趙 丹， 王少賢, 2△， 梁文杰， 王一旭， 李媛媛， 王坤紅, 4

(1河北中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 河北 石家莊 050200； 4河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院， 河北 石家莊 050000)

心理應(yīng)激不但可引發(fā)抑郁、焦慮和恐懼等情緒障礙，體重下降和攝食量減少也成為慢性持續(xù)應(yīng)激刺激機(jī)體出現(xiàn)的常見(jiàn)反應(yīng)。神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌、消化、心血管和生殖等系統(tǒng)共同參與調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)各系統(tǒng)代謝，可有效應(yīng)對(duì)應(yīng)激損傷[1]。代謝組學(xué)是一種研究機(jī)體在受到環(huán)境、行為和病理等不同因素刺激后，對(duì)體內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)量和分析的方法，可以揭示外源性刺激引起內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律[2-3]。近20年，代謝組學(xué)技術(shù)已被成熟應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。相關(guān)學(xué)者已從慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)或慢性束縛應(yīng)激大鼠尿、血和海馬組織等樣本中，發(fā)現(xiàn)了與抑郁有關(guān)的小分子代謝產(chǎn)物[4-8]。極少量文獻(xiàn)報(bào)道采用代謝組學(xué)技術(shù)研究 CUMS 模型大鼠糞便中代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，并評(píng)價(jià)其與抑郁情緒的相關(guān)性[9]，但應(yīng)激大鼠攝食量、體重變化與糞樣代謝產(chǎn)物相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究觀察了慢性應(yīng)激模型大鼠攝食量和體重變化，動(dòng)物在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中的行為學(xué)改變及糖水偏好、血清D-木糖含量和小腸炭末推進(jìn)率，并采用基于核磁共振氫譜(1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)的代謝組學(xué)技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)檢測(cè)分析慢性應(yīng)激大鼠與正常大鼠糞樣差異代謝物，探討慢性應(yīng)激導(dǎo)致其體重和攝食量變化的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，6～7周齡，體重180～200 g，雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，SPF級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2016-0006。清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度20～22 ℃，晝夜明暗交替時(shí)間12/12 h(7:00～19:00為明期，19:00～7:00為暗期)，相對(duì)濕度40%～50%。實(shí)驗(yàn)程序通過(guò)河北中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，盡可能將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的痛苦和數(shù)量降低到最小。

2 試劑與儀器

D-木糖購(gòu)自Biotopped Science&Technology；血清D-木糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；核磁共振標(biāo)準(zhǔn)品Anachro Certified DSS Standard Solution(ACDSS)購(gòu)自CIL；Amicon?ULTRA 3 kDa超濾膜購(gòu)自Millipore。SpectraMax?Plus 384讀板機(jī)(酶標(biāo)儀)購(gòu)自MD；XP205分析天平購(gòu)自Mettler-Toledo；Centrifuge 5415R 和5424R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf；Bruker AV III 600 MHz 型核磁共振(NMR)譜儀購(gòu)自Bruker；Sonics VCX130超聲波破碎儀購(gòu)自Sonics & Materials。

3 方法

3.1動(dòng)物分組與模型制備 48只大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常組(control組)和慢性束縛應(yīng)激組(stress組)，每組24只大鼠，每4只大鼠1籠，每組6籠。參考課題組之前發(fā)表文獻(xiàn)[10-13]方法，慢性束縛應(yīng)激組每天3 h，連續(xù)21 d將大鼠捆綁于特制T型束縛木架，正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)21 d。

3.2大鼠攝食量和體重檢測(cè) 在束縛應(yīng)激前，稱(chēng)量大鼠體重和攝食量作為第0天(day 0)數(shù)據(jù)，應(yīng)激后每3 d稱(chēng)量1次大鼠體重和攝食量，即day 3、day 6、day 9、day 12、day 15、day 18和day 21各稱(chēng)量1次，共計(jì)8次。當(dāng)日攝食量 = 前一日給食量-當(dāng)日剩余食量。

3.3行為學(xué)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)箱底面積100 cm×100 cm，被平分為25小方格，最中心9個(gè)小方格組成中央?yún)^(qū)。高架十字迷宮結(jié)構(gòu)：長(zhǎng)45 cm×寬15 cm的開(kāi)放臂2條，長(zhǎng)45 cm×寬15 cm×高30 cm的封閉臂2條，一個(gè)聯(lián)結(jié)4條臂的中央平臺(tái)(15 cm×15 cm)，封閉臂頂部開(kāi)放，開(kāi)放臂與封閉臂呈十字形。

由SuperMaze 動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)，以5 min為計(jì)時(shí)單位，記錄束縛應(yīng)激前day 0和應(yīng)激開(kāi)始后day 7和day 21兩組大鼠行為學(xué)指標(biāo)變化。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)包括大鼠在曠場(chǎng)箱內(nèi)總移動(dòng)距離和中央?yún)^(qū)移動(dòng)距離。高架十字迷宮行為學(xué)指標(biāo)包括大鼠進(jìn)入2條開(kāi)放臂和2條封閉臂次數(shù)和停留時(shí)間。

3.4糖水偏好實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[14]，先對(duì)大鼠進(jìn)行訓(xùn)練(以籠為單位)：撤掉一直飲用的純凈水(淡水)，先予2瓶1%蔗糖溶液(糖水)自由飲用24 h，然后換成1瓶糖水和1瓶淡水自由飲用24 h，之后禁食禁水24 h，訓(xùn)練結(jié)束，即刻正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。予1瓶糖水和1瓶淡水給大鼠自由飲用1 h，記錄糖水和淡水消耗量(mL)，糖水偏好率(%)=糖水消耗量/(糖水+淡水消耗量)×100%。分別在應(yīng)激前day 0、應(yīng)激后day 7和day 21記錄3次糖水偏好率。

3.5血清D-木糖含量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大鼠禁食12 h，每組隨機(jī)選取12只大鼠灌服5% D-木糖溶液2 mL，1 h后予2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)腹腔注射麻醉，斷頭取血2 mL， 4℃離心10 min，相對(duì)離心力1 041 ×g，分離血清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明采用間苯三酚法檢測(cè)大鼠血清D-木糖含量，其中正常組取3只未服D-木糖大鼠血清備用空白管檢測(cè)。

3.6小腸炭末推進(jìn)率檢測(cè) 取材前25～30 min，每組10只大鼠灌胃10% 炭粉混懸液 2 mL，麻醉斷頭處死大鼠后，快速取出胃和小腸，將小腸自然平鋪，測(cè)量自幽門(mén)括約肌至回腸末端全段小腸長(zhǎng)度和炭末在小腸內(nèi)的推進(jìn)距離，計(jì)算小腸炭末推進(jìn)率(%)=炭末推進(jìn)距離/小腸全長(zhǎng)×100%。

3.7基于1H-NMR技術(shù)的糞樣代謝組學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每組采集10只大鼠糞便，各稱(chēng)量50 mg凍干糞樣，加入1 000 μL純水，渦旋1 min，冰水浴超聲萃取32 s，相對(duì)離心力14 360 ×g，4℃離心15 min，然后超濾膜離心過(guò)濾45 min；取濾液450μL，加入核磁共振標(biāo)準(zhǔn)品 ACDSS 50μL渦旋10 s，相對(duì)離心力14 360×g，離心2 min，取480μL上清于核磁共振管中，Bruker AV III 600 MHz 譜儀2D-1H NOESY脈沖序列采集1H-NMR數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)[15]方法，將1H-NMR信號(hào)導(dǎo)入軟件Chenomx NMR 套裝8.1版本(Chenomx)，通過(guò)校正基線(xiàn)，調(diào)整譜圖峰形，比對(duì)分析，最終獲得20份大鼠糞樣的小分子代謝物和濃度值。并采用偏最小二乘法判別分析(partial least square-discriminant analysis，PLS-DA)模型進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，獲得差異代謝物數(shù)據(jù)和圖示。采用交叉驗(yàn)證(cross-validation，CV)對(duì)PLS-DA判別分析模型質(zhì)量進(jìn)行檢驗(yàn)，模型的分類(lèi)效果采用置換檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)，結(jié)果均表明所采用模型質(zhì)量穩(wěn)定可靠，分類(lèi)效果較好。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 22.0的一般線(xiàn)性模型(general linear model，GLM)的球形檢驗(yàn)(Mauchly’s test of sphericity)首先對(duì)2組大鼠體重、攝食量、行為學(xué)和糖水偏好率不同時(shí)間重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，如果時(shí)間、時(shí)間與分組交互、分組因素效應(yīng)顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，則每個(gè)時(shí)點(diǎn)的組間差異采用單因素方差分析，組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)多重比較配對(duì)的t檢驗(yàn)法(Bonferroni法；由于每組內(nèi)各個(gè)時(shí)點(diǎn)上的兩兩比較結(jié)果輸出內(nèi)容較多，可結(jié)合均數(shù)圖直觀觀察到2組大鼠體重、攝食量、行為學(xué)指標(biāo)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，所以省略每組之內(nèi)在各個(gè)時(shí)點(diǎn)上的兩兩比較)；2組大鼠血清D-木糖含量、小腸炭末推進(jìn)率比較采用成組t-test分析；指標(biāo)之間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 體重和攝食量變化

在束縛應(yīng)激前，2組大鼠皮毛光澤，活動(dòng)自如，體重和攝食量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；應(yīng)激因素施加1～4 d，大鼠反抗劇烈，頻繁掙脫束縛；至束縛應(yīng)激第2周，大鼠反抗和掙脫能力逐漸下降，體重較正常組大鼠增長(zhǎng)緩慢，攝食量顯著下降(P<0.01)；在束縛應(yīng)激最后1周，大鼠基本無(wú)反抗和掙脫，體重和攝食量較正常大鼠呈持續(xù)下降趨勢(shì)(P<0.01),見(jiàn)表1。

2 行為學(xué)變化

2.1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open-field test，OFT) 實(shí)驗(yàn)前，2組大鼠5 min在曠場(chǎng)內(nèi)總移動(dòng)距離和中央?yún)^(qū)移動(dòng)距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)第7天和第21天，應(yīng)激大鼠5 min總移動(dòng)距離和在中央?yún)^(qū)移動(dòng)距離均較正常組大鼠顯著減少(P<0.01),見(jiàn)表2。

2.2高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus-maze test，EPM test) 束縛應(yīng)激前，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)5 min內(nèi)2組大鼠在開(kāi)放臂和封閉臂停留時(shí)間和進(jìn)入次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。在束縛應(yīng)激第7天和21天，5 min內(nèi)應(yīng)激大鼠在開(kāi)放臂停留時(shí)間較正常大鼠顯著縮短(P<0.01)，雖然進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)有所減少，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；應(yīng)激第21天大鼠進(jìn)入封閉臂次數(shù)顯著減少(P<0.01)但停留時(shí)間延長(zhǎng)，2組封閉臂停留時(shí)間比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 2組大鼠體重和攝食量比較

**P<0.01vscontrol group.

表2 2組大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)總移動(dòng)距離和中央?yún)^(qū)移動(dòng)距離比較

**P<0.01vscontrol group.

表3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)2組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

應(yīng)激前，2組大鼠對(duì)糖水的偏好差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，而束縛應(yīng)激能夠降低大鼠對(duì)糖水的偏好，應(yīng)激21 d時(shí)，2組差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 2組大鼠糖水偏好率比較

*P<0.05vscontrol group.

4 血清D-木糖含量和小腸炭末推進(jìn)率測(cè)定

應(yīng)激21 d大鼠血清D-木糖含量較正常組大鼠顯著下降(P<0.01)，小腸炭末推進(jìn)率低于正常大鼠，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見(jiàn)圖1。

5 大鼠糞樣1H-NMR代謝組學(xué)結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)大鼠糞樣譜圖信號(hào)與Chenomx自帶數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，最終獲得 58 種代謝物，主要包括氨基酸及其分解產(chǎn)物、胺及其化合物、有機(jī)酸類(lèi)、糖類(lèi)、醇類(lèi)和核酸成分共6類(lèi)。初步分析慢性束縛應(yīng)激組1個(gè)樣本與同組差異較大的被剔除，最終10個(gè)正常組糞便樣本和9個(gè)慢性束縛應(yīng)激組樣本數(shù)據(jù)被納入統(tǒng)計(jì)。首先采用 Pareto Scaling 法對(duì)2組代謝物數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，然后采用PLS-DA進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，最終獲得得分圖(Scores plot)、載荷圖(Loading plot)、VIP(Variable Importance in Projection)圖、VIP值>1差異代謝物t-test 圖，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The serum D-xylose content and small bowel transit rate in two groups. A: the serum D-xylose content in two groups.n=12. B: the small bowel transit rate in two groups.n=10. Mean±SEM.**P<0.01vscontrol group.

圖1 2組大鼠血清D-木糖含量和小腸炭末推進(jìn)率比較圖

PLS-DA 的VIP圖，默認(rèn) VIP值>1 的變量(代謝物)差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。本研究VIP值>1的代謝物包括乙酸鹽(acetate)、丁酸鹽(butyrate)、葡萄糖(glucose)、丙酸鹽(propionate)、谷氨酸鹽(glutamate)、核糖(ribose)、庚二酸鹽(pimelate)、乳酸鹽(lactate)、丙氨酸(alanine)和戊酸鹽(valerate)共10種，2組間比較，慢性束縛應(yīng)激組高于正常組，進(jìn)行t-test分析差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖2D、表5。

表5 2組大鼠糞樣VIP值>1的差異代謝物含量比較

Table 5.Differential metabolites level(VIP value >1) in the two groups (mg/g. Mean±SEM)

MetabolitesControl (n=10)Stress (n=9)Acetate3.1992±0.36305.3237±0.2253??Butyrate0.7705±0.09492.4143±0.2565??Glucose0.8098±0.08352.3648±0.4151??Propionate1.2010±0.10291.8864±0.0554??Glutamate0.5547±0.12911.3528±0.2400?Ribose0.5483±0.06650.9942±0.1143??Pimelate0.1089±0.01440.3816±0.0730??Lactate0.0855±0.00900.3322±0.0531??Alanine0.1755±0.03080.4456±0.0775??Valerate0.1946±0.02400.3993±0.0462??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

6 慢性應(yīng)激大鼠體重、攝食量、血清D-木糖含量、糖水偏好率、小腸炭末推進(jìn)率和差異代謝物相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析表明，應(yīng)激大鼠體重與攝食量、血清D-木糖含量、小腸炭末推進(jìn)率、糖水偏好率和差異代謝物相關(guān)性均不顯著(P>0.05)；攝食量與糞樣差異代謝物中acetate和pimelate呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；小腸炭末推進(jìn)率與pimelate和lactate呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表6。

討 論

心理應(yīng)激研究目前多著重于應(yīng)激引發(fā)的抑郁、焦慮等情緒障礙[16-17]，但對(duì)于其導(dǎo)致的體重增長(zhǎng)緩慢、食欲下降等機(jī)制研究尚不足。束縛制動(dòng)是目前制備心理應(yīng)激動(dòng)物模型的經(jīng)典方法之一[18-19]。糖水偏好實(shí)驗(yàn)可有效評(píng)價(jià)動(dòng)物抑郁情緒的特征表現(xiàn)[20]。實(shí)驗(yàn)大鼠在曠場(chǎng)箱和高架十字迷宮中的自主行為、探究行為，以及探究與回避的矛盾沖突行為，是評(píng)價(jià)動(dòng)物緊張、焦慮、抑郁行為的經(jīng)典方法[21-22]。本研究結(jié)果表明，與正常大鼠比較，應(yīng)激大鼠5 min內(nèi)在曠場(chǎng)箱活動(dòng)距離減少，進(jìn)入高架十字迷宮開(kāi)放臂次數(shù)和停留時(shí)間均減少，而在封閉臂停留時(shí)間增加，應(yīng)激第21天大鼠對(duì)糖水的偏好程度也顯著下降，說(shuō)明慢性束縛應(yīng)激導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠探究性行為減少，自主行為活動(dòng)能力下降，逐漸出現(xiàn)緊張、抑郁、焦慮等不良情緒。與課題組前期報(bào)道[23-24]和國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[25-27]。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，伴隨應(yīng)激時(shí)間增加，我們觀察到應(yīng)激大鼠出現(xiàn)體重增長(zhǎng)緩慢，攝食量減少，血清D-木糖含量下降，小腸炭末推進(jìn)率降低，說(shuō)明束縛應(yīng)激不但引發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)了情緒障礙，胃腸動(dòng)力和吸收功能也出現(xiàn)下降。但分析血清D-木糖含量和小腸炭末推進(jìn)率與大鼠體重、攝食量之間并無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明束縛應(yīng)激大鼠胃腸動(dòng)力和吸收能力改變，并非是導(dǎo)致其體重、攝食量變化的直接因素，機(jī)體的代謝水平可能在其中發(fā)揮一定作用[13]。

采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)慢性束縛應(yīng)激大鼠血清中不飽和脂肪酸、血糖、高密度脂蛋白等化合物含量較正常大鼠明顯降低[8]。本研究采用同樣應(yīng)激方法，大鼠糞便中葡萄糖、核糖含量水平明顯高于正常大鼠。提示應(yīng)激大鼠腸道對(duì)糖類(lèi)吸收功能明顯下降，體內(nèi)存在嚴(yán)重的糖類(lèi)和能量代謝紊亂。短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被吸收，可為腸上皮細(xì)胞提供主要能量來(lái)源，維持腸道上皮細(xì)胞的完整性和正常功能，對(duì)抗炎癥，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和腸道菌群平衡等[28-30]。本研究應(yīng)激大鼠糞便中以乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽為主要成分的SCFAs鹽類(lèi)排出量明顯增多，說(shuō)明長(zhǎng)期慢性應(yīng)激不但影響了腸道的能量代謝，還影響了腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，出現(xiàn)腸道免疫功能的下降等。乳酸為關(guān)鍵的能量載體[31-32]，應(yīng)激大鼠糞便排出乳酸鹽增多，說(shuō)明機(jī)體存在能量代謝紊亂，與相關(guān)研究結(jié)果一致[9]。谷氨酸、丙氨酸與蛋白質(zhì)氨基酸代謝有關(guān)。有研究表明，谷氨酸缺乏是引起腸黏膜萎縮的主要原因，丙氨酸在內(nèi)臟氮循環(huán)中起著重要作用，可通過(guò)影響谷氨酰胺、一氧化氮的生成，使小腸絨毛萎縮，腸壁變薄，小腸完整性和免疫功能降低[33]；同時(shí)丙氨酸可通過(guò)丙氨酸-葡萄糖循環(huán)參與葡萄糖代謝，具有顯著的免疫和生糖作用。本研究中，應(yīng)激大鼠糞樣中丙氨酸、谷氨酸鹽排出增多，推測(cè)體內(nèi)丙氨酸、谷氨酸吸收不足，蛋白質(zhì)氨基酸代謝紊亂，能量代謝異常，腸道的完整性和免疫功能受到影響。

Figure 2.PLS-DA analysis of metabolites between two groups. The scores plot (A), the loading plot (B), the VIP plot (C) of PLS-DA analysis between two groups, and the statistical analysis plot(D) for metabolites (VIP value >1) obtained from PLS-DA witht-test.n=10 in the control group, andn=9 in the stress group. In figure 2D, the dotted line represents the threshold line ofP=0.05, the metabolites ofP>0.05 are marked with gray points, the metabolites ofP<0.05 are marked with red points, and the metabolites of the VIP value >1 obtained by PLD-DA analysis are marked with blue points.

圖2 2組大鼠糞樣代謝物PLS-DA分析圖

表6 慢性束縛應(yīng)激大鼠體重和攝食量與其它指標(biāo)相關(guān)性

*P<0.05,**P<0.01.

研究結(jié)果提示，應(yīng)激大鼠體內(nèi)不僅存在胃腸動(dòng)力和吸收功能下降，更存在能量代謝異常、蛋白質(zhì)氨基酸代謝紊亂。而應(yīng)激大鼠攝食量與糞樣代謝物acetate和pimelate呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明acetate和pimelate變化及其相關(guān)代謝途徑的改變，可能是慢性束縛應(yīng)激引起大鼠攝食量變化機(jī)制之一，相關(guān)研究在文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。但體重變化與糞樣代謝物相關(guān)性不明確，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

糞便是機(jī)體代謝的最終產(chǎn)物，也是研究應(yīng)激反應(yīng)的重要內(nèi)容。糞便作為代謝組學(xué)研究樣本在目前應(yīng)激文獻(xiàn)中很少涉及。但糞便也是宿主與腸道微生物相互作用相互影響所形成的共同代謝產(chǎn)物，acetate在本研究所獲得差異代謝物中濃度水平最高，應(yīng)激狀態(tài)下腸道菌群種屬和數(shù)量的改變?nèi)绾斡绊懙郊S便代謝物acetate和pimelate變化為課題組下一步需要明確的研究?jī)?nèi)容。