫下紫花苜蓿葉片中蛋白表達(dá)差異，篩選到172個(gè)上調(diào)蛋白和146個(gè)下調(diào)蛋白，通過GO注釋和KEGG注釋發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白的功能涉及光合作用途徑、苯丙素生物合成途徑、苯丙氨酸代謝途徑和類黃酮生物合成途徑。