秦丹丹，李梅芳，許甫超，徐 晴，葛雙桃，董 靜

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所,湖北武漢430064； 2.糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室,湖北武漢 430064)

葉色突變是植物界的一種特殊現(xiàn)象，多在苗期表達，存在多種變異形式，且易于識別；根據(jù)苗期葉色，可將這類突變體分為白化、黃化、淺綠、白翠、綠白、黃綠、綠黃和條紋8種類型[1]。在作物中，葉色突變研究多集中于水稻上，迄今已報道了近百個變異類型豐富的水稻葉色突變體(http://www.gramene.org)。我國科學家也在多個水稻材料中發(fā)現(xiàn)了各具特色的葉色突變體[2-5]，而且隨著水稻基因組測序的完成，通過圖位克隆的方法也已成功分離到若干葉色變異調(diào)控基因[6-8]。在玉米中，通過不同途徑也篩選到多個葉色突變體，并發(fā)現(xiàn)相關(guān)突變基因涉及電子傳遞，蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運和定位，信號傳遞、能量代謝等生理生化過程[9]。大麥中也報道過多個葉色突變體，如受遺傳和環(huán)境因素共同控制的大麥葉色轉(zhuǎn)換突變系[10]、來源于裸大麥北青7號EMS誘變庫的葉色突變體[11]、經(jīng)疊氮鈉處理獲得的葉綠素突變體Viridis、flavoviridis、chlorina、albina[12]、白化突變體albostrians[13]、大麥葉色黃化突變體[14]等。本課題組從鄂大麥6號中發(fā)現(xiàn)的階段性白化突變體whs18，在正常田間生長條件下，葉片表現(xiàn)為綠色-黃化-白化-條紋白-轉(zhuǎn)綠的階段性變化過程[15]。

大麥黃綠葉色突變體ygl是本課題組從鄂大麥934的EMS突變體庫中篩選獲得的，連續(xù)多年的田間觀察發(fā)現(xiàn)，該突變體從出苗開始，葉片便呈現(xiàn)黃綠色，后期葉片表現(xiàn)為淺綠色。本研究以正常葉色大麥品種Harrington和黃綠葉色突變體ygl為親本構(gòu)建了F2分離群體并對大麥黃綠葉色調(diào)控基因HvYGL(yellow green leaf)進行了初步定位，以期為該基因的精細定位和克隆奠定基礎(chǔ)，同時為在大麥育種中應用該突變體提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用材料為鄂大麥934，以及來源于鄂大麥934 EMS突變體庫的黃綠葉色突變體ygl和引自加拿大且與鄂大麥934無任何血緣關(guān)系的正常葉色大麥品種Harrington。

1.2 表型觀察及性狀測定

2014、2015和2016年秋季將材料種植于湖北省農(nóng)科院糧食作物研究所位于湖北武昌的核心試驗地中，生長和管理條件同當季正常材料。正常田間條件下、正常生長季節(jié)內(nèi)(湖北，武昌)收獲的ygl和野生型鄂大麥934，隨機選取10株考察株高、單株穗數(shù)、穗長和穗粒數(shù)，取其平均數(shù)作為各材料的性狀值。隨機選取ygl和鄂大麥934的種子100粒進行稱重，取三次重復計算平均值，并計算千粒重，從而分析葉色突變對ygl主要農(nóng)藝性狀的影響。利用透射電鏡觀察并比較野生型和ygl苗期葉片中葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，具體步驟參考Qin等[15]的方法。

1.3 大麥黃綠葉色調(diào)控基因HvYGL的遺傳分析及初步定位

構(gòu)建ygl和正常葉色大麥Harington的遺傳分離群體，對F1、F2及F2:3植株的表型及分離比例進行觀察和統(tǒng)計分析，通過卡方測驗進行統(tǒng)計學檢測，分析該性狀調(diào)控基因的遺傳特性。參照Michelmore[16]等文章中所述BSA方法，從F2分離群體中隨機選取10株綠色野生型單株和10株黃綠單株的DNA分別等量混合構(gòu)建正常性狀池和突變性狀池，然后將親本Harrington和ygl間有差異的分子標記在兩個池間進行篩選，在不同性狀池間存在多態(tài)性且與對應親本一致的標記即為連鎖標記。之后利用上述連鎖標記分析包含有144個單株(含56個綠株和88個黃綠株)的F2群體的基因型，從而構(gòu)建HvYGL基因的遺傳連鎖圖譜。其中，DNA提取采用CTAB法，混池及單株的基因型分析采用普通聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細管電泳，SSR引物來源于Graingene(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)，由上海Invitrogen公司合成，熒光引物的合成和毛細管電泳分析由武漢天一輝遠公司協(xié)助進行，遺傳連鎖圖譜構(gòu)建采用mapmaker3.0軟件[15]。

利用連鎖標記序列信息，在已公布的大麥品種Morex的基因組序列(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley_ibsc/viroblast.php)中通過blast搜索其所在的Morex_contig，從而分析其所在的染色體位置及其包含的功能基因等相關(guān)信息，并篩選可能的候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥黃綠葉色突變體ygl的葉色及農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

通過2014-2015、2015-2016和2016-2017年度連續(xù)3年的田間觀察發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下，大麥黃綠葉色突變體ygl的葉色在整個生育期內(nèi)都較野生型淺，葉片從苗期開始即呈現(xiàn)黃綠色(圖1)，拔節(jié)期后逐漸變?yōu)闇\綠色。對農(nóng)藝性狀進行考察發(fā)現(xiàn)，與野生型鄂大麥934相比，ygl株高和千粒重分別呈極顯著和顯著降低，而單株穗數(shù)、主穗穗長、主穗穗粒數(shù)等性狀無顯著差異(表略)。

2.2 大麥黃綠葉色突變體ygl苗期葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu)

對野生型鄂大麥934和黃綠葉色突變體ygl苗期葉片的超微結(jié)構(gòu)進行觀察發(fā)現(xiàn)，在鄂大麥934的葉片中，基粒類囊體垛疊排列成基粒片層，基粒片層和基質(zhì)片層沿著葉綠體的縱軸交替排列(圖2a)。而ygl葉片中基粒類囊體嚴重線性化，觀察不到完整的基粒片層和基質(zhì)片層，葉綠體超微結(jié)構(gòu)受損(圖2b)。

圖1 野生型鄂大麥934與黃綠葉色突變體ygl在苗期(a)和抽穗期前(b)的葉色表現(xiàn)

圖2 鄂大麥934(a)和ygl(b)苗期葉片葉綠體的超微結(jié)構(gòu)

2.3 大麥黃綠葉色調(diào)控基因HvYGL的遺傳分析

為了解該性狀的遺傳模式，以正常葉色大麥Harrington為母本，以ygl為父本配制了雜交組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1植株都呈現(xiàn)正常葉色，F(xiàn)2群體中綠苗和黃綠苗的數(shù)目分別為251株和88株?？ǚ綔y驗表明，二者符合3∶1的分離比例(χ2= 0.16，χ2(0.05,1)=3.84)。進一步對F2:3家系的表型進行觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2表現(xiàn)為正常綠色的單株，其衍生的F3有的表現(xiàn)為純合綠色，有的則表現(xiàn)為黃綠分離；而F2表現(xiàn)為黃綠葉色的單株，其衍生的F3全部表現(xiàn)為純合黃綠葉色。以上結(jié)果均說明本研究中所關(guān)注的大麥黃綠葉色性狀是由一個隱性核基因控制的質(zhì)量性狀，將其命名為HvYGL。

2.4 大麥黃綠葉色調(diào)控基因HvYGL的初步定位

以上述F2分離群體為定位群體，首先利用均勻分布于大麥7條染色體上的400對SSR引物，通過聚丙烯酰胺凝膠在親本間進行多態(tài)性分析，共獲得71對多態(tài)性引物。利用以上多態(tài)性引物在野生型和突變型混池間進行分析，共獲得4對在混池間表現(xiàn)多態(tài)性、可能與性狀連鎖的標記(表1)，Bmag0136、Bmac0209、EBmac0871和Bmag603，均位于大麥3H染色體上。其中，由于EBmac0871和Bmag603在野生型和突變型間的擴增片段長度差異較小，因此，為了更準確地對F2單株進行基因型分析，根據(jù)EBmac0871和Bmag603引物序列，合成了熒光標記，通過毛細管電泳分析二者在F2分離群體中的基因型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個標記在野生型和突變型單株間分別存在4 bp和2 bp的長度差異(圖3B)。同時，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Bmag0136和Bmac0209的基因型(圖3A)。結(jié)合毛細管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，構(gòu)建了大麥黃綠葉色調(diào)控基因HvYGL的連鎖圖譜，最終將該基因定位在大麥3H染色體上12.7 cM的區(qū)間內(nèi)(圖4)，位于SSR標記Bmag0136和Bmac0209之間，且Bmac0209、EBmac0871、Bmag603在黃綠單株中與HvYGL共分離。

圖A為Bmac0209在親本及黃綠單株中的基因型分析，其中，M為marker， P1為Harrington，P2為ygl，F(xiàn)2黃綠單株為F2分離群體中的黃綠葉色單株；圖B為EBmac0871在親本Harrington和ygl及F2雜合個體中的毛細管電泳圖。

Fig.A:Polymorphic analysis ofBmac0209; M:marker; P1:Harrington; P2:ygl; F2yellow-green individuals:Individuals with yellow-green leaves in the F2population；Fig.B:Capillary electrophoresis analysis ofEBmac0871in Harrington,ygland heterozygous individuals from F2population.

圖3 連鎖標記在F2群體中的多態(tài)性分析

圖4 HvYGL在大麥染色體上的定位及其連鎖圖譜

進一步根據(jù)上述連鎖標記的序列信息在已公布的大麥基因組序列數(shù)據(jù)庫(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)中搜索相似序列，將這些標記定位在大麥基因組上(表1)。從表1中可以看出，這些標記位于大麥3H染色體上50.7082～52.0299 cM的區(qū)間內(nèi)，但是對這4個標記所位于的5條Morex_contig的序列進行詳細分析，表明這些Morex_contig不包含任何功能基因。

3 討 論

葉色突變通常由葉綠體結(jié)構(gòu)缺陷和葉綠素代謝異常引起，并因此影響植株的光合作用，最終導致產(chǎn)量降低。特別是不可轉(zhuǎn)綠的白化突變體，往往因為不能正常進行光合作用而最終死亡，因此，葉色突變常被認為是有害的突變。但是，葉色突變體卻是解析植物光合作用、光形態(tài)建成等過程的理想材料[17-19]。本研究所用的大麥黃綠葉色突變體ygl，在田間種植時，整個生育期內(nèi)葉色都較野生型淺，特別是在苗期至拔節(jié)期，都表現(xiàn)為典型的黃綠葉色，后期則表現(xiàn)為淺綠色。這種葉色異常雖然對單株穗數(shù)、穗長和穗粒數(shù)沒有產(chǎn)生顯著影響，但是與野生型相比，ygl的株高和千粒重卻顯著降低。對葉片中的葉綠體超微結(jié)構(gòu)進行觀察發(fā)現(xiàn)，ygl葉綠體表現(xiàn)異常，也暗示著ygl葉片的光合作用可能受阻，引起株高和千粒重的降低。

對葉色突變性狀的調(diào)控基因進行定位和克隆是充分利用這類突變的分子基礎(chǔ)。多數(shù)葉色突變性狀是由單隱性核基因控制的，也有少數(shù)是由細胞質(zhì)基因或者核質(zhì)基因互作控制的，如小麥返白系的階段性返白特性[20]和大麥葉綠素缺失突變體CL2所表現(xiàn)的葉色突變[21]。本研究利用正常葉色大麥Harrington和ygl構(gòu)建了分離群體，對F1、F2分離群體以及F2:3的表型分析發(fā)現(xiàn)，ygl所表現(xiàn)出的黃綠葉色是由一對隱性核基因控制的質(zhì)量性狀。進一步利用上述F2群體，通過基于SSR的BSA法將該基因定位在大麥3H染色體上12.7 cM的區(qū)間內(nèi)。本課題組前期所定位的大麥階段性白化調(diào)控基因HvSGRA位于大麥染色體2H的末端，通過測序分析發(fā)現(xiàn)FLN1基因翻譯的提前終止可能是導致該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因[15]。Wang等則將調(diào)控大麥高溫誘導的黃化的基因定位在4H染色體上[22]。因此，本研究所報道的黃綠葉色調(diào)控基因HvGYL不同于以上所報道的大麥葉色調(diào)控基因。李志勇[14]也在大麥3H染色體上檢測到一個調(diào)控大麥黃化葉色的基因ylm-1，至于該基因與本研究所定位的HvGYL是否為同一個基因，還需要進一步驗證。

本研究進一步利用已公布的大麥基因組序列，對HvGYL連鎖的分子標記進行分析發(fā)現(xiàn)，它們位于大麥染色體3H上約1.3 cM的區(qū)間內(nèi)。但是對這些標記所處的Morex_contig序列進行分析發(fā)現(xiàn)，它們不包含任何功能基因。一方面可能是由于本研究中所用作圖群體較小，而且分子標記類型為SSR，導致未能篩選到與基因緊密連鎖的分子標記。另一方面，雖然從這4個分子標記在大麥基因組上的位置來看，它們間的距離僅1.3 cM，而在黃綠單株中與HvYGL共分離的三個標記Bmac0209、EBmac0871和Bmag603僅相距0.1 cM，但是，由于大麥基因組龐大且包含大量重復區(qū)域，這0.1 cM的遺傳距離中除了表1中的5條Morex_contig外，還可能包含多條Morex_contig。因此，在接下來的研究中，將通過擴大群體、加密圖譜以及高通量測序等策略進行HvYGL基因的精細定位和圖位克隆，這有助于綜合闡明大麥黃綠葉色形成的分子機理，為將其應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。