王瑞，姜現(xiàn)壘，董建國，曲哲會(huì)，趙瑜，張建錄，劉濤**

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院，河南信陽，464000；2.信陽市平橋區(qū)畜牧工作站河南信陽464100）

豬源大腸桿菌是造成新生仔豬斷奶后仔豬腹瀉的最重要病原，由于大腸桿菌血清型眾多，且抗生素耐藥性問題日益突出，尋找具有抑制大腸桿菌的中藥品種具有十分重要的意義。貓爪草原為無名野草，藥用歷史較短，是上世紀(jì)50 年代于河南省信陽地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種草藥，后經(jīng)信陽中醫(yī)院依據(jù)其根形及能治療鼠瘡的特點(diǎn)定名為“貓爪草”[1]。本文通過紙片法、打洞法、牛津杯法、試管二倍稀釋法，探討貓爪草提取物對(duì)豬源大腸桿菌體外抑菌效果。

1 材料

1.1 藥物及試劑

貓爪草購自信陽市淮濱縣中草藥市場；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基購自杭州濱河微生物試劑有限公司；豬源大腸桿菌由河南省信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院動(dòng)物疾病監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 中藥藥液的提取

將50g 貓爪草放入500mL 水中，浸泡30min 以后再煮沸30min。冷卻后用智能真空泵及布氏漏斗對(duì)藥液進(jìn)行過濾，濾液備用。于沉渣中加500mL 水，第二次煮沸30min。冷卻后用智能真空泵及布氏漏斗對(duì)藥液進(jìn)行過濾。然后將兩次濾液倒在一起，離心除去沉淀的沉渣，將濾液放至水浴鍋進(jìn)行濃縮至50mL。此時(shí)制得的藥液濃度為1g/mL。

1.3 藥敏片的制備

取定性濾紙，制作成6mm 直徑的圓形紙片，將紙片進(jìn)行高壓滅菌烘干備用。將藥液制備成1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL 的濃度，各取1mL 藥液分別浸泡50 片藥敏試紙片1h，將浸泡好的藥敏片烘干。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌液的制備

取甘油冷凍保存的大腸桿菌凍存管，放置到40℃恒溫水浴鍋中復(fù)蘇。抽取菌液注入至肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h。保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 細(xì)菌平板計(jì)數(shù)

將大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物用涂菌棒涂布到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，37℃培育16 h 后，挑取單個(gè)菌落再次接種到肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，將肉湯稀釋至105CFU/mL，置4℃冰箱內(nèi)保存。

2.2 分光光度計(jì)計(jì)數(shù)

將菌液加入含有5mL 營養(yǎng)肉湯的試管中，放入37℃恒溫振蕩箱，分別于2h、3h、4h、5h、6h、7h 每隔一小時(shí)取2mL 培養(yǎng)液經(jīng)分光光度計(jì)測量600nm 細(xì)菌的OD 值，用蒸餾水做對(duì)照，繪制細(xì)菌生長曲線，并觀察細(xì)菌生長達(dá)到峰值的時(shí)間。

2.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1 藥敏片法

抽取100μL 菌液注入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用涂菌棒涂布均勻。將藥敏片均勻貼到培養(yǎng)基表面。待干燥后，貼上不同濃度的（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、對(duì)照組）的藥敏片。將培養(yǎng)基置37℃恒溫培養(yǎng)箱中18h，量取抑菌圈直徑。

2.3.2 打孔法

抽取100μL 菌液注入到培養(yǎng)基上并涂布均勻。靜置干燥5min，用打孔器等距打五個(gè)孔，在孔內(nèi)注入不同濃度的藥液（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、對(duì)照組）50μL。將培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)18h 后，量取抑菌圈直徑。

2.3.3 牛津杯法

用滅菌棉簽將稀釋好的濃度為105CFU/mL 的菌液均勻地涂抹于營養(yǎng)瓊脂表面。將五個(gè)滅菌的牛津杯，等距放置在培養(yǎng)基上，牛津杯孔內(nèi)加入不同濃度的藥液（1g/mL、0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、對(duì)照組）50μL。將營養(yǎng)瓊脂基置于37℃溫箱中培養(yǎng)18h，分別量取抑菌圈直徑。

2.3.4 最小抑菌濃度測定

準(zhǔn)備10 支試管，在第1 支試管注入1.5mL 藥液和0.5mL 肉湯，調(diào)整藥液濃度為0.75g/mL；其余9 支試管依次注入2mL 營養(yǎng)肉湯，在第2 支試管注入2mL 濃度為1g/mL 藥液，多次混合均勻，再吸取2mL 注入第3 只試管，依次稀釋到第9 只試管，最后棄去2mL；最后再往每一支試管中注入100μL 菌液。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，將試管標(biāo)記好放置于37℃恒溫箱培育過夜，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 抑菌圈

見表1：結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：參考引文[1]。實(shí)驗(yàn)表明，三種不同方法結(jié)果均表明貓爪草提取液在0.75g/mL 和1g/mL 濃度時(shí)，對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抑菌效果。

表 1 不同方法測定的平均抑菌圈大小

圖2 藥敏片法

圖3 打孔法

圖4 牛津杯法

3.2 最低抑菌濃度

見表2：判定標(biāo)準(zhǔn)參考引文[1]。

見圖5 和圖6，標(biāo)記為D-J 試管均有明顯渾濁，取A、B、C 清亮的的混合液，涂布平板，涂A 試管的平板僅長出個(gè)別菌落，B、C 平板長滿菌落，判定0.75g/mL 是最小抑菌濃度，將該平板培育48h，出現(xiàn)大量菌苔。

表 2 二倍稀釋法試管濃度

圖5 不同濃度藥液與菌液混合培養(yǎng)物

圖6 不同濃度混合培養(yǎng)物涂布培養(yǎng)基

3.3 最低殺菌濃度

見表3，判定標(biāo)準(zhǔn)參考引文[1]。

見圖6，原藥液濃度濃縮為2g/mL 后，重復(fù)上述操作，后6 支試管均有明顯渾濁，取a、b、c、d 清亮的混合液，涂布營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。涂a 試管混合液的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基僅生長出個(gè)別菌落，b、c、d 平板長滿菌苔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，涂布a 試管混合液的營養(yǎng)瓊脂平板上仍僅有個(gè)別菌落，判定1g/mL 為MBC。

表 3 二倍稀釋法試管濃

4 討論與結(jié)論

4.1 討論

本試驗(yàn)為水煎法制得中藥提取物，和引文標(biāo)注的醇提法不同[1]。一般醇提法可降低雜質(zhì)部分含量。提取方法與中藥的抑菌效果有一定聯(lián)系。需要進(jìn)一步試驗(yàn)醇提法制備貓爪草提取物，驗(yàn)證其抑制豬源大腸桿菌的效果。目前中藥體外抑菌試驗(yàn)主要有紙片擴(kuò)散法和二倍稀釋法，但是試驗(yàn)過程可能會(huì)受到細(xì)菌耐藥性、中藥有效部位的提取方法影響。因此本試驗(yàn)采用藥敏片法、打孔法和牛津杯法三種方法分別測量抑菌圈大小，試驗(yàn)對(duì)象統(tǒng)一，盡可能保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。臨床上豬源大腸桿菌分離株較多，此次試驗(yàn)僅對(duì)1 株豬源大腸桿菌進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，今后還需陸續(xù)對(duì)更多的分離株進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

4.2 結(jié)論

采用水提法獲得的貓爪草提取物對(duì)分離的豬源大腸桿菌具有一定的抑菌效果。通過試驗(yàn)結(jié)果可知，貓爪草提取物對(duì)該株大腸桿菌的最低抑菌濃度是0.75g/mL，最低殺菌濃度是1g/mL。貓爪草過去主要用于治療肺結(jié)核、淋巴結(jié)炎、咽喉炎、癤病、腫瘤等疾病。通過此次試驗(yàn)，證實(shí)其對(duì)豬源大腸桿菌同樣具有抑菌效果，在減抗替抗的養(yǎng)殖業(yè)大背景下，貓爪草具有一定的開發(fā)利用

圖7 最小殺菌濃度的測定