康潔，房玉杰

(商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘，476000)

白藜蘆醇是植物體內(nèi)合成的具有抗氧化作用和抗腫瘤作用的一種酚類化合物[1]，在花生、紅葡萄和虎杖等植物體內(nèi)含量較多，而花生發(fā)芽后，體內(nèi)白藜蘆醇含量增加多倍[2]，但在花生芽不同部位含量不同[3].本實(shí)驗(yàn)室選擇花生芽合成白藜蘆醇最高部位，進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，以期獲得白藜蘆醇高效的生產(chǎn)方法.本實(shí)驗(yàn)從酶濃度和組合，酶作用時(shí)間和離心速度、洗滌液甘露醇濃度以及酶的pH值幾個(gè)方面進(jìn)行了研究，研究數(shù)據(jù)為原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

恒溫培養(yǎng)箱(上海長城華美儀器化劑公司)，普通光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)，紫外分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海和呈儀器制造有限公司)，水浴鍋(常州國華電器有限公司)，低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠).

主要試劑纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、甘露醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司).

1.2 材料準(zhǔn)備

25 ℃恒溫下避光培養(yǎng)花生芽，分析花生芽不同部位白藜蘆醇含量[4]，經(jīng)紫外分光光度法檢測，確定花生芽3 cm長的下胚軸白藜蘆醇含量最高.取3 cm長的下胚軸，制備原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)[5,6].

1.3 花生芽原生質(zhì)體制備

1.3.1 原生質(zhì)體洗滌液配制

1.3.2 酶液配制

稱取適量酶固體溶于含有0.6 mol/L甘露醇洗滌液中，在50 ℃水浴保溫5 min,使其充分溶解，分別配出2%纖維素酶、1%纖維素酶、0.5%纖維素酶、1%果膠酶、0.5%果膠酶、0.25%果膠酶、0.25%半纖維素酶，過濾除菌，放4 ℃冰箱備用.

1.3.3 原質(zhì)體計(jì)數(shù)與活力測定方法

使用0.1 mm XB-K-25型血球計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體數(shù).首先清洗血球計(jì)數(shù)板，并用吸水紙吸干殘余水滴；在顯微鏡下將原生質(zhì)體溶液滴在計(jì)數(shù)板蓋玻片一側(cè)，使之滲入并充滿計(jì)數(shù)室；顯微鏡下計(jì)數(shù)中央大方格內(nèi)的原生質(zhì)體個(gè)數(shù)，計(jì)算出1mL懸液中原生體數(shù)，原生體產(chǎn)量按照如下公式計(jì)算[7]：

原生質(zhì)體產(chǎn)量(細(xì)胞數(shù)/g)=1 mL懸浮液中的原生質(zhì)體數(shù)×原生質(zhì)體懸浮液總體積(mL)/材料總質(zhì)量(g)

采用倒置相差顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)判斷活力.有活力的細(xì)胞個(gè)大、飽滿、透光，活力小或死亡的細(xì)胞個(gè)小、干癟、透光度差.取適量原生質(zhì)體懸液做成水裝片，不染色，直接在倒置相差顯微鏡下觀察、拍照，并取同量的懸液計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù).原生質(zhì)體的活力計(jì)算如下：

原生質(zhì)體活力=(飽滿透光原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù))×100%

1.3.4 花生芽下胚軸原生質(zhì)體制備條件優(yōu)化

(1)酶濃度與組合的影響

兩種酶液1∶1配比，設(shè)計(jì)7種組合方式，如表1，每種組合都用10 mL洗滌液與50 ul 1mol/L NaOH稀釋，然后向各組加入0.9 g 3 cm花生芽下胚軸，放于25 ℃暗環(huán)境下酶解60 min，分別用300目尼龍網(wǎng)過濾，濾液用700 r/min 離心5 min,取沉淀，加3 mL洗滌液懸浮，重復(fù)離心一次，最后沉淀用洗滌液懸浮定容10 mL.按照1.3.3方法計(jì)數(shù)測活力.

表1 酶濃度與酶組合

(2)酶解時(shí)間的影響

采用酶組合中原生質(zhì)體產(chǎn)量最高的一組，在25 ℃暗環(huán)境下酶解，設(shè)立時(shí)間 20 min,40 min,60 min,80 min,100 min,120 min，酶解液經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，700 r/min離心5 min,取沉淀，加3 mL洗滌液懸浮，重復(fù)離心一次，得到的沉淀洗滌液懸浮定容10 mL.按1.3.3方法計(jì)數(shù)和測活力.

(3)離心速度的影響

在最佳酶組合與酶解時(shí)間下，設(shè)原生質(zhì)體離心速度分別為500 r/min 、600 r/min 、700 r/min、800 r/min、900 r/min、1000 r/min，離心5min,取其沉淀，加相同適量洗滌液懸浮，重復(fù)離心一次.按1.3.3方法計(jì)數(shù)和測活力.

(4)甘露醇濃度的影響

將入0.9 g 3 cm花生芽下胚軸分別放入甘露醇濃度為0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L、0.9 mol/L的洗滌液中，采用最佳酶液組合、最佳酶解時(shí)間和離心速度.酶解完成后，按1.3.3方法測原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力.

(5)pH值大小的影響

調(diào)酶解液pH分別為4、4.5、5、5.5、6、6.5,使用0.9 g 3 cm花生芽下胚軸，用最佳酶組合、酶解時(shí)間最佳離心速度和甘露醇濃度，按上述方法酶解、洗滌、離心，得到的沉淀懸浮、定容.按1.3.3方法測原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力.

2 結(jié)果分析

2.1 酶濃度與組合的影響結(jié)果

在不同酶濃度酶組合中的花生芽下胚軸，生產(chǎn)出的原生質(zhì)體數(shù)和活力存在明顯差異，如表2所示，同樣條件下，在組合4中，1%的纖維素酶和0.5%的果膠酶共同作用，產(chǎn)量達(dá)到6.4×104cells/g 、細(xì)胞活力達(dá)91%，此時(shí)，顯微鏡下細(xì)胞表現(xiàn)出較大而圓.從表2中還可以看出，兩種酶濃度組合一起，原生質(zhì)體數(shù)量是增大的，但活力不夠高，而且顯微鏡下表現(xiàn)出細(xì)胞個(gè)體較小、透光度差(如圖1)，說明酶作用強(qiáng)烈會(huì)影響細(xì)胞的生命活力.

表2 酶濃度與酶組合對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量與活力的影響

圖1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量圖1a酶組合4；圖1b酶組合6

2.2 酶解時(shí)間的影響結(jié)果

在2.1最佳酶組合條件下，作用溫度一致，不同的作用時(shí)間，分離的原生質(zhì)體結(jié)果如圖2.在酶作用60 min時(shí)數(shù)量最多，達(dá)8×104cells/g，原生質(zhì)體活力在酶作用60-80 min時(shí)段內(nèi)，變化不明顯，活力都比較高，而后，時(shí)間再延長，活力降低，且細(xì)胞數(shù)量也減少，這是因?yàn)槊缸饔眯枰线m的溫度，溫度過高，酶會(huì)失活.

圖2 酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體數(shù)量與活力的影響

2.3 離心速度的影響結(jié)果

離心可使酶解液中的細(xì)胞沉淀下來，便于收集原生質(zhì)體，但是離心速度過大，離心力會(huì)影響細(xì)胞活力[8].實(shí)驗(yàn)1.3.4通過不同轉(zhuǎn)速的離心得到的原生質(zhì)體結(jié)果如表3，在900 r/min 時(shí)，原生質(zhì)體數(shù)量達(dá)15.8×104cells/g,而細(xì)胞活力只有72%，在離心速度600 r/min時(shí)，細(xì)胞活力達(dá)93%，但在700 r/min 、800 r/min時(shí)細(xì)胞活力與最大值差別不明顯，而且此時(shí)細(xì)胞數(shù)量接近15.8×104cells/g最大值.提示取700 r/min 、800 r/min轉(zhuǎn)速比較合適.

表3 離心速度對(duì)原質(zhì)體產(chǎn)量與活力的影響

2.4 甘露醇濃度的影響結(jié)果

甘露醇與洗滌液混合使用，通過影響酶對(duì)細(xì)胞的滲透，影響原生質(zhì)體的分離效果[9].實(shí)驗(yàn)1.3.4甘露醇的影響結(jié)果如圖3.在甘露醇使用濃度0.6 mol/L時(shí)分離的原生質(zhì)體細(xì)胞表現(xiàn)為大而圓，透光度好，生命活力較大，獲得的數(shù)量最多.而細(xì)胞活力在甘露醇使用濃度0.6-0.8 mol/L之間，都較高，且表現(xiàn)平穩(wěn),在0.4 mol/L和0.9 mol/L時(shí)，無論分離的數(shù)量還是活力都下降.

2.5 pH值大小的影響結(jié)果

酶的活性對(duì)pH 值很敏感，從而產(chǎn)生對(duì)酶解效果的影響[10].同樣的實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)不同pH值的酶液處理后，分離的原生質(zhì)體數(shù)量和活力表現(xiàn)明顯差異(如圖4)，pH值在5.5-6之間時(shí)，都有較好的分離效果，活力和數(shù)量都達(dá)到最高值.提示，混合使用纖維素酶和果膠酶時(shí)pH值調(diào)控在5.5-6之間最好.

圖3 甘露醇對(duì)原生質(zhì)體分離數(shù)量與活力的影響

圖4 酶液pH值對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

3 結(jié)論與討論

體外培養(yǎng)，細(xì)胞要達(dá)到一定數(shù)量，彼此影響，才容易培養(yǎng)成功，但分離的細(xì)胞活力，也是決定培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵[11].足量和高活力的原生質(zhì)體是后續(xù)培養(yǎng)的基礎(chǔ)和保障，而原生質(zhì)體的產(chǎn)率和活力又受多因素的影響，其中酶濃度和組合使用影響最大，酶的作用時(shí)間和pH值的影響也很顯著，離心速度對(duì)分離的原生質(zhì)體活力也有一定影響[12].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，混合使用纖維素酶和果膠酶，在纖維素酶1%、果膠酶0.5% 以1∶1組合時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)率和活力都最高，此時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)出大而圓，透光度好，在這種組合條件下，采用60 min酶解時(shí)間，原生質(zhì)體數(shù)量與活力最佳，如2.2對(duì)原生質(zhì)體洗滌時(shí)，離心力會(huì)影響細(xì)胞活力，600 r/min時(shí)活力最大，隨著離心力增加，活力逐漸減小，但收集的細(xì)胞數(shù)量會(huì)增加，所以，實(shí)際操作中選擇中間轉(zhuǎn)速，可以兼顧原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力.

酶解液的pH值通過影響酶的活力和通透性，從而影響原生質(zhì)體的分離，圖4顯示出，混合酶作用pH值在在5.5-6之間時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最佳.

花生芽下胚軸原生質(zhì)體分離條件的優(yōu)化，為花生芽下胚軸原生質(zhì)體培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)還會(huì)通過正交實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探討多因素多水平對(duì)花生芽下胚軸原生質(zhì)體分離的影響.

通過植物細(xì)胞培養(yǎng)高效獲得特殊細(xì)胞成分，已在生物領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域取得很多的成果[13].從培養(yǎng)的花生芽細(xì)胞中提取白藜蘆醇，會(huì)比從花生芽中提取節(jié)省大量的時(shí)間和養(yǎng)殖空間，提高生產(chǎn)效率，而且原生質(zhì)體的分離，還會(huì)為花生的細(xì)胞融合、創(chuàng)造多產(chǎn)白藜蘆醇花生品種奠定技術(shù)基礎(chǔ).