丁 暉 蔡彥寧 陳 彪

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物室 首都醫(yī)科大學(xué)帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又稱震顫麻痹，是中老年人常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，也是中老年人最常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)障礙性疾病。目前對(duì)PD采用的藥物治療仍然是對(duì)癥治療，主要有擬多巴胺化合物、多巴胺受體激動(dòng)劑、單胺氧化酶抑制劑以及抗膽堿能藥等，它們大多通過(guò)增加腦內(nèi)多巴胺濃度或模擬多巴胺效應(yīng)，提高患者的日常生活自理能力。這些方法手段既不能延緩更不能反轉(zhuǎn)多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變過(guò)程[1-2]。

靈芝作為藥物已正式被我國(guó)國(guó)家藥典收載，同時(shí)它又是國(guó)家批準(zhǔn)的新資源食品，無(wú)不良反應(yīng)，可以藥食兩用。靈芝能補(bǔ)氣安神，止咳平喘，用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食等癥狀。靈芝對(duì)人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、呼吸、運(yùn)動(dòng)等各個(gè)系統(tǒng)，尤其對(duì)腫瘤、肝臟病變、失眠以及衰老的防治作用最為顯著[3]。其藥理作用包括免疫調(diào)節(jié)活性，且與其所含的多糖類成分密切相關(guān)。靈芝中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分是多糖、三萜類成分及甾醇類成分，其中靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝酸、靈芝硒多糖、麥角甾醇、過(guò)氧化麥角甾醇均被證實(shí)具有顯著的抑癌、抗腫瘤效果。靈芝抗癌機(jī)制的研究主要集中在免疫功能、端粒酶、腫瘤細(xì)胞分化等方面，其機(jī)制與提高宿主免疫功能、抑制端粒酶活性、抑制腫瘤細(xì)胞增生、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化、抗氧化、清除氧自由基等有關(guān)[4]。

靈芝能延緩PD患者神經(jīng)退行性病變過(guò)程以及對(duì)非運(yùn)動(dòng)癥狀有著明顯的改善作用[5]。本研究將以靈芝提取物為研究對(duì)象，在細(xì)胞水平，采用小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞Neuro-2a，觀察對(duì)多巴胺能特異性神經(jīng)毒素MPP+損傷線粒體功能的影響，并從細(xì)胞自噬的角度來(lái)觀察靈芝可能發(fā)揮的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

靈芝提取物，由培力(南寧)藥業(yè)公司提供。MPP+iodide購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，MitoTracker Red CMXRos探針，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，Parkin抗體(Millipore公司，美國(guó))，LC3B抗體、NIX(BNIP/3L)抗體、AMPKα抗體、mTOR抗體、ULK1抗體、PINK1抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Neuro-2a小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。取回細(xì)胞后，離心1 000 r/min，5 min，棄上清。用1 mL含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的MEM/EBSS培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并按照1∶3比例傳代，2～4 d傳一代。根據(jù)細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于2～4個(gè)培養(yǎng)瓶或利用白細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或板中，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理

實(shí)驗(yàn)共分3組，正常對(duì)照組(Control組)：培養(yǎng)基、等同體積的PBS和溶解介質(zhì))；模型損傷組1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)組：1 mmol/L 溶于PBS的MPP+和相同體積的溶解介質(zhì))；藥物干預(yù)組[M+靈芝提取物(Ganoderma lucidum extract，GLE)組]：1 mmol/L 溶于PBS的MPP+和800 μg/mL 的GLE。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)后，終止培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)GLE對(duì)MPP+損傷Neuro-2a細(xì)胞的保護(hù)作用

臺(tái)盼藍(lán)染色后，通過(guò)顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù)，對(duì)細(xì)胞病死率進(jìn)行比較精確的定量。計(jì)算公式為：細(xì)胞病死率=藍(lán)色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)需求鋪板，并設(shè)置正常對(duì)照組，模型損傷組(單獨(dú)MPP+處理)以及藥物干預(yù)組(MPP+和GLE共同孵育)。每組至少設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，設(shè)定為6、12和24 h 3個(gè)時(shí)間段。分別在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)收集細(xì)胞：因?yàn)镹euro-2a是貼壁細(xì)胞，所以先用0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰酶孵育5 min消化下細(xì)胞。制作適宜濃度的細(xì)胞懸液，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色：吸取100 μL重懸的細(xì)胞到一塑料離心管內(nèi)，加入100 μL臺(tái)盼藍(lán)染色液(按1∶1體積比例混合)，輕輕混勻，染色3 min(染色3 min時(shí)間已經(jīng)足夠，染色時(shí)間可以更長(zhǎng)一些但不宜超過(guò)10 min)。最后計(jì)數(shù)：吸取少量經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。通常如果要比較精確地進(jìn)行定量，每個(gè)細(xì)胞樣品至少數(shù)500個(gè)細(xì)胞，數(shù)出藍(lán)色細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)。根據(jù)上述公式計(jì)算出細(xì)胞病死率，重復(fù)至少3次實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞免疫熒光雙重標(biāo)記染色

在孵育6 h后，終止培養(yǎng)進(jìn)行線粒體標(biāo)記和自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的染色。將培養(yǎng)基吸出后，PBS洗3次，裝載探針，滴加事先配制好的線粒體紅色熒光染料：加入37 ℃預(yù)熱的0.5μmol/L MitoTracker Red CMXRos染色工作液。在所使用細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下孵育30 min。染色結(jié)束后，使用PBS緩沖液小心清洗。4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛固定15～30 min。直接加入含有0.3%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100的PBST緩沖液中孵育進(jìn)行細(xì)胞透化。之后用PBS清洗細(xì)胞3次。滴加10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清封閉液，室溫封閉1 h，傾去，勿洗。滴加按比例稀釋的一抗(LC3B，1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次10 min。滴加相應(yīng)的二抗，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，每次10 min。滴加DAPI復(fù)染，作用1 min。再滴加抗熒光淬滅封片劑。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察、照相采集。

1.6 免疫蛋白印跡法檢測(cè)

收集和上述實(shí)驗(yàn)處理相同的各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，200 mA恒流電轉(zhuǎn)0.5～1.5 h(根據(jù)目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量不同，所需轉(zhuǎn)膜時(shí)間不同)。加入5 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉常溫封閉2 h。去除封閉液，加入事先按比例稀釋好的一抗AMPKα、mTOR、ULK1、LC3B、NIX、PINK1 (1∶1 000)，Parkin (1∶200)和β-actin (1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜；然后依據(jù)步驟常規(guī)洗滌，加入稀釋好的相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。最后使用ECL發(fā)光液進(jìn)行蛋白灰度檢測(cè)，灰度強(qiáng)度使用Gel-Pro分析儀對(duì)其進(jìn)行分析和比較。β-actin在所有Western blotting印跡分析中用作各樣品表達(dá)對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 靈芝提取物對(duì)MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a的細(xì)胞病死率的影響

本研究用臺(tái)盼藍(lán)染色法對(duì)GLE的保護(hù)作用進(jìn)行驗(yàn)證，與Control組相比，MPP+組細(xì)胞病死率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MPP+組的細(xì)胞病死率逐漸升高，6 h細(xì)胞病死率為5.89%，至24 h，細(xì)胞病死率升高至20.42%。而與MPP+組相比較，GLE組細(xì)胞分別由5.89%降至3.82(6 h，P<0.001)，7.32%降至4.77%(12 h，P<0.05)以及20.42%降至8.11%(24 h，P<0.001)(圖1)。

圖1 靈芝提取物(GLE)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞病死率的影響Fig.1 Effects of GLE on the cell death in Neuro-2a cells treated with MPP+

The cells were treated with or without GLE(800 μg/mL) for three time periods of 6，12 and 24 hours in Neuro-2a cells challenged with MPP+，***P<0.001vscontrol group，#P<0.05，###P<0.001vsMPP+group，n=3；GLE：Ganoderma lucidum extract；MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium.

2.2 靈芝提取物對(duì)MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞自噬反應(yīng)的影響

首先采用LC3抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。激光共聚焦顯微鏡觀察到，正常組細(xì)胞LC3-Ⅰ綠色熒光在胞質(zhì)內(nèi)彌散分布，MPP+處理組LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上，觀察到呈點(diǎn)狀聚集狀態(tài)(圖2A)，與正常對(duì)照組相比，MPP+組呈綠色點(diǎn)狀分布的LC3陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.001)；而與MPP+模型組相比，GLE組呈綠色點(diǎn)狀分布的LC3陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯降低(P<0.001)(圖2B)。

2.3 靈芝提取物對(duì)MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

NIX有76 000和38 000兩個(gè)目標(biāo)條帶，其中38 000條帶比較清楚，大相對(duì)分子質(zhì)量條帶比較淺細(xì)。Neuro-2a細(xì)胞在未作任何處理時(shí)，幾乎看不到LC3-Ⅱ。其余組都能同時(shí)看到LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。對(duì)免疫印跡進(jìn)行灰密度值量化，3組間NIX的灰密度值，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與正常組比較，MPP+組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加，而與模型組相比，GLE組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(圖3)。

2.4 靈芝提取物對(duì)MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)蛋白AMPK-mTOR-ULK1的影響

與Control組相比，MPP+組細(xì)胞AMPKα/mTOR/ULK1表達(dá)水平逐漸降低，尤以ULK1更為顯著。而與模型組相比，GLE干預(yù)組細(xì)胞的AMPKα/mTOR/ULK1顯著增加(圖4)。

圖2 GLE減輕MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞自噬反應(yīng)Fig.2 GLE administration regulated autophagy induced by MPP+ in Neuro-2a cell lines

A:confocal images of LC3B (green) and mitochondria (MitoTracker dye，red). Nuclei were counterstained with 4′，6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI，blue). Cells were treated with MPP+in the absence or presence of GLE (800 μg/mL) for 6 h. Scale bar=20 μm;B: quantification of the percentage of cells with LC3 punctate staining.***P<0.001vscontrol group，###P<0.001vsMPP+group，n=3.MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium；GLE：Ganoderma lucidum extract.

圖3 GLE調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)Fig.3 GLE regulated autophagic proteins induced by MPP+ in Neuro-2a cell lines

A: expression level of NIX and LC3B using Western blotting method;B: statistical results of NIX and LC3B,n=3,**P<0.01vscontrol group，#P<0.05vsMPP+group.GLE：Ganoderma lucidum extract;MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium.

圖4 GLE調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 GLE regulated autophagic-related proteins induced by MPP+ in Neuro-2a cell lines

A: expression level of AMPK-mTOR-ULK1 by Western blotting;B: statistical results of AMPK-mTOR-ULK1,n=3,***P<0.001vscontrol group;GLE：Ganoderma lucidum extract;MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium.

3 討論

細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式的自噬標(biāo)志物L(fēng)C3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。自噬形成時(shí)，胞質(zhì)型LC3(即LC3-Ⅰ，16 000)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ，14 000)。

基于上述GLE在MPP+損傷情況下對(duì)反應(yīng)性細(xì)胞自噬的抑制作用，筆者進(jìn)一步觀察其對(duì)上游調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平的影響。

AMPK-mTOR-ULK1/2信號(hào)通路在自噬反應(yīng)過(guò)程中有著非常復(fù)雜、精細(xì)的正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)。AMPK和mTOR直接磷酸化ULK1從而負(fù)向調(diào)節(jié)(抑制)ULK1活性，反過(guò)來(lái)活化的ULK1可以直接磷酸化AMPK，抑制AMPK的激活，形成自噬起始負(fù)反饋閉合環(huán)[5]。

靈芝是一種藥用真菌，一直以來(lái)在亞洲地區(qū)被廣泛用于促進(jìn)健康和長(zhǎng)壽的民間療法。它在許多疾病中有治療作用，如心血管疾病、糖尿病、癌癥、炎性反應(yīng)和免疫相關(guān)疾病。靈芝也被證明具有神經(jīng)保護(hù)作用在腦缺血性損傷、癲癇、阿爾茨海默病，PD和亨廷頓氏病[6-8]。研究[9]顯示，靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)可通過(guò)抗氧化作用防止MPP+和魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的原代多巴胺能細(xì)胞凋亡。此外，本團(tuán)隊(duì)之前的臨床研究證實(shí)了GLE可以延緩臨床PD患者的進(jìn)程以及改善非運(yùn)動(dòng)癥狀。同時(shí)本課題組前期證明GLE可以減輕MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞線粒體功能障礙。本研究臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明GLE組的細(xì)胞病死率明顯下降，進(jìn)一步確定了GLE能夠減輕MPP+致Neuro-2a細(xì)胞的死亡。GL調(diào)節(jié)自噬的機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明神經(jīng)毒素MPP+作用于Neuro-2a細(xì)胞數(shù)小時(shí)后，啟動(dòng)了異常自噬的激活。它是一種保守的細(xì)胞自我降解方式，是將受損細(xì)胞器及大分子物質(zhì)通過(guò)溶酶體降解再利用的過(guò)程。自噬參與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)對(duì)于神經(jīng)元尤為如此，特別是衰老的腦組織。神經(jīng)元對(duì)自噬的依賴是顯而易見(jiàn)的。毫無(wú)疑問(wèn)，隨著衰老等因素的增加，神經(jīng)元自噬功能失調(diào)，大量異常的、未降解的蛋白聚集，造成神經(jīng)元的退行性病變過(guò)程[10]。本研究利用MPP+作用Neuro-2a細(xì)胞數(shù)小時(shí)后，GLE可以顯著降低LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值，證明GLE能夠降低MPP+誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞自噬反應(yīng)。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)，GLE可以減輕MPP+誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白NIX表達(dá)的下降。NIX，又稱BNIP3L，定位于線粒體外膜(outer membrane of mitochondria，OMM)，負(fù)責(zé)受損線粒體的清除。在執(zhí)行其生物學(xué)功能時(shí)，作為Parkin的底物驅(qū)動(dòng)Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬。Gao等[11]在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，使用線粒體復(fù)合物抑制劑MPP+進(jìn)行損傷處理后，NIX的表達(dá)水平下降，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，MPP+損傷Neuro-2a細(xì)胞6 h后，導(dǎo)致NIX蛋白的表達(dá)水平下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)基因突變或者相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化會(huì)導(dǎo)致年齡譜異常的神經(jīng)變性疾病[12-13]。自噬異常發(fā)生在帕金森病病程中的多個(gè)階段，表現(xiàn)為受累神經(jīng)元中路易小體(主要成分為突觸核蛋白)的聚集。同時(shí)在晚發(fā)型帕金森病中，起病發(fā)生在自噬通路的不同階段，那么病理機(jī)制和治療也會(huì)有相應(yīng)的不同。

本研究對(duì)調(diào)節(jié)自噬的相關(guān)蛋白，AMPKα/mTOR/ULK1通路中各蛋白的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，觀察GLE是否通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)水平參與了自噬的調(diào)節(jié)。在本次研究中，在正常條件下，各相關(guān)自噬蛋白表達(dá)水平維持在一定水平。而相比與正常組，在MPP+損傷條件下，幾乎所有的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)是下調(diào)的，有理由認(rèn)為在正常條件下，細(xì)胞內(nèi)蛋白維持在正常的水平，可以把它理解為“冗余”，當(dāng)然這種冗余包括了數(shù)量和質(zhì)量，使得細(xì)胞有能力去緩沖各種環(huán)境的變化。Inoki等[14]也表達(dá)了相似的觀點(diǎn)，他們認(rèn)為細(xì)胞功能和信號(hào)通路的冗余為系統(tǒng)提供了一個(gè)安全的機(jī)制。在功能失常的細(xì)胞或者線粒體內(nèi)，蛋白表達(dá)的下調(diào)已經(jīng)不足以對(duì)抗損傷引起的信號(hào)反應(yīng)(自噬)，至于蛋白下調(diào)與這種病理?yè)p傷的結(jié)果如何相互作用仍需要進(jìn)一步深入研究。自噬性修復(fù)能力下降與自噬性反應(yīng)的增加，自噬這種雙重身份的失衡，也就是所謂的自噬功能障礙，最終導(dǎo)致部分認(rèn)為的細(xì)胞死亡[14]。

MPTP+線粒體損傷都可以引起自噬，不好區(qū)分，但筆者更加認(rèn)為有重疊的成分，因?yàn)镸PP+通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物而引起膜電位下降，ROS增多以及ATP的下降。這里本身就存在線粒體損傷和能量缺乏兩個(gè)病理性刺激因素，二者之間相互作用，導(dǎo)致自噬性和凋亡性的病理過(guò)程，惡性循環(huán)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，當(dāng)然ATP下降的速度如此之快，因而可以作為感應(yīng)因素，去調(diào)節(jié)下游的反應(yīng)。而GLE通過(guò)改善這種病理刺激，讓細(xì)胞本身及其所在的環(huán)境趨于穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞得以存活下來(lái)，這本身也是中藥的優(yōu)勢(shì)。

GLE中哪些成分介導(dǎo)其在自噬反應(yīng)中的功能也并不清楚的。藥理學(xué)分析表明GLE是高度復(fù)雜的混合物。GLE的成分包括多糖、三萜類化合物、類固醇、多肽、真菌溶菌酶、麥角甾醇等。在這些組分中，通常認(rèn)為多糖是主要活性成分具有抗氧化，抗腫瘤和免疫刺激劑的物質(zhì)屬性。 GLP可以預(yù)防腎臟、肝臟、心肌和神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激。特別是，GLP是通過(guò)提升線粒體復(fù)合物I來(lái)保護(hù)DA神經(jīng)元免受MPP+和魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激活性和減少ROS的形成[9]。另外也有報(bào)道[15-16]，其他多糖比如附子多糖等可以通過(guò)激活細(xì)胞增加自噬AMPK/mTOR通路防止細(xì)胞毒性，因此筆者推斷GLP可能是GL調(diào)節(jié)自噬的主要成分之一。