浮晶晶， 郭亞洲， 黃文穎， 郭 蓉， 路 浩， 吳晨晨， 趙寶玉,*

(1. 西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院中國西部有毒植物研究所， 陜西 楊凌 712100;2. 青海省動物疫病預防控制中心， 青海 西寧 810001)

美國天然草地面積3.38億hm2，占世界草地面積(35億hm2)的9.70%，位居世界第三[1-2]。美國90.00%天然草地分布于西經(jīng)100°以西的大平原和西部山間高原、盆地之間[1]，其間的北美大草原面積約1.54億hm2，是世界上面積最大的禾草草地，擁有溫帶海洋性氣候和地中海氣候，海拔2 000 m左右，年平均降雨量為1 000～1 500 mm，特殊的地理環(huán)境和氣候條件為美國草地畜牧業(yè)發(fā)展提供了豐富的資源[3]。

19世紀60年代初美國西部大開發(fā)，是當時內(nèi)戰(zhàn)后美國政治經(jīng)濟發(fā)展的必然趨勢。但由于盲目開發(fā)，西部人口急劇增加、草原超載過牧、人為過度毀草開荒造地，導致地表植被破壞，土壤風蝕加劇，草場荒漠化，瘋草(Locoweed)、飛燕草(Consolidaajacis)、羽扇豆(Lupinusmicranthus)、毒人參(Coniummaculatum)等毒草泛濫，給草地畜牧業(yè)和草地生態(tài)造成嚴重危害。20世紀30年代美國西部遭遇的沙塵暴襲擊，即著名的“黑風暴”，給美國帶來巨大的生態(tài)災難[3-4]，是西部大開發(fā)造成生態(tài)破壞的真實反映。據(jù)報道，1978年美國西部毒草造成的經(jīng)濟損失超過1.07億美元，1988年后每年造成的經(jīng)濟損失達2.50億美元[5-6]。鑒于草地毒草災害的嚴重性，促使美國農(nóng)業(yè)部成立有毒植物研究所，專門開展天然草地毒草種類調(diào)查、毒性災害評估和動物中毒病診斷及控制技術(shù)研究[7-8]。

瘋草是指動物采食毒草后引起以慢性神經(jīng)機能障礙為特征，表現(xiàn)發(fā)瘋樣癥狀的一類毒草統(tǒng)稱，由此引起的動物中毒稱為瘋草病[9-12]。瘋草是世界范圍內(nèi)危害草地畜牧業(yè)健康發(fā)展的毒草[13]，主要分布在北美洲的美國、加拿大和墨西哥，南美洲的巴西、阿根廷和秘魯，亞洲的中國、蒙古、哈薩克斯坦和伊朗，歐洲的俄羅斯、西班牙和冰島，大洋洲的澳大利亞、新西蘭等國家[14-18]。本文通過對已有文獻資料查閱，就美國瘋草類植物的研究歷史、種類分布、災害狀況、毒理學和瘋草防控技術(shù)等方面的進展進行綜述，旨在為我國天然草地動物瘋草中毒病的致病機制、綜合防控與利用技術(shù)研究提供借鑒。

1 美國瘋草研究歷史

回顧美國瘋草及其中毒病的研究歷史，可追溯到18世紀末[19]。1873年爆發(fā)了嚴重的瘋草中毒病，這是美國動物瘋草中毒的最早報道[11]。此后關(guān)于動物瘋草中毒的報道日益增多，引起了草原管理和獸醫(yī)毒理學工作者的關(guān)注。根據(jù)文獻資料可將美國動物瘋草中毒病研究劃分四個階段。

第一階段：瘋草毒性災害發(fā)現(xiàn)。1873年美國首次報道加利福尼亞州南部動物瘋草中毒[20]，當時確證植物種屬為黃芪屬(Astragalus)，并查明北美300多種黃芪屬植物中13種可引起動物中毒；1883年出現(xiàn)的瘋草中毒證實植物種屬為棘豆屬(Oxytropis)[21]；1957年和1972年加利福尼亞洪堡縣和阿爾伯塔省西南部都出現(xiàn)了瘋草中毒[22-23]；1982年和1984年出現(xiàn)了牛和麋鹿瘋草中毒[24-25]；隨后在1983—1985年、1991—1993年、1998年美國相繼爆發(fā)了3次影響范圍大的瘋草中毒，導致大批動物中毒死亡[26]。Thompson等[27]報道，美國每年由絹毛棘豆(Oxytropissericea)和密柔毛黃芪(Astragalusmollissimus)引起的動物中毒所造成的經(jīng)濟損失超過2.34億美元。

第二階段：瘋草毒素確證。從1873年發(fā)現(xiàn)瘋草病到1982年確定苦馬豆素(Swainsonine,SW)是瘋草的主要毒性成分，美國經(jīng)歷了100多年的漫長過程。1905-1907年Marsh[28]證實動物瘋草病與采食黃芪屬和棘豆屬毒草有關(guān)；1926年，Couch[29]首次從蘭伯氏棘豆(Oxytropislambertii)中分離出瘋草毒素，該毒素可引起貓瘋草病，但因當時分離手段所限未鑒定結(jié)構(gòu)；1936年，F(xiàn)raps等[30]從密柔毛黃芪中分離出一種有毒成分取名洛柯因(Locoin)，當時因洛柯因和生物堿試劑反應不明顯，未確定為生物堿；70年后病理學研究發(fā)現(xiàn)，斑莢黃芪(Astragaluslentiginosus)、絹毛棘豆(Oxytropissericea)與灰苦馬豆(Swainsonacanesces)中毒病理組織學變化十分相似，呈現(xiàn)神經(jīng)及內(nèi)臟細胞的空泡化，而且同遺傳性甘露糖貯積癥(Mannosidosis)相似[31]；1979年Colegate等[32]利用甘露糖苷酶作靶點，從灰苦馬豆中分離出甘露糖苷酶抑制劑生物堿單體，命名苦馬豆素。隨后，1982年美國Molyneux和Panter等[5,33]依據(jù)灰苦馬豆和瘋草中毒之間的相互聯(lián)系，用苦馬豆素作標準樣品，從斑莢黃芪和絹毛棘豆中分離出苦馬豆素，從而確定苦馬豆素是瘋草的主要毒性成分。此后Gardner等[34]和Molyneux[35]等陸續(xù)從數(shù)10種瘋草中檢測出苦馬豆素；1989年，James等[36]在相關(guān)國際會議上指出，苦馬豆素是引起動物瘋草中毒特征癥狀的唯一毒素。

第三階段：苦馬豆素毒性研究。1982年，苦馬豆素被確定為瘋草毒性成分后，許多學者用苦馬豆素純品復制大鼠、綿羊、豬和牛等動物中毒模型，開始苦馬豆素毒性與毒理研究。1984年，Tulsiani等[37]在豬飲水中加入100 mg·kg-1·d-1苦馬豆素，71 d后豬出現(xiàn)典型瘋草中毒癥狀，組織學檢查細胞胞漿空泡變性，肝細胞高爾基體甘露糖苷-Ⅱ降低，組織中低聚糖明顯增加；1985年，Novikoff等[38]經(jīng)大鼠毒性試驗證明，苦馬豆素能迅速引起肝、腎細胞空泡變性，尿液中低聚糖排泄增加；1991年，James等[39]在海拔3 000 m地區(qū)將苦馬豆素混入乳中喂給犢牛，復制出犢牛典型的瘋草中毒模型，并證明苦馬豆素可代謝轉(zhuǎn)移到乳中引起幼畜中毒；1995年，Steglmeier等[40]通過每天給綿羊以1.00 mg·kg-1體重的劑量進行苦馬豆素染毒，證明苦馬豆素具有蓄積毒性，與瘋草中毒需數(shù)周或更長時間的研究結(jié)果一致。

第四階段：瘋草災害防控技術(shù)研究。20世紀60年代后期，美國為了應對草地退化，在《泰勒放牧法》的基礎(chǔ)上頒布了《自然保護區(qū)法》、《國家環(huán)境政策法》、《公共草地改良法》、《草地革新法》等系列與草地管理相關(guān)的法律法規(guī)，形成以法管草的良性循環(huán)[4,41]。對于瘋草等毒害草，最初美國控制手段主要是采用化學性除草劑進行大規(guī)模化學防控[42-43]。但因長期依賴化學農(nóng)藥出現(xiàn)藥物殘留、環(huán)境污染等種種弊端，80年代后期開始生物防治的研究工作，陸續(xù)開展了種群競爭、生物防控、條件性避食、藥物防治、合理放牧、控制放牧期等技術(shù)研究，開展了生態(tài)治理[44-49]。此外，美國還加大了立法和科研投入，制訂了相關(guān)法律以積極應對毒草毒性災害的發(fā)生，建立了農(nóng)業(yè)部西部有毒植物研究所，進行草地毒草成災規(guī)律、風險評估，監(jiān)測預報及治理體系研究，全面開展毒草綜合防控工作。到20世紀末草地植被和生態(tài)系統(tǒng)恢復重建，瘋草毒性災害發(fā)生頻率和風險逐漸減少。

2 美國瘋草種類與地理分布

美國草地主要分為六大區(qū)域，如圖1所示[3-4,50]。通過資料查閱發(fā)現(xiàn)美國西部豆科黃芪屬和棘豆屬植物超過300種，大多數(shù)是優(yōu)良牧草或綠肥植物，但有些動物采食后會引起中毒。經(jīng)毒性分析，美國西部天然草地大約有瘋草類毒草49種(含變種)，其中黃芪屬44種(含變種)、棘豆屬5種(含變種)，分布廣且對草地畜牧業(yè)危害嚴重的瘋草主要是黃芪屬的密柔毛黃芪及其變種、斑莢黃芪及其變種和沃頓黃芪(Astragaluswootoni)，棘豆屬的蘭伯氏棘豆和絹毛棘豆等。美國西部天然草地瘋草類毒草種屬及分布見表1[10,13,51-56]。

表1 美國西部天然草地瘋草類毒草種屬及分布Table 1 Species and distribution of locoweed in the natural grassland of the western United States

續(xù)表1

圖1 美國草地區(qū)域劃分示意圖Fig.1 Schematic diagram of grassland area division in USA

3 瘋草災害狀況

3.1 對草地畜牧業(yè)的危害

對草地畜牧業(yè)的危害瘋草對畜牧業(yè)造成多種形式的損失，包括慢性中毒引起動物體重下降和死亡，繁殖效率降低造成畜群結(jié)構(gòu)失衡、機體免疫系統(tǒng)損害和其他慢性病等健康問題[20,27,57]，也包括牧場管理、土地價值降低、額外的飼料和藥物支出、獸醫(yī)人員增加和牧草損失等潛在的成本增加。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計，1984年西部17個州毒草災害造成28.1萬頭牛和26.4萬只羊中毒和繁殖障礙，直接經(jīng)濟損失16910萬美元；1992年西部17個州41.7萬頭牛和32.3萬只羊中毒和繁殖障礙，直接經(jīng)濟損失24 509萬美元，其中以瘋草中毒造成的損失最嚴重[6,58]。19世紀60年代初到20世紀中期，是美國西部天然草地瘋草災害發(fā)生最為嚴重的時期，給美國畜牧業(yè)造成巨大損失。

3.2 對草地生態(tài)的危害

由于干旱、過度放牧和亂墾亂挖等自然和人為因素的干擾，優(yōu)良牧草競爭力減弱，種類和數(shù)量減少，瘋草以其抗寒旱、抗病蟲害、生命力強、繁殖快等特征，快速適應惡劣環(huán)境，形成優(yōu)勢物種[5,58]，與牧草爭奪營養(yǎng)、空間、水分和陽光，使得草地植物種群結(jié)構(gòu)失衡，多樣性降低，生態(tài)系統(tǒng)被破壞，草地利用價值降低。

3.3 對動物機體的損害

3.3.1 臨床表現(xiàn) 馬、牛、羊?qū)Ο偛菝舾?，嚙齒動物有一定耐受性，連續(xù)采食瘋草2—3周后發(fā)病，進程呈慢性經(jīng)過表現(xiàn)為嗜睡、被毛粗亂、眼神僵直、虛弱、消瘦、嘔吐、神經(jīng)緊張、離群、喪失吃喝能力、隨意運動缺乏協(xié)調(diào)、姿勢異常、抑郁和昏迷、后肢無力或僵硬、共濟失調(diào)。隨后，肢體剛度增加，難以維持平衡，多向左臥，痙攣，或走圓圈、劃船和角弓反張，前庭耳蝸缺陷。牛會發(fā)生水腫，身體骨骼畸形、暴躁、性欲降低、精子和卵子產(chǎn)生減少等，高海拔地區(qū)會發(fā)生充血性心力衰竭[59-60]。

3.3.2 體液相關(guān)指標變化 病畜血液常規(guī)檢查紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血紅蛋白含量、紅細胞壓積值下降，中后期血液涂片染色顯示外周血淋巴細胞或單核細胞出現(xiàn)空泡化[61]；血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alamine aminotransferase,ALT)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性明顯升高，血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)含量升高。α-甘露糖苷酶活性下降，可降低到正常的50%以下[62]；病畜中后期尿液低聚糖含量升高，尿低聚糖中的甘露糖明顯增加[61,63-64]。

3.3.3 病理學損傷 大體剖檢尸體極度消瘦，血液稀薄，腸系膜血管淤血，淋巴結(jié)腫脹，切面濕潤有滲出。胸腹腔有少量積液，心臟擴張，心肌柔軟，肺臟表面有淤血灶，腦膜血管淤血，其余臟器無明顯肉眼病變；組織病理學檢查可見神經(jīng)及實質(zhì)器官細胞呈現(xiàn)廣泛空泡變性，特別是小腦浦肯野氏細胞空泡變性最明顯[16,17,60,65](圖2)；超微結(jié)構(gòu)上空泡變性在丘腦和小腦浦肯野細胞和星形膠質(zhì)細胞中明顯，其中大多數(shù)是光學空泡被膜限定。在一些空泡中觀察到膜碎片、網(wǎng)狀或致密顆粒和無定形物[59]。

圖2 浦肯野細胞嚴重空泡(HE 40×)Fig.2 Purkinje cells are heavily vacuolated

4 瘋草毒性成分研究

4.1 毒素的吸收與代謝

苦馬豆素屬吲哚里西啶生物堿，易溶于水，在動物消化道能迅速吸收，并通過尿液、糞、乳汁排出體外[60]。1993年，Bowen等[66]報道，小鼠一次靜脈注射苦馬豆素，血清中半衰期約32 min；1994年Goss等[67]在人類醫(yī)學臨床研究中，持續(xù)靜脈注射苦馬豆素0.050 mg·kg-1和0.550 mg·kg-1，血清半衰期大約為12 h；1993年，Bowen等給小鼠一次靜脈注射氚化苦馬豆素，發(fā)現(xiàn)肝臟和腎臟中苦馬豆素含量最高，但很快移入膀胱中排出，認為慢性瘋草中毒導致的肝腎損傷可能與苦馬豆素含量高相關(guān)；1995年，Steglmeier等[68]發(fā)現(xiàn)，采食瘋草的綿羊全血、骨骼肌、腦、甲狀腺、肝和腎臟均含有苦馬豆素，腎和肝臟比其它組織高2～4倍，其他組織苦馬豆素含量與血液相近，且苦馬豆素在這些組織中的含量與瘋草采食量直接相關(guān)。經(jīng)測定綿羊血清苦馬豆素清除半衰期約達20 h，肝腎清除較慢，半衰期分別為60 h和51 h。

4.2 瘋草產(chǎn)毒機制研究

20世紀30年代牲畜黑麥草(Loliumperenne)中毒事件給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，究其原因是牲畜采食了攜帶內(nèi)生真菌的黑麥草所致，這種內(nèi)生真菌感染能產(chǎn)生生物堿毒素，掀起了植物次生代謝產(chǎn)物與內(nèi)生真菌互作關(guān)系研究的高潮。20世紀末人們從瘋草中分離出內(nèi)生真菌，初步認為瘋草中苦馬豆素產(chǎn)生與內(nèi)生真菌感染密切相關(guān)[69]。2003年，Braun等[70]從密柔毛黃芪、絹毛棘豆和藍伯氏棘豆分離出內(nèi)生真菌，鑒定為埃里磚格孢屬真菌(Embellisia)，證實能產(chǎn)生苦馬豆素；2004年，Gardner等[71]對藍伯氏棘豆16個種群比較試驗發(fā)現(xiàn)，高水平苦馬豆素與內(nèi)生真菌存在有關(guān)，低水平苦馬豆素與內(nèi)生真菌缺失有關(guān)；2008年，Ralphs等[72]從部分棘豆屬和黃芪屬植物中分離出內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)苦馬豆素含量與內(nèi)生真菌感染程度呈正相關(guān)；2009年，Cook等[55,73-76]測定含苦馬豆素瘋草中內(nèi)生真菌含量是不含苦馬豆素植物的10倍以上，并將埃里磚格孢屬真菌重新鑒定為波狀芽管蠕孢屬(Undifilum)。結(jié)果證明，內(nèi)生真菌主導苦馬豆素合成，是瘋草類植物苦馬豆素的主要來源[77-78](圖3)。

圖3 瘋草-動物-內(nèi)生真菌三者間的關(guān)系Fig.3 The relationship between locoweed, animals and endophytic fungi

5 瘋草中毒機理研究

苦馬豆素陽離子和甘露糖陽離子的半椅狀空間結(jié)構(gòu)十分相似，與α-甘露糖苷酶親合性很高，是α-甘露糖苷酶特異性抑制劑[36,79]。α-甘露糖苷酶是一種糖苷水解酶，廣泛存在于人、鼠、牛、羊、禽類、昆蟲和植物等真核細胞的溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、胞漿和其他細胞器中，主要參與蛋白質(zhì)糖基化和糖蛋白聚糖水解修飾，在低聚糖降解和糖蛋白成熟過程中發(fā)揮重要作用[80]?？囫R豆素主要是通過抑制溶酶體α-甘露糖苷酶、高爾基體α-甘露糖苷酶-Ⅱ和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/胞質(zhì)α-甘露糖苷酶活性，使細胞內(nèi)蛋白的N-糖基化合成、加工、轉(zhuǎn)運以及富含甘露糖的寡聚糖代謝等過程發(fā)生障礙[32,81]，N-聚糖代謝異常，低聚糖大量蓄積，造成蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)改變，影響細胞黏附、細胞遷移、細胞生長及細胞分化等生理過程[10,81-83]。病理組織學變化主要表現(xiàn)為細胞出現(xiàn)廣泛空泡變性，使動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和實質(zhì)器官受到損害，造成細胞功能紊亂，尤其是神經(jīng)細胞，臨床上主要表現(xiàn)神經(jīng)癥狀[16]。當生殖器官組織細胞發(fā)生空泡變性時，可導致繁殖機能障礙。

6 瘋草中毒防治技術(shù)研究

19世紀60年代初到20世紀中期，是美國瘋草災害發(fā)生最為嚴重的時期，受到了美國草地管理部門的高度重視。1954年，美國農(nóng)業(yè)科學院有毒植物研究實驗室在猶他州州立農(nóng)學院成立；1955年，薩利納有毒植物研究所并入猶他州有毒植物研究實驗室[84]；2004年，美國在猶他州州立大學建立了新的有毒植物研究所，是當時世界上有毒植物研究的權(quán)威機構(gòu)，專門從事有毒植物種類調(diào)查、毒性災害評估、有毒植物毒理學、動物中毒病致病機理、牧場管理及預防控制技術(shù)等研究[6,8]。目前，美國對瘋草及其動物中毒病的防治技術(shù)研究，主要是從保護草地生態(tài)，從瘋草-動物-草地三者相互依存關(guān)系出發(fā)，開展多種技術(shù)手段預防和控制瘋草災害的發(fā)生，防治技術(shù)分為針對瘋草防控、針對動物避免中毒防治和綜合防控技術(shù)三類(表2)。

表2 美國天然草地瘋草及其動物中毒病防治技術(shù)Table 2 American natural grassland locoweed and its animal poisoning disease prevention and control technology

續(xù)表2

瘋草及其中毒病防治技術(shù)中，傳統(tǒng)的物理和化學防控技術(shù)由于存在局限性、特異性、生物安全性以及嚴重破壞草地植被和造成生態(tài)污染等缺點，目前已經(jīng)不再采用。接種瘋草病原菌、放養(yǎng)食瘋草類昆蟲、種植競爭性牧草以及避食訓練雖然在瘋草綜合防控中顯示出良好效果，但要真正應用于實際中生產(chǎn)還需做深入研究；瘋草毒素疫苗注射是預防動物瘋草中毒的理想方法，但存在瘋草毒素疫苗抗原性低、免疫機制不清楚、疫苗成本高等不足，在實際生產(chǎn)中很難推廣。隨著人們對瘋草生態(tài)作用認識的深入以及草地管理體制的健全，更多采取合理放牧、控制放牧期、及時隔離飼養(yǎng)等綜合技術(shù)，其核心是設計合理的放牧管理措施，減少草場放牧壓力，使動物盡可能地少接觸瘋草來預防中毒發(fā)生，效果較為理想。

7 展望

天然草地動物瘋草中毒問題是一個世界性問題，長期以來一直困擾著世界草地畜牧業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，特別是對美國、加拿大、澳大利亞、墨西哥和中國等草地資源大國的草地畜牧業(yè)造成嚴重損失，引起各國草地管理部門的重視，相繼開展了瘋草生物學、生態(tài)學、毒物學、毒理學以及預防與防控技術(shù)研究，在瘋草致病機理和防控技術(shù)方面取得重要進展[100]。美國是世界上開展瘋草研究最早的國家，從19世紀末就開始瘋草種類分布調(diào)查、災害狀況評估、中毒病致病機理和防控技術(shù)研究，在應對瘋草災害問題上具有豐富的經(jīng)驗，尤其是在瘋草預防控制技術(shù)方面，擺脫了傳統(tǒng)的防除策略，提出了以生態(tài)治理為核心的瘋草災害綜合防控技術(shù)體系，對有效控制瘋草蔓延及其災害的發(fā)生發(fā)揮了積極作用。中國是瘋草災害大國，有瘋草類毒草47種，面積超過1100萬hm2，約占全國草地總面積的2.80%，年直接經(jīng)濟損失超過幾十億元[101]。然而，中國對瘋草研究起步較晚，目前主要采取物理和化學防控技術(shù)控制瘋草的蔓延和擴散，雖然在一定程度上解決了瘋草中毒問題，但如何從根本上解決瘋草成災及其毒害還沒有很好的措施，尤其是在物種競爭、生物控制、控制放牧期、牧場科學管理等方面技術(shù)缺乏[102]。盡管中美兩國國情不同，但在緯度、溫度、地勢、海拔、地貌、氣候環(huán)境等地理環(huán)境上中國與美國具有相似性。因此，美國在瘋草控制方面的成功經(jīng)驗，對中國瘋草的科學防控具有重要參考價值。