黃大野 萬中義 朱志剛 姚經(jīng)武 楊妮娜 曹春霞 張亞妮 劉曉艷 饒犇

摘要茶輪斑病是茶樹的一種重要葉部病害，防治該病害通常使用化學(xué)殺菌劑?；瘜W(xué)殺菌劑的頻繁使用易使病菌產(chǎn)生抗藥性并造成農(nóng)藥殘留，因此，需要更為安全有效的防治方法。諾沃霉素A是由植生鏈霉菌HEBRC-20821分泌的一種新型32元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物。本研究探索了諾沃霉素A在離體條件下對擬盤多毛孢的抑菌活性及對感染茶輪斑病離體葉片的防治效果。諾沃霉素A在離體條件下對茶擬盤多毛孢的菌絲生長具有強(qiáng)烈抑制作用，抑制中濃度為2.11ug/mL。當(dāng)用5ug/mL諾沃霉素A處理茵絲后，在顯微鏡下可見茶擬盤多毛孢茵絲形態(tài)發(fā)生異常。在離體葉片條件下，諾沃霉素A在75和150ug/mL濃度下對茶輪斑病防效分別為68.29%和100%。在2000和4000ug/mL濃度下諾沃霉素A對茶葉沒有產(chǎn)生藥害。諾沃霉素A有望成為防治茶輪斑病的一種新型藥劑。

關(guān)鍵詞茶輪斑病;大環(huán)內(nèi)酯化合物;諾沃霉素A;防效

中圖分類號：S435.711文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B DOI：10.16688/j.zwbh.2018340

茶樹作為全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，尤其是東亞和南亞等發(fā)展中國家。中國是茶樹的原產(chǎn)地，是世界第一大產(chǎn)茶國，至2013年種植面積已達(dá)258萬hm²，產(chǎn)量達(dá)192萬t，分別占世界總量的47%和35%，在世界茶葉行業(yè)中占有重要地位。茶葉種植對我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)村脫貧起到了重要作用。

由擬盤多毛孢Pestalotio psis spp.引起的茶輪斑病是茶樹的一種重要葉部病害，在全世界茶葉種植區(qū)均有報道，在我國茶區(qū)也普遍發(fā)生，病原菌主要危害成葉和老葉。茶樹為多葉植物，葉片的任何損傷都會影響茶葉的產(chǎn)量和質(zhì)量。隨著機(jī)械采摘在生產(chǎn)中的普遍應(yīng)用，該病害的危害更為嚴(yán)重，因?yàn)闄C(jī)械采摘容易造成樹勢減弱并提供該病原菌侵染的位點(diǎn)。防治該病害主要依靠化學(xué)殺菌劑，在機(jī)械采摘后需要立即噴施藥劑來控制病害發(fā)生?；瘜W(xué)殺菌劑的頻繁使用造成了輪斑病菌抗藥性的產(chǎn)生。同時，化學(xué)殺菌劑的使用會造成農(nóng)藥殘留，對食品安全和茶葉出口造成影響?；谏鲜鲈颍毙韪鼮榘踩行У臍⒕鷦┖头乐畏椒?。

諾沃霉素A和B是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和鑒定的一種全新結(jié)構(gòu)的32元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物（圖1～2）。其生產(chǎn)菌為植生鏈霉菌Streptomyces phytohabitans，菌種代號為HBER&20821，大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入試驗(yàn)表明未造成明顯病理改變，毒性為微毒級。離體抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，諾沃霉素A和B對植物病原真菌抑菌效果相當(dāng)。故本試驗(yàn)選取諾沃霉素A進(jìn)行對茶輪斑病防治效果研究，以期為諾沃霉素在防治茶輪斑病中的應(yīng)用和推廣奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：茶擬盤多毛孢Pestalotiopsis theae由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存，為多菌靈敏感菌株。

供試藥物：95%諾沃霉素A原藥，制備方法同參考文獻(xiàn)[9]，98%多菌靈原藥，安徽廣信農(nóng)化股份有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1諾沃霉素A對茶擬盤多毛孢離體抑菌活性

將茶擬盤多毛孢P.theae從斜面活化后轉(zhuǎn)入PDA平板28℃培養(yǎng)7d備用。將諾沃霉素A原藥加入母液體積1%的N，N二甲基甲酰胺（DMF）溶解，隨即加入無菌水配制成濃度為100ug/ml母液備用。多菌靈母液的配制方法和濃度同諾沃霉素A。采用菌絲生長速率法，諾沃霉素A在PDA中的濃度分別為5、2.5、1.25、0.625和0.3125ug/mL。多菌靈稀釋至0.5、0.25、0.125、0.0625和0.03125ug/mL。每個梯度濃度3次重復(fù)，以加入含1%DMF無菌水作為對照。隨后用4mm打孔器打取菌餅并接入PDA平板中央。28℃黑暗培養(yǎng)6d，用十字交叉法測量每個培養(yǎng)皿內(nèi)菌落直徑，用DPS軟件求出諾沃霉素A和多菌靈對茶擬盤多毛孢菌絲生長的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和抑制中濃度ECso。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

分別從含5ug/mL諾沃霉素A平板和對照平板中挑取少許菌絲于載玻片，在40倍光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX21，Tokyo，Japan）下觀察處理和對照菌絲形態(tài)。

1.2.2諾沃霉素A對離體葉片上茶輪斑病防治效果

將茶擬盤多毛孢P.theae從保存的斜面活化，轉(zhuǎn)移至PDA平板，28℃黑暗培養(yǎng)6d備用。采集大小一致成熟茶樹葉片（‘中茶103），按照1.2.1的方法將諾沃霉素A配制成150ug/mL和75ug/mL，多菌靈配制成25ug/mL和12.5ug/mL。使用電動噴霧器將各處理藥劑噴施于茶葉葉片背部至飽和，對照噴施清水。待藥液晾干后采用針刺接種法接種茶擬盤多毛孢菌餅，隨后28℃保濕培養(yǎng)。12d后統(tǒng)計各處理和對照病斑直徑，并計算防效。試驗(yàn)設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)15片茶葉葉片。

防效=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。

1.2.3諾沃霉素A對茶葉安全性研究

按照1.2.1方法將諾沃霉素A配制成4000ug/mL和2000ug/mL水溶液，均勻噴施于茶葉葉片正面和背面，對照噴施清水，每處理20片葉，觀察對照和處理茶葉葉片變化情況。

1.3數(shù)據(jù)分析

使用SAS 9.1.3進(jìn)行差異顯著性分析，在0.05水平下進(jìn)行單因素差異顯著性分析。

3討論

茶葉作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在一部分地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和產(chǎn)業(yè)扶貧中起到關(guān)鍵作用。隨著茶葉種植面積的擴(kuò)大，機(jī)械采摘被廣泛使用。研究表明雨水飛濺和機(jī)械采摘是茶輪斑病傳播的兩種主要途徑，病原菌隨著機(jī)械采摘傷口快速傳播，危害成葉和老葉。隨著病害的不斷傳播和發(fā)展，對樹勢造成了一定影響，從而影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。使用多菌靈和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在機(jī)械采摘后立即噴灑能有效防止茶輪斑病的傳播和發(fā)展，但是殺菌劑的頻繁使用也造成了病菌抗藥性的產(chǎn)生，并且隨機(jī)械采摘造成抗性菌株的傳播，同時葉片和土壤的農(nóng)藥殘留對茶葉的出口也會造成潛在威脅。

諾沃霉素A是一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，前期大鼠毒性試驗(yàn)研究表明其毒性為微毒級，并對多種植物病原真菌具有一定的抑菌活性，顯示出良好的應(yīng)用前景。本研究中，諾沃霉素A對茶輪斑病EG。為2.11ug/mL，離體葉片條件下150ug/mL防效達(dá)到100%，顯示出良好的防控效果。同時其對菌絲造成扭曲、膨大和變形，表明諾沃霉素A可能通過影響菌絲形態(tài)來抑制病菌生長。本研究選取的茶擬盤多毛孢為多菌靈敏感菌株，諾沃霉素A對多菌靈及其他類型殺菌劑如甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的交互抗藥性需要進(jìn)一步研究，為其進(jìn)一步的田問應(yīng)用和推廣奠定基礎(chǔ)。同為大環(huán)內(nèi)酯類化合物的納他霉素由于不易產(chǎn)生抗藥性，無致癌、致畸形、致突變和過敏性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品防腐和水果保鮮，諾沃霉素在食品和水果方面的應(yīng)用也值得進(jìn)一步的研究。