朱 寧， 陳 皓， 趙旭勇， 趙 瑋， 姜文兵， 王 毅

(溫州醫(yī)科大學(xué)溫州市第三臨床學(xué)院， 溫州市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科， 浙江 溫州 325000)

動(dòng)脈性肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)的一個(gè)亞型，以肺小動(dòng)脈重塑為特征，導(dǎo)致肺血管阻力增加和肺動(dòng)脈壓增高[1]。PAH是一種進(jìn)行性發(fā)展的疾病，最終導(dǎo)致右心室衰竭和死亡。據(jù)報(bào)道，PAH在成人中約為每百萬(wàn)人中有12～50萬(wàn)人最終死亡。肺動(dòng)脈重構(gòu)主要是由于平滑肌細(xì)胞的異常生長(zhǎng)、過(guò)度增殖和抗凋亡能力減弱所致[2]。因此，抑制肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arteriole smooth muscle cells，PASMCs)增殖或誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡是PAH的有效治療策略。研究調(diào)控PASMCs增殖和凋亡的關(guān)鍵分子，能為PAH的防治提供有效的藥物靶點(diǎn)。

近20年的多模型生物研究已經(jīng)確立了Hippo通路作為器官大小和組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控信號(hào)途徑。通過(guò)抑制Hippo通路下游的Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)和tafazzin (TAZ)，Hippo途徑能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和干性[3]。目前許多研究已經(jīng)表明Hippo通路的失調(diào)對(duì)腫瘤的發(fā)展有重要影響[4]。在心血管疾病方面，Hippo通路也受到了越來(lái)越多的重視。但尚無(wú)研究表明Hippo通路在PAH中的表達(dá)情況以及探討可能的作用。 因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的PAH大鼠肺Hippo通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討Hippo通路在PAH發(fā)生發(fā)展中可能的作用和機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 試劑

MCT購(gòu)自Sigma；抗YAP、TAZ、PCNA、GAPDH和TEAD抗體以及鼠和兔 II 抗均購(gòu)自Cell Signaling Technology；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購(gòu)自Sigma；HE及Masson染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega；PCR 引物購(gòu)自TaKaRa；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒及3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)購(gòu)自碧云天公司。

2 方法

2.1動(dòng)物模型與分組 45只健康雄性 SD 大鼠購(gòu)自上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證編號(hào)為SCXK (浙) 2008-0033。隨機(jī)分為 2組：對(duì)照組(control組,n=15)和模型組(model組,n=30)。造模組所有大鼠給予一次性頸部皮下注射 60 mg/kg MCT(將 0.2 g MCT 溶解于1 mol/L HCl中，加入1 mol/L NaOH調(diào)整pH至7.2～7.4，生理鹽水定容至10 mL)；對(duì)照組大鼠注射等量的生理鹽水。

2.2血流動(dòng)力學(xué)和心室肥厚檢測(cè) MCT 注射造模4 周后，稱量2組大鼠體重(body weight，BW)，水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，連接壓力換能器，將微導(dǎo)管(PE50)沿著大鼠頸外靜脈插入右心室，此時(shí)可見(jiàn)振幅較大的右心室波，并記錄右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)。處死動(dòng)物后取出心肺組織，去除心房及大血管，分離右心室和左心室以及室間隔，濾紙吸干組織并稱重，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)=RV/(LV+S)；計(jì)算右心室質(zhì)量指數(shù)(right ventricular mass index，RVMI；mg/g)=RV/BW。肺組織標(biāo)本一部分迅速存放于液氮中，后于-80 ℃凍存，剩余部分用福爾馬林固定。

2.3肺小動(dòng)脈重構(gòu)的檢測(cè) 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色，脫水透明后，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡選取肺小動(dòng)脈(直徑50～200 μm)觀察形態(tài)變化。 采集圖像后采用ImageJ軟件分析，根據(jù)公式計(jì)算中膜厚度百分比：M/E%(medial thickness/external diameter)=中膜厚度/外徑×100%。Masson染色同樣參照說(shuō)明書(shū)，肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，依次在Masson染液進(jìn)行染色，中性樹(shù)脂封片。光鏡下觀察藍(lán)色的膠原纖維。

2.4Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 從-80 ℃冰箱取出肺組織，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，每只稱量0.1 g，RIPA 裂解液裂解，靜置30 min后離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE，半干式法轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，放入相應(yīng)的 I 抗4 ℃冰箱過(guò)夜，經(jīng)漂洗，最后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗孵育。FluorChem FC3凝膠成像系統(tǒng)攝像并分析，檢測(cè)條帶灰度值。GAPDH作為內(nèi)參照，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)做歸一化處理。

2.5免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)蛋白表達(dá) 肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，過(guò)氧化氫(30 g/L)封閉10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS孵育3次，每次5 min，置于有檸檬酸鈉液高壓鍋中煮沸修復(fù)抗原，PBS孵育3次，每次5 min,37 ℃ 用I 抗孵育1 h，滴加生物素標(biāo)記的 II 抗，37 ℃孵育30 min，PBS孵育3次,每次5 min，DAB顯色劑顯色1～2 min。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明后，中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察蛋白的表達(dá)。

2.6RT-qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 所用引物參照已發(fā)表文獻(xiàn)，序列見(jiàn)表1。TRIzol法提取肺組織總RNA，提取總RNA，20 μL 體系中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，50 μL體系中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)完成后，軟件將自動(dòng)分析所有標(biāo)本的記錄曲線，計(jì)算出Ct值。GAPDH作為內(nèi)參照，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)做歸一化處理。

表1 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)所用YAP、 TAZ、 TEAD 和 GAPDH的引物序列

Table 1.The primer sequences of YAP, TAZ, TEAD and GAPDH for RT-qPCR

NameSequence (5’-3’)YAPForward: TACACCCACAGCTCAGCATCReverse: GCCATGTTGTTGTCTGATCGTAZForward: GGAGAGAGAAAGGATTCGAATGCReverse: TGTCGACAGAGGGCAGCTTTEADForward: CCACCAAAGTTTGCTCCTTTGGGAReverse: ACTTCAAACACACAGGCCATGCAGGAPDHForward: GCAGATTACCAGCCAACGTCAReverse: CGCCAGTAGACTCCACGACATA

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較用非配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 造模大鼠存活率

4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組30只大鼠中 11只因病重死亡，2只麻醉后死亡，最終存活大鼠 17 只，存活率為 56.6%，基本與之前的文獻(xiàn)報(bào)道符合。對(duì)照組全部大鼠沒(méi)有死亡。

2 血流動(dòng)力學(xué)和心室肥厚的比較

與對(duì)照組相比，模型組大鼠體重增長(zhǎng)明顯不如對(duì)照組，而且RVSP、RVHI 和 RVMI均顯著增高(P<0.01)，提示 PAH 造模成功，見(jiàn)表2。

表2 右心室收縮壓、右心室肥厚指數(shù)和右心室質(zhì)量指數(shù)的結(jié)果

Table 2.The results of RVSP， RVHI and RVMI (Mean±SD.n=6)

GroupRVSP (mmHg)RVHI (%)RVMI (%)Control19.90±1.9229.08±2.280.61±0.01Model58.26±6.01??64.96±4.93??1.68±0.17??

**P<0.01vscontrol group.

3 肺小動(dòng)脈重構(gòu)的檢測(cè)

HE染色結(jié)果顯示模型組中小肺動(dòng)脈血管內(nèi)中膜和外層纖維層均明顯增厚，管腔顯著狹窄，甚至可見(jiàn)血管腔幾乎完全閉塞等血管叢樣改變，見(jiàn)圖1。造模組M/E%明顯大于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖2。Masson染色結(jié)果顯示模型組血管外層代表膠原纖維的藍(lán)色明顯多于對(duì)照組，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Observation of pulmonary arterial remodeling by HE staining and Masson staining (×400).

圖1 HE染色觀察肺動(dòng)脈重構(gòu)的病理變化

Figure 2.The quantitative analysis of M/E% in the pulmonary arterioles. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖2 肺動(dòng)脈中膜厚度/外徑百分比的定量分析

4 Hippo信號(hào)通路相關(guān)分子的檢測(cè)

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, YAP、TAZ和TEAD蛋白主要在肺小動(dòng)脈中層及外層中表達(dá)，并且明顯多于對(duì)照組，見(jiàn)圖3。同時(shí)Western blot及RT-qPCR結(jié)果提示全肺組織YAP、TAZ和TEAD蛋白及mRNA水平都明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖4及表3。

討 論

本研究通過(guò)給予MCT誘導(dǎo)大鼠PAH模型的建立，4周后大鼠RVSP顯著升高，RVHI和RVMI明顯增加，肺小動(dòng)脈增厚，說(shuō)明成功建立了PAH模型。Masson染色提示肺組織纖維化炎癥。與對(duì)照組相比，免疫組化染色染色結(jié)果提示肺小動(dòng)脈的YAP、TAZ和TEAD蛋白顯著上調(diào)，在中層及外層均有明顯表達(dá)，Western blot和RT-qPCR結(jié)果顯示肺組織的YAP、TAZ和TEAD蛋白和mRNA也明顯升高。這提示Hippo信號(hào)通路可能促進(jìn)PASMCs增殖以及肺小動(dòng)脈重構(gòu)，進(jìn)而參與PAH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

Figure 3.The results of YAP, TAZ and TEAD expression in the pulmonary arterioles detected by immunohistochemical staining (×400).

圖3 肺動(dòng)脈YAP、TAZ和TEAD的免疫組化染色結(jié)果

Figure 4.Western blot was used for determining the protein expression of YAP, TAZ and TEAD in the lung tissues. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

圖4 Western blot檢測(cè)肺組織中YAP、TAZ和TEAD蛋白的表達(dá)

表3 YAP、 TAZ和TEAD的mRNA水平

Table 3.The mRNA levels of YAP, TAZ and TEAD (Mean±SD.n=8)

GroupYAPTAZTEADControl0.46±0.030.39±0.020.28±0.02Model0.79±0.06?0.58±0.05?0.48±0.04?

*P<0.05vscontrol group.

PAH的主要特點(diǎn)是肺血管阻力增加，導(dǎo)致右心室肥厚(right ventricular hypertrophy，RVH)和最終的右心衰竭。在所有類型的PAH中，肺血管阻力增加的主要病理改變是肺動(dòng)脈重塑，這主要?dú)w因于PASMCs的過(guò)度增殖和受損的細(xì)胞凋亡[5]。目前來(lái)說(shuō)前列環(huán)素、內(nèi)皮素和5型磷酸二酯酶抑制劑能提高PAH患者生活質(zhì)量和改善臨床癥狀，但是仍然無(wú)法提高長(zhǎng)期獲益以及改善生存率[6]。這些藥物療效的局限性通常是因?yàn)樗鼈兊淖饔脵C(jī)制主要是舒張肺小血管，尚不能真正改善血管重構(gòu)。因此研究靶向PASMCs增殖的信號(hào)分子將為PAH患者帶來(lái)改善生存率的治療藥物。

多細(xì)胞生物的出現(xiàn)是一個(gè)進(jìn)化的里程碑。支持多細(xì)胞性的最基本機(jī)制是確保組織和器官的適當(dāng)大小和形狀以滿足功能性需求。近年的研究揭示Hippo通路在器官大小的控制上具有重要的作用。Hpo、SAV、WTS和MAT在基因和生理上相互作用，其突變引起顯著的器官增大的表型在其他已建立的發(fā)育信號(hào)途徑中是前所未有的；因此，它們被歸類為一種新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊：以河馬的巨大體型命名的Hippo信號(hào)通路。轉(zhuǎn)錄共激活劑YAP和TAZ在許多細(xì)胞類型的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中有關(guān)聯(lián)。YAP/TAZ是Hippo途徑中進(jìn)化保守的關(guān)鍵效應(yīng)因子，目前認(rèn)為正是YAP/TAZ通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來(lái)介導(dǎo)Hippo途徑的生物學(xué)功能。YAP同源物在果蠅中的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致了蠅類椎間盤的過(guò)度生長(zhǎng)[7]，而過(guò)度表達(dá)YAP的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生多個(gè)腫瘤[8]。同樣，一些研究已經(jīng)將YAP旁系TAZ的表達(dá)與許多細(xì)胞類型的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)有關(guān)。雖然YAP和TAZ可以與多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，但它們促進(jìn)生長(zhǎng)的作用主要通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子TEAD家族成員的相互作用來(lái)介導(dǎo)。例如，沉默TEAD能阻斷大部分YAP誘導(dǎo)的基因表達(dá)，并在很大程度上減弱YAP誘導(dǎo)的過(guò)度生長(zhǎng)表型。此外，TEAD1/2基因缺失小鼠的表型類似于YAP基因缺失的小鼠[9]。同樣地，在果蠅中TEAD同源物介導(dǎo)YAP同源物過(guò)度生長(zhǎng)的表型[10]。

越來(lái)越多的研究顯示Hippo通路在心血管疾病中的重要作用，特別是對(duì)平滑肌細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。之前的研究已經(jīng)表明，YAP促進(jìn)VSMC增殖的表型以及正向調(diào)控了小鼠頸動(dòng)脈球囊損傷[11]。YAP在小鼠心血管系統(tǒng)中的缺失導(dǎo)致胚胎致死，而YAP條件敲除小鼠表現(xiàn)為胚胎血管平滑肌細(xì)胞增殖受限，導(dǎo)致嚴(yán)重的血管異常，包括血管壁變薄和頭臂動(dòng)脈的短或缺失[12]。YAP通過(guò)與心肌蛋白(myocardin)的作用也能調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換[13]。最近的研究表明YAP和TAZ共同通過(guò)TEAD促進(jìn)毛喉素介導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖[14]。

雖然Hippo通路中關(guān)鍵效應(yīng)分子YAP和TAZ已經(jīng)充分被證明在平滑肌細(xì)胞增殖以及平滑肌細(xì)胞參與的心血管疾病模型中的作用，但是尚沒(méi)有研究表明它們?cè)赑AH中的作用。我們的研究結(jié)果提示YAP、TAZ和TEAD在野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠肺小動(dòng)脈中高表達(dá)；并且我們還發(fā)現(xiàn)這些蛋白分布于中層和外層，說(shuō)明它們同時(shí)也促進(jìn)血管外層成纖維細(xì)胞的增殖。研究結(jié)果說(shuō)明Hippo通路中的YAP和TAZ可能通過(guò)TEAD介導(dǎo)PASMCs以及成纖維細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)肺小動(dòng)脈的重構(gòu)，最終導(dǎo)致了PAH的形成。目前尚缺乏YAP和TAZ有效且安全的抑制劑，野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠模型可作為為進(jìn)一步靶向藥物研究的實(shí)驗(yàn)載體。YAP、TAZ亦或是TEAD有望成為肺動(dòng)脈高壓治療的新途徑。