何繼才，楊榮琴，彭睿

(1. 涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院眼科，四川 涼山 615000；2. 四川大學華西醫(yī)院眼科，成都 610000)

脈絡膜黑色素瘤是成年人最常見的眼內惡性腫瘤[1]。約50%的脈絡膜黑色素瘤患者發(fā)生會發(fā)生轉移，而目前幾乎沒有任何有效的治療方法[2]。在發(fā)現腫瘤轉移后，患者的生存時間一般少于6個月[3]。

GNAQ和GNA11基因編碼Gαq蛋白，其參與調節(jié)G蛋白偶聯受體和下游的效應器[4]。研究[4]表明：原癌基因GNAQ和GNA11的突變率在白種人中約為80%。這2個基因的突變會導致絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激酶通路上調，很可能是脈絡膜黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素[5]。然而最近在中國人群中的研究[6]發(fā)現：只有約30%的患者有這2個基因的突變。提示基因突變及其在腫瘤發(fā)生中的作用可能隨人種不同而不同。本研究檢測分析了中國四川地區(qū)脈絡膜黑色素瘤患者的GNAQ和GNA11基因突變情況，旨在明確這兩個基因在該地區(qū)患者中的突變率。

1 對象與方法

1.1 對象

收集2011年1月至2016年1月四川大學華西醫(yī)院以及四川省涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院的22例脈絡黑色素瘤患者。納入標準：年齡性別不限，明確的組織病理學診斷，患者自愿參加本項研究。排除標準：不符合入選標準者；已經或正在接受脈絡膜黑色素瘤放射以及藥物治療的患者。診斷依據包括眼底檢查、B超檢查以及組織病理檢查。臨床檢查主要包括患者年齡、性別、腫瘤厚度、最大基底直徑、組織細胞類型、是否侵犯睫狀體、是否侵犯視神經、是否發(fā)生轉移。隨訪時間不少于3年。本研究嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有臨床與實驗室檢查均取得患者的知情同意，并經四川大學華西醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 DNA 提取及測序

眼球摘除后， 常規(guī)進行甲醛固定， 石蠟包埋。 獲得石蠟切片后， 通過D N A 提取試劑盒(QIAamp DNA Mini KIT，德國Qiagen 公司)對腫瘤組織進行DNA提取。Primer 5.0 軟件設計GNAQ和GNA11的4號和5號外顯子的引物，引物由上海生工生物公司合成。引物序列：GNAQ exon5上游引物為5'-GACTTGGATGATCATCGTCATT-3'，下游引物為5'-AAGAAAGCAAAGAAGTAAGTTCAC-3'；GNAQ exon4上游引物為5'-TGTCCTTCCC-T T T C C G T A G A - 3'，下游引物為5'-TGGGAAATAGG-TTTCATGGACT-3'；G N A 1 1 e x o n 5上游引物為5-AGCGTCCTTGCCCGTTCTA-3'，下游引物為5'-AGGGCCCACCTCGTTGTC-3'；G N A 1 1 e x o n 4 上 游 引 物 為5'-GCTGGTTTGGGTGCTGTGT-3'，下游引物為5'-GGCAAATGAGCCTCTCAGTGT-3'。通過PCR反應擴增目標基因，擴增的PCR產物通過ABI PRISM 3.0 Genetic analyzer(ABI，上海生工生物公司)測序。測序結果通過DNAstar軟件分析。

2 結果

2.1 臨床結果

本研究對22位脈絡膜黑色素瘤患者行眼球摘除術。患者年齡為(42.1±14.8)歲，男女比例為12/10(表1)?；颊呔鶠閱窝郯l(fā)病。在隨訪期間，7名患者發(fā)現了腫瘤轉移，其中5名患者為肝轉移，2名患者為多器官轉移。這7名患者都因腫瘤轉移發(fā)生死亡，術后存活時間為(424.1±69.33) d。其余未發(fā)生腫瘤轉移的患者的隨訪時間均大于3年。

表1 脈絡膜黑色素瘤患者的臨床及病理情況Table 1 Clinicopathological data of uveal melanoma patients

2.2 基因檢測結果

對GNAQ和GNA11基因的4號、5號外顯子進行測序。總突變率分別為45.46%，27.28%；其中，GNAQ基因發(fā)生Q209P突變的突變率為31.82%，發(fā)生Q209L的突變率為13.63%(表2)。沒有患者同時發(fā)生GNAQ和GNA11基因突變(圖1)。

表2 基因突變分布Table 2 Proportion of each mutation type

圖1 基因突變位點Figure 1 Mutation sites

3 討論

在本研究中，脈絡膜黑色素瘤發(fā)生GNAQ和GNA11基因突變率分別為45.46%和27.28%，總突變率為72.74%。Van Raamsdonk等[4]報道：在高加索人群中，83%的脈絡膜黑色素瘤中檢測到GNAQ或GNA11突變。本研究結果與之相近。然而，Xu等[6]報道：在中國脈絡膜黑色素瘤患者中，GNAQ或GNA11突變率僅為38%(GNAQ：18%；GNA11：20%)。推測其原因如下：1)本研究樣本量太小，可能會造成統(tǒng)計誤差；2)腫瘤組織長期保存中發(fā)生DNA降解，導致測序不準確；3)中國北方人和南方人或者少數民族患者之間可能存在基因差異。由于本研究醫(yī)院所屬地區(qū)脈絡膜黑色素瘤患者較少，且不易隨訪，因此樣本確實有限。為減小測序誤差，所有PCR產物都測序2次，若結果不一致再加測。

脈絡膜黑色素瘤的突變負擔小于大部分腫瘤，與兒童腫瘤的突變負擔相似[7]。而GNAQ和GNA11突變一直被認為是在腫瘤早期發(fā)生的突變，并被認為在腫瘤的發(fā)生中起重要作用[8-11]。在Van Raamsdonk等[4,12]的報道中，大多數GNAQ和GNA11突變都發(fā)生在209密碼子，少數發(fā)生在183密碼子。在本研究中，GNAQ和GNA11突變都發(fā)生在209密碼子。另外筆者團隊[6]也未發(fā)現4號外顯子突變，這與之前關于中國人群的報道相符。

綜上，GNAQ和GNA11基因在四川地區(qū)脈絡膜黑色素瘤患者中的突變率較高。