季紅薇, 朱 華, 林 叢, 張文淼, 陳 俊, 朱雪潔△, 鄒阮敏△
(1麗水市中心醫(yī)院婦產科, 浙江 麗水 323000; 2溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產科, 浙江 溫州 325000; 3溫州醫(yī)科大學微生物與免疫學教研室, 浙江 溫州 325035)
宮頸癌是全世界引起女性死亡的第2大腫瘤。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses, HPV)持續(xù)感染是引起宮頸癌的重要原因[1]。目前常見的高危型HPV有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59[1],其中,50%以上的宮頸癌與HPV16感染相關[2]。現(xiàn)已經(jīng)明確,HPV基因整合是促進宮頸癌發(fā)生的另一重要因素[3-4]。HPV DNA整合使病毒重要調控基因E2斷裂,HPV的E6和E7癌基因與宿主基因組一起轉錄表達,促進E6和E7癌蛋白表達[5]。E6能結合并滅活抑癌蛋白p53, E7能結合并泛素化降解抑癌蛋白pRb,這2種重要的細胞抑癌蛋白被降解是高危型HPV參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要機制[6-7]。雖然HPV16早期基因轉錄模式近幾年已有相關的報道,但迄今尚未見系統(tǒng)分析宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的E7相關轉錄模式。因此,本研究通過擴增癌基因轉錄本的方法檢測HPV16陽性的宮頸組織樣本[包括低度鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)組織、高度磷狀上皮內病變(high-grode squamous intraepithelial lesion, HSIL)組織和宮頸癌(cervical cancer, CxCa)組織]中HPV16E7相關轉錄模式,探討宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程不同病變時期E7相關轉錄本的變化。
53例HPV16陽性宮頸組織標本(包括15例LSIL、20例HSIL和18例CxCa)收集自溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2016年12月~2018年3月期間門診及住院患者,年齡范圍25~59歲,中位數(shù)為43歲。所有患者術前均未進行放、化療等治療,收集的標本均經(jīng)病理科確診。同時收集9例HPV陰性正常宮頸組織作為對照。本研究使用的臨床樣本已經(jīng)由患者知情以及醫(yī)院倫理委員會同意。每例標本離體后10 min內放入RNAlater保存待后續(xù)實驗。
RNAlater購自Ambion;TRIzol試劑購自Invitrogen;RNase-free DNase I 試劑盒購自TaKaRa;RT-PCR試劑盒和KOD -Plus- PCR試劑盒購自TOYOBO;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公司;T載體試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;Southern檢測試劑盒(North2South Chemiluminescent Detection Kit)購自Thermo;生物素-親和素化學發(fā)光試劑盒購自Pierce。引物合成和測序由上海生物工程有限公司完成。
3.1RNA提取 取RNAlater保存的宮頸組織樣本,按照TRIzol試劑的說明書分離RNA。為排除殘余DNA污染,按DNase I試劑盒說明書提純RNA,溶解于RNase-free 水,采用NanoDrop 2000C超微量分光光度計(Thermo)檢測RNA濃度,采用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)測定RNA純度。
3.2HPV16E7轉錄本的擴增 參考文獻[8]進行HPV16E7轉錄本的擴增(即乳頭瘤病毒癌基因轉錄本擴增,amplication of papillomavirus oncogen transcripts, APOT),引物序列見表1。按照RT-PCR試劑盒說明書,1 μg總RNA以含ployT17(17個T結尾)及通用序列的RT引物進行逆轉錄。cDNA產物以HPV16E7特異性引物(P1)和通用引物(P0)分別作為PCR的正向和反向引物,PCR擴增HPV16E7轉錄本。50 μL反應體系含:1.0 mmol/L MgSO4, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.2 μmol/L P1、P0,1.0 單位高保真酶(KOD -Plus-)。反應條件為:95 ℃ 90 s預變性,94 ℃ 30 s變性,59 ℃ 30 s退火,68 ℃ 2 min延伸,35個循環(huán),68 ℃ 6 min最終延伸(保證擴增片段的完整性)。
表1 HPV16 E7轉錄本檢測相關引物的序列
3.3HPV16E7轉錄本Southern blot檢測 HPV16E7轉錄本PCR產物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳,切去邊緣多余部分,置于200 mL變性液中,浸泡45 min,使凝膠上的雙鏈DNA轉變?yōu)閱捂淒NA,用去離子水沖洗凝膠2次,然后將凝膠中的DNA通過濕轉的方法原位轉移到硝酸纖維素膜上, 80 ℃干燥2 h,紫外交聯(lián)固定。按Southern blot檢測試劑盒說明書,用生物素標記的HPV16E6特異性探針(5’-bCAGCTACACCTACAGGCAACAACAA-3’,b代表生物素標記)55 ℃雜交過夜,洗膜。最后采用生物素-親和素化學發(fā)光試劑盒檢測。
3.4HPV16E7轉錄本序列分析 PCR產物電泳后,回收瓊脂糖凝膠中不同的PCR產物。參照T載體試劑盒說明書,將回收片段連到T載體上,挑單克隆,PCR鑒定后,進行測序,BLAST比對HPV16參考基因組序列(GenBank ID:K02718)獲得轉錄本中的病毒基因序列,BLAST比對NCBI中人參考基因組(GRCH38)獲得宿主基因序列。
與LSIL組織比較,HSIL及CxCa組織存在更加復雜、多樣的E7基因轉錄本,但未見特征的轉錄本,見圖1。
Figure 1. APOT assay was used to detect HPV16E7-related transcripts. A: transcripts in LSIL; B: transcripts in HSIL; C: transcripts in cervical cancer tissues. M: marker.
圖1 APOT檢測LSIL、HSIL及宮頸癌組織中HPV16E7相關的轉錄本
經(jīng)上述建立的方法擴增轉錄本片段,連接T載體,經(jīng)測序以及序列比對分析后,得到5種HPV16E7的轉錄模式,并繪制模式圖,見圖2。模式A和B均以E7-E1開始,其中模式A的病毒基因直接以polyA結尾,E1基因的3’端有4種斷裂位點,分別在nt880、nt949、nt1054和nt1234;而模式B中病毒基因與宿主序列發(fā)生整合,其E1基因的3’端有2種剪切位點,分別為nt880和nt1107;模式C和模式D中都包含了病毒基因序列和宿主基因序列,屬于典型的整合型轉錄本。模式C中SD880與SA2709剪接,E2基因3’端的nt2870與宿主基因整合;模式D中SD880與SA3358剪接,E4基因3’端的nt3619位點與宿主基因整合。模式E與模式D類似,也有SD880-SA3358的剪切形式,并且還有E4-L1之間的晚期基因剪切SD3632-SA5639,見圖3。
HPV16E7的5種轉錄模式在不同癌變程度的宮頸組織中存在較大的差異。本研究發(fā)現(xiàn),模式A與B在所有HPV16陽性的宮頸組織中都能檢測到,并且主要在HSIL組織中,分別占61.5%和72.9%。模式C絕大多數(shù)在宮頸癌組織中檢測到,占88.9%,其次主要位于HSIL組織,見圖4。
通過E4特異性探針的Southern blot驗證模式D和E在宮頸癌組織中的表達。如圖5所示,部分標本(如3、4、8、9、14等標本)未能檢測到含E4轉錄本,且不同宮頸癌標本檢測的含E4轉錄本也存在明顯差異條帶。
Figure 2.Five transcript pattern diagrams related to HPV16E7. §: in pattern A, there were 4 cleavage sites of theE1gene, nt880, nt949, nt1054, and nt1234; ▲: in model B, there were 2 cleavage sites for theE1gene, nt880 and nt1107.
圖2 HPV16E7相關的5種轉錄本模式圖
Figure 3.Altenative splicing sequence characteristics of types C, D and E in HPV16E7transcripts.
圖3 HPV16E7轉錄本C、D、E模式可變剪切序列特征
持續(xù)性感染高危型HPV會導致病毒拷貝量在宿主細胞中累積,同時病毒癌性基因的轉錄模式也會向有利于腫瘤細胞增殖的方向發(fā)展。因此,不同惡變程度的宮頸腫瘤細胞,HPV轉錄模式也會不同。與大多數(shù)病毒基因組類似,HPV基因屬于雙順反子或多順反子,基因轉錄后未成熟的mRNA一般通過剪切加工才能變成成熟的mRNA[9],這種RNA的選擇性剪切機制對于病毒基因的表達具有重要意義。不同的RNA剪切會產生不同的轉錄模式,因此表達的蛋白也會不同。目前也有不少研究者采用人乳頭瘤病毒癌基因擴增的方法檢測游離型和整合型的病毒癌基因轉錄模式[8-9,14],但是這種巢式PCR的檢測方法存在一定局限,它無法有效擴增由病毒基因和整合基因構成的融合型長序列的轉錄本,導致檢測的整合型轉錄本數(shù)少于實際的數(shù)量。另外,這種方法傾向于擴增本底mRNA濃度高、轉錄本數(shù)量多的轉錄模式而忽略本底量少的轉錄模式[14]。因此,我們通過優(yōu)化檢測方法避免人為增強高含量轉錄本的擴增優(yōu)勢,使檢測結果更客觀。
Figure 4.Proportion of the 5 transcriptional modes of HPV16E7in cervical tissues at various pathological levels.
圖4 HPV16E75種轉錄模式在各病理級別宮頸組織中所占的比例
Figure 5.Southern blot analysis of HPV16E7transcript expression in cervical cancer tissues. Lanes 1~15 represent the specimens of cervical cancer tissue No.1~15, respectively.
圖5 Southern blot檢測HPV16E7轉錄本在宮頸癌組織中表達
近年已有HPV16早期基因轉錄模式的報道[8,10],例如,E6的游離型轉錄本E6-E7-E1^E4和整合型轉錄本E6-E7-E1^cellular DNA、E6-E7-E1^E4- cellular DNA、E6-E7-E1-cellular DNA等;E7的游離型轉錄本E7-E1^E4和一些整合型的轉錄本E7-E1^cellular DNA、E7-E1^E4-cellular DNA等。HPV16E7早期基因轉錄模式在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的變化,迄今尚未闡明。本研究顯示HPV16E7早期基因轉錄模式在宮頸癌變各時期中存在很大差異。在5種HPV16E7轉錄模式中,除了已經(jīng)報道的轉錄模式B和D[10],轉錄模式A、C和E是首次發(fā)現(xiàn),其中轉錄模式B、C、D和E屬于融合型,模式A屬于游離型。我們發(fā)現(xiàn)在一些宮頸癌樣本中甚至包含了所有5種檢測到的轉錄本,提示游離型和整合型的轉錄模式在高度癌變的宮頸組織中可以同時存在[8]。HPV16E7的轉錄模式在宮頸癌變各時期中的差異都較大,模式D和E只在宮頸癌中檢測到,而模式A和B卻在所有類型的癌變宮頸組織中都能檢測到。這些結果進一步證明轉錄模式的選擇是一個動態(tài)的過程[15]。為了促使宿主細胞能克服變化的環(huán)境帶來的不利因素而不斷地增殖,病毒基因組會選擇最優(yōu)的基因表達模式,這就容易理解:隨著細胞癌變程度的加深,病毒的某些特定轉錄模式會逐漸增多而形成優(yōu)勢轉錄。