張艷芹 吳 迪 鄧夢琪 常翔宇 苗勁蔚

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006)

子宮內(nèi)膜異位癥 (endometriosis，EMs)是指子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)異位到宮腔以外的部分，以卵巢、子宮直腸陷凹、子宮骶韌帶等部位最常見，是生育期女性常見病、多發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)7%～10%[1]。EMs患者中更是高達(dá)50%伴有不孕或盆腔疼痛[2]。EMs患者的異位病灶與正常在位子宮內(nèi)膜相似有明顯的激素依賴性，就EMs發(fā)病的侵蝕性、復(fù)發(fā)性和激素依賴性特征又與惡性腫瘤的生長有很大的相似性。目前關(guān)于EMs發(fā)病有經(jīng)血逆流、 體腔上皮化生等多種學(xué)說，其中以經(jīng)血逆流學(xué)說最被接受[3]。然而研究[4]證明90%的育齡期女性都存在經(jīng)血逆流現(xiàn)象，只有10%～15%的女性發(fā)病。可見經(jīng)血逆流可能是EMs發(fā)病的重要誘因，但不是發(fā)病的決定因素。EMs不僅發(fā)病率高，而且治療棘手，手術(shù)治療后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)50%[5]。更為嚴(yán)重的是近年來EMs纖維化患者特定類型卵巢癌的發(fā)病率較正常育齡期女性有明顯的上升，目前研究[6]顯示EMs的基本病變?yōu)楫愇坏淖訉m內(nèi)膜組織在雌激素的作用下周期性剝脫，出血并被其周圍組織包裹繼而發(fā)生纖維化，形成異位結(jié)節(jié)最終形成盆腔粘連，因而導(dǎo)致慢性盆腔疼痛、不孕、月經(jīng)異常等一系列癥狀。為探索EMs發(fā)病的基礎(chǔ)以及EMs纖維化與盆腔疼痛及不孕的關(guān)系，針對EMs發(fā)病及進(jìn)展的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究成為EMs研究的重點(diǎn)。目前關(guān)于EMs纖維化的研究有建立永生化細(xì)胞系和內(nèi)膜異位細(xì)胞原代培養(yǎng)兩種方法。但無論是通過癌細(xì)胞誘導(dǎo)還是基因水平改變建立EMs纖維化細(xì)胞系，其代表性都遠(yuǎn)低于EMs細(xì)胞原代培養(yǎng)。因此本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的EMs原代細(xì)胞分離方法，分離出EMs間質(zhì)細(xì)胞。并使用分子生物學(xué)方法檢測原代細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。探究EMs 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞與EMs在位及正常在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)的差異。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集

收集2017年9月-2018年9月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院行手術(shù)治療的EMs患者共12例及非子宮腺肌癥子宮肌瘤患者9例。患者年齡22～48歲。所有患者術(shù)前未接受過激素類藥物治療，無其他女性生殖系統(tǒng)相關(guān)內(nèi)分泌、代謝、免疫疾病。無惡性腫瘤病史。入院時(shí)心、肺、肝、腎等功能檢查無明顯異常。該研究經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：2018-KY-002-01。入選患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國 Thermo Fisher Scientific公司) 、超凈細(xì)胞工作臺 ( 美國 Thermo Fisher Scientific公司)、微量可調(diào)移液槍(法國Glison公司) 、Eclipse TS100-F倒置光學(xué)顯微鏡 ( 日本 Nikon 公司) 、MULTIFUGE X3R 臺式離心機(jī)(美國 Thermo Fisher Scientific公司) 和Precision GP 10 型水浴鍋( 美國 Thermo Fisher Scientific公司)、不銹鋼細(xì)胞篩直徑74 μm，200目/150 μm，100目(南京公路牌)、免疫熒光顯微鏡(日本 Nikon公司)。

1.3 主要試劑

1∶1 DMEMs-F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(美國Life公司)、1×PBS溶液(北京索萊寶公司)、 Ⅳ型膠原酶(美國Sigma公司)；0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶-EDTA溶液(北京索萊寶公司)、鼠抗人波形蛋白(美國CST公司，D21H3)、兔抗CTGF抗體(美國CST公司，D8Z8U)、兔抗COL1A1抗體(美國CST公司，#84336)及兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(美國CST公司,D4K9N)、青鏈霉素(北京索萊寶公司)。

1.4 原代細(xì)胞分離培養(yǎng)

在嚴(yán)格無菌條件下，取新鮮EMs在位、異位及正常人子宮內(nèi)膜組織，立即放入冰盒運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室(從組織離體至細(xì)胞分離在2 h之內(nèi)完整)。根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]所提供的EMs原代細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行不斷實(shí)踐及改進(jìn)，通過新的實(shí)驗(yàn)方案對EMs子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行原代分離。具體分離操作：(1)在超凈工作臺內(nèi)使用PBS將新鮮組織沖洗3次，清洗掉組織上的血液及巧克力囊液。(2)將組織分為兩份，一份用組織標(biāo)本固定液保存，用免疫組織化學(xué)法檢測，另一部分放入6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，用眼科剪剪成0.5～1.0 mm碎塊，肉眼觀呈糊狀。(3)加入3倍體積已經(jīng)預(yù)加溫至37 ℃的0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液，混勻置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化5～10 min，消化過程中不斷吹打混勻。(4)消化后置于150 μm，100目細(xì)胞濾過網(wǎng)過濾。(5)將濾過液加入2倍體積的含10%(體積分?jǐn)?shù))FBS及1%(體積分?jǐn)?shù))1× PS雙抗的1∶1 DMEMs-F12細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化。(6)過濾后的上層組織回收至6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿再次加入3倍體積的預(yù)加溫至37 ℃的0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液繼續(xù)消化10～15 min。同樣重復(fù)上述步驟，將消化結(jié)束后的液體通過150 μm，100目細(xì)胞濾過網(wǎng)，過濾液加入2倍體積含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)液終止消化。(7)將所有濾過液收集一起，通過74 μm，200目細(xì)胞濾過網(wǎng)。(8)將過濾后的細(xì)胞懸著液轉(zhuǎn)移入50 mL離心管中，700 r/min離心3 min，移除上清液(此處可保留1 mL離心后的細(xì)胞懸浮液，增加細(xì)胞回收數(shù)量)。(9)加入10%(體積分?jǐn)?shù))FBS及1%(體積分?jǐn)?shù))1×PS雙抗的1∶1 DMEMs-F12細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打成均勻的細(xì)胞懸液。以細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(10)24 h即可觀察間質(zhì)細(xì)胞貼壁，48 h后換液，棄除未貼壁細(xì)胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2～3 d換液一次。待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時(shí)即可用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶-EDTA消化傳代。傳代后細(xì)胞生長良好，6代內(nèi)細(xì)胞形態(tài)及生長速度無明顯變化。一般原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞8～10 d可長滿，傳代后細(xì)胞2～4 d即可長滿。

1.5 間質(zhì)細(xì)胞性質(zhì)鑒定

通過普通免疫組織化學(xué)方法及熒光免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞爬片中波形蛋白(vimentin)的表達(dá)。(1)免疫組織化學(xué)法：將無菌的載玻片放入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，制作細(xì)胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100濃度4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗1∶200濃度37 ℃溫箱30 min，DAB顯色劑顯色，光鏡下觀察。(2)免疫熒光法：同樣是首先制作細(xì)胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100濃度4 ℃孵育過夜，后期使用647標(biāo)記山羊抗兔IgG 1∶500濃度，37 ℃溫箱30 min，PBS沖洗3次，DAPI染核10 min，熒光顯微鏡拍照，熒光染色后操作均需避光。

1.6 組織水平檢測纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)

對臨床獲取的EMs在位、異位以及正常人在位子宮內(nèi)膜，做組織水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達(dá)水平。具體方法：組織石蠟包埋切片，CTGF、α-SMA、Collagen α(1)一抗1∶100濃度4 ℃ 過夜，KPL山羊抗兔二抗1∶200 37 ℃溫箱30 min，DAB顯色劑顯色，光鏡下觀察。

使用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)，具體方法：將細(xì)胞收集進(jìn)行蛋白提取BCA定量，制作等蛋白量點(diǎn)樣液跑膠，不封閉。5%(體積分?jǐn)?shù))BSA-TBST稀釋一抗1∶1 000在4 ℃孵育過夜，5%(體積分?jǐn)?shù))BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室溫孵育 40 min。洗膜顯影。

使用蛋白免疫印跡法檢測得到組織及細(xì)胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)條帶，圖片掃描后，使用軟件Gel Image ststem Ver. 4.00，對條帶灰度進(jìn)行分析，得到以β-actin為基線的纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果比值，進(jìn)一步對組織及細(xì)胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平做對比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EMs原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

共收集培養(yǎng)12份內(nèi)異癥異位及在位子宮內(nèi)膜組織，9份正常人子宮內(nèi)膜組織，EMs在位間質(zhì)細(xì)胞原代分離成功12例，成功率為100%。EMs異位組織分離培養(yǎng)12列成功11例，成功率為91.7%。正常人子宮內(nèi)膜組織分離9例成功8例，成功率為88.9%。EMs異位組織分離培養(yǎng)失敗的1例是因?yàn)椴僮鲿r(shí)間過久引起細(xì)菌污染。正常人子宮內(nèi)膜組織分離培養(yǎng)失敗的1例是由于首次分離摸索條件時(shí)消化過度，細(xì)胞死亡。普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)呈三角梭形，細(xì)胞核圓形居中。3組細(xì)胞形態(tài)學(xué)無明顯差異，培養(yǎng)結(jié)果見圖1。

2.2 原代提取細(xì)胞波形蛋白(vimentin)鑒定結(jié)果

3組原代培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞vimentin表達(dá)明顯，改良后原代EMs間質(zhì)細(xì)胞提取方法能夠成功提取出間質(zhì)細(xì)胞，詳見圖2。

2.3 EMs異位、在位及正常人在位子宮內(nèi)膜組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)差異

EMs異位組織中纖維化相關(guān)蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達(dá)較EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜明顯增高，而EMs在位組織與正常人子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)無明顯差異。普通免疫組織化學(xué)可見淡藍(lán)色橢圓形為細(xì)胞核，棕色為相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。可以看出子宮內(nèi)膜異位組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜在位及正常人子宮內(nèi)膜組織(圖3)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察原代細(xì)胞形態(tài)及大小Fig.1 Morphology of primary cells under light microscope (Scale bar=50 μm)

圖2 免疫組織化學(xué)及免疫熒光檢測間質(zhì)細(xì)胞波形蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.2 Detection of vimentin expression in mesenchymal cells by immunohistochemistry and immunofluorescence(Scale bar=25 μm)

HEnESCs：human normal endometrial stromal cells；HEcESCs：human ectopic endometrial stromal cells；HEuESCs：human eutopic endometrial stromal cells.

蛋白免疫印跡法再次檢測EMs異位、在位及正常人在位子宮內(nèi)膜組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)差異，子宮內(nèi)膜異位組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜在位及正常人子宮內(nèi)膜組織(圖4)。

EMs患者異位病灶組織中3種纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與EMs在位子宮內(nèi)膜及正常人子宮內(nèi)膜組織的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而EMs在位子宮內(nèi)膜與正常人子宮內(nèi)膜組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1、2)。

2.4 間質(zhì)細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)與組織水平存在一致性

2.4.1 經(jīng)過蛋白免疫印跡定量檢測

EMs患者異位病灶間質(zhì)細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)與EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，通過Bland-Altman方法分析組織及細(xì)胞水平纖維化相關(guān)蛋白差異一致性，組織與細(xì)胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)存在一致性(圖5)。

2.4.2 統(tǒng)計(jì)分析組織水平

HEcESCs中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與HEuESCs及HEnESCs兩組細(xì)胞中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而HEuESCs與HEnESCs兩種細(xì)胞種纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3、4。

3 討論

EMs作為育齡期女性的常見病、多發(fā)病，其生物學(xué)特征至今仍不明確。多種發(fā)病學(xué)說中經(jīng)血逆流學(xué)說較為經(jīng)典并廣為接受[3]。由于經(jīng)血逆流普遍存在于在育齡期婦女，但只有少數(shù)發(fā)展為EMs。針對這一現(xiàn)象目前又有不同的觀點(diǎn)，一種觀點(diǎn)[9-10]認(rèn)為EMs患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的特性有關(guān)，逃脫了免疫監(jiān)視和清除而得以在盆腔內(nèi)種植。 另一種觀點(diǎn)[11-12]認(rèn)為是EMs患者免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常，無法清除正常的逆流經(jīng)血。本實(shí)驗(yàn)通過改良EMs原代細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，簡化了EMs原代培養(yǎng)的步驟，同時(shí)保證了較高培養(yǎng)成功率。本實(shí)驗(yàn)在EMs原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上檢測3組細(xì)胞及相應(yīng)組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，EMs患者異位病灶組織及間質(zhì)細(xì)胞CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達(dá)明顯高于EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜組織及間質(zhì)細(xì)胞，而EMs在位內(nèi)膜組織及間質(zhì)細(xì)胞與正常人子宮內(nèi)膜組織及間質(zhì)細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)EMs在位組織與細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平較EMs異位組織及細(xì)胞有較大差異，該結(jié)果提示EMs患者在位子宮內(nèi)膜在異位到宮腔外前并沒有表現(xiàn)出纖維化的特征，異位后的子宮內(nèi)膜在異位部位各種條件的誘導(dǎo)下，發(fā)生纖維化，引起了慢性盆腔痛、女性不孕等一系列癥狀，因此異位后的子宮內(nèi)膜在異位部位發(fā)生纖維化過程值得進(jìn)一步探討。關(guān)于EMs纖維化的具體分子學(xué)發(fā)生機(jī)制目前尚未明確，本課題組將繼續(xù)對其分子水平的演變過程進(jìn)行進(jìn)一步研究。EMs原代細(xì)胞培養(yǎng)困難，分離培養(yǎng)過程盡可能滿足以下幾點(diǎn) ：(1)取材：盡可能選擇新鮮內(nèi)膜異位囊腫，組織獲取后冰盒轉(zhuǎn)運(yùn)，立刻送往實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)。(2)操作：首先取材操作過程中注意無菌原則。組織剪碎過程要盡可能迅速，操作時(shí)間延長將提高污染的風(fēng)險(xiǎn)。組織要盡可能剪碎，大塊組織需要延長消化時(shí)間，增加消化酶對細(xì)胞的損傷。組織消化時(shí)間不宜過長，可適當(dāng)增加消化次數(shù)。(3)培養(yǎng)：首次培養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)可加入5%(體積分?jǐn)?shù)) 1×PS雙抗減少污染。原代培養(yǎng)的EMs間質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)6代內(nèi)能穩(wěn)定生長。本實(shí)驗(yàn)對以往的培養(yǎng)方法加以驗(yàn)證及改進(jìn)，摸索出一種簡單、實(shí)用的EMs原代細(xì)胞分離方法。改進(jìn)后優(yōu)點(diǎn)：(1)以往以膠原酶和DNaseⅠ混合消化方法，操作步驟繁多，操作時(shí)間長，增加了污染機(jī)會，本實(shí)驗(yàn)所有消化液一次性按比例混合，減少污染。(2)以往分離方法價(jià)格昂貴，加大了相關(guān)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)費(fèi)支出，本實(shí)驗(yàn)采用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶-EDTA混合液作為消化液，不使用DNA酶，大幅度降低操作成本。(3)本實(shí)驗(yàn)保持較高成功率，為后期EMs相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供好的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)，證明了EMs異位病灶組織及間質(zhì)細(xì)胞纖維化水平明顯高于EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜。明確EMs異位病灶有明顯的纖維化，異位病灶原代分離的間質(zhì)細(xì)胞與組織水平纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)存在一致性。為后期EMs相關(guān)研究提供突破口及進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測子宮內(nèi)膜在位、異位及正常子宮內(nèi)膜組織水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and collagen1 in the eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium detected by immunohistochemistry(Scale bar=50 μm)CTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

圖4 蛋白免疫印跡檢測子宮內(nèi)膜在位、異位及正常子宮內(nèi)膜組織水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達(dá)水平Fig.4 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1) in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium by Western blottingCTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

ProteinEMsectopicEMseutopicControlF/HPCollagenα(1)/actin0.449±0.0580.264±0.0580.231±0.11510.8030.005α-SMA/actin0.546±0.1160.331±0.0970.310±0.07219.593<0.001CTGF/actin0.405±0.0940.231±0.0530.220±0.07911.3640.003 EMs:endometriosis;CTGF:connectivegrowthfactor;α-SMA:α-smoothmuscleactin.

表2 組織水平蛋白表達(dá)差異兩兩比較Tab.2 Protein expression differences in two pairs at the tissue level

圖5 蛋白免疫印跡檢測子宮內(nèi)膜在位、異位及正常人子宮內(nèi)膜細(xì)胞水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of fibrosis-related proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1)in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial cells detected by Western blotting

ProteinControlEMsectopicEMseutopicFPCollagenα(1)/actin0.226±0.0690.621±0.1080.293±0.12533.574<0.001α-SMA/actin0.300±0.1810.595±0.0490.286±0.14812.845<0.001CTGF/actin0.284±0.1210.470±0.0630.273±0.10310.1060.001 EMs:endometriosis;α-SMA:α-smoothmuscleactin;CTGF:connectivegrowthfactor.

表4 細(xì)胞水平蛋白表達(dá)差異兩兩比較Tab.4 Protein expression differences in two pairs at the cellular level