李麗 張樹武 陳大為 徐秉良

蘋果樹腐爛病是目前危害我國蘋果產(chǎn)業(yè)最主要的病害之一，截至2008年，全國范圍內(nèi)蘋果樹腐爛病的總體病株率為52.7%，部分地區(qū)發(fā)病率高達85%以上。薛應鈺等對甘肅省12個縣、區(qū)74個不同樹齡蘋果園調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病在甘肅省發(fā)生十分普遍，其發(fā)病率平均達到41.09%，嚴重影響了甘肅省蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，其中平?jīng)?、天水、白銀、隴南和慶陽等老果園發(fā)病率高，尤其樹勢較差果園發(fā)病率高達60%。引起該病害的病原為黑腐皮殼菌Valsa mali，該菌可侵染蘋果樹主枝、主干和果實等多個部位，導致樹皮腐爛、樹勢衰弱、蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴重時引起主干、大枝及整樹枯死，甚至全園被毀。

目前，生產(chǎn)中蘋果樹腐爛病的防治主要采取傳統(tǒng)的化學防治，但是隨著人們生活水平的不斷提高，人們對環(huán)境污染和食品安全等問題越來越重視。長期使用化學農(nóng)藥不僅會破壞果園的生態(tài)環(huán)境，而且影響果實品質(zhì)，甚至可能引起食品安全問題。礦物源農(nóng)藥是一類由天然礦物油或無機化合物通過加工制成的殺菌劑、殺蟲劑、除草劑和殺鼠劑。早期的礦物源農(nóng)藥主要包括銅制劑、硫化物、砷化物、氟化物、磷化物和礦物油等，但隨著廣譜和高效的有機化學農(nóng)藥的出現(xiàn)與發(fā)展，某些具有毒性、藥害或者具有殘留毒性的礦物源農(nóng)藥逐漸被淘汰停止使用，如砷酸鉛、磷化鋅和砷酸鈣等。目前使用的礦物源農(nóng)藥主要是一些對人畜毒性較低，對有益生物比較安全的藥劑，如銅制劑、硫制劑和礦物油乳劑等，其在病害防治中具有獨特的作用。同時，與傳統(tǒng)的化學農(nóng)藥相比較，礦物源農(nóng)藥具有殺菌范圍廣，對常見的真菌和細菌性病害有較好的防治作用，不易誘導病菌產(chǎn)生抗藥性、安全性強、且耐雨水沖刷、持效期長的特點，多年來被廣泛用于植物病害防治。例如，99%礦物油乳油（綠穎）可防治黃瓜白粉病和草莓白粉病，對蚜蟲等昆蟲生長發(fā)育具有抑制作用，對黃瓜和草莓安全。黃腐酸能夠抑制蘋果樹腐爛病菌菌絲的生長，且濃度越大抑制效果越顯著。77%氫氧化銅干懸浮劑、37.5%氫氧化銅懸浮劑和波爾多液對加工番茄細菌性斑點病具有較好的防治效果。有關(guān)利用礦物源農(nóng)藥防治蘋果樹腐爛病菌方面的研究較少。因此，尋找能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學農(nóng)藥且對蘋果樹腐爛病具有高效、低毒的礦物源農(nóng)藥已成為目前的形勢所需。

本研究對5種礦物源農(nóng)藥對蘋果樹腐爛病原菌室內(nèi)抑菌活性以及離體枝條防治效果進行測定，以期篩選獲得對蘋果樹腐爛病防效較佳的礦物源農(nóng)藥和施用濃度，研究結(jié)果可為蘋果樹腐爛病生物防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試病原菌

供試蘋果樹腐爛病菌Valsa mali由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病原學實驗室提供。

1.1.2供試藥劑

供試藥劑信息見表1。

1.1.3供試枝條

采集于甘肅省蘭州市西固區(qū)崔家崖村蘋果園，品種為‘新紅星，5年樹齡。

1.2試驗方法

1.2.1蘋果樹腐爛病菌活化及其培養(yǎng)

挑取保存于4℃冰箱中的蘋果樹腐爛病菌，接種于PDA培養(yǎng)基中央進行菌種活化，并置于25℃、L∥D=16h∥8h的恒溫箱培養(yǎng)5d，然后重復上述步驟進行二次純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2不同礦物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌的室內(nèi)毒力測定

藥劑配制：將77%氫氧化銅WP、80%波爾多液WP、77%硫酸銅鈣WP、86.2%氧化亞銅WG和70%腐植酸鈉GR，按照推薦濃度經(jīng)無菌水稀釋溶解后分別加入未凝固的70mL PDA培養(yǎng)基中充分搖勻，并經(jīng)稀釋后配制為不同質(zhì)量濃度的供試藥劑（表2）。

毒力測定：采用菌絲生長速率法。將不同質(zhì)量濃度藥劑分別配制成含藥平板，并接種蘋果樹腐爛病菌菌餅（d=0.5cm）于含藥培養(yǎng)基中央，以加入無菌水的培養(yǎng)基為空白對照，每個處理和對照3次重復。然后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱里L∥D=16h∥8h下培養(yǎng)，5d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率和有效中質(zhì)量濃度EC50。

菌絲生長抑制率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5）]×100%，

將抑制率轉(zhuǎn)換成幾率值，質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成質(zhì)量濃度對數(shù)，以各藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)值為x，并以抑菌率的幾率值為y，計算供試藥劑有效中質(zhì)量濃度EC50，比較各藥劑的毒力效果。

1.2.3不同礦物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用

采用玻片孢子萌發(fā)法。將5種供試藥劑經(jīng)無菌水按半倍稀釋法配制成不同濃度的藥液，吸取1mL藥液加入滅菌后稍冷卻的9mL PDA培養(yǎng)基中充分搖勻，制成含藥平板。待冷卻后在含藥平板上滴入20uL分生孢子懸浮液，涂抹均勻后利用打孑L器（d=10mm）打取菌餅移于載玻片上，以加無菌水的PDA作空白對照，每個處理和對照3次重復。在25℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)36h后統(tǒng)計分生孢子萌發(fā)情況，每個處理觀察100個分生孢子（萌發(fā)標準為芽管超過分生孢子直徑一半），計算分生孢子萌發(fā)率和抑制率。

萌發(fā)率=萌發(fā)的孢子總數(shù)/孢子總數(shù)×100%;

抑制率=（對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對照孢子萌發(fā)率×100%。

1.2.4不同礦物源藥劑對離體枝條防效測定

參照翟慧者等和臧睿等的離體枝條接種方法。截取20cm長的離體枝條，經(jīng)自來水沖洗干凈后用75%乙醇消毒15s，再經(jīng)無菌水沖洗3次，置于超凈工作臺晾干后用帶帽釘子的頂帽進行燙傷。根據(jù)毒力測定結(jié)果，選擇抑制效果最好的濃度配制藥液，將藥液涂抹于傷口，并待晾干后將培養(yǎng)3d的蘋果樹腐爛病菌菌餅接種于傷口，每個處理接種3個枝條，每個枝條2個接種點，共計6個接種點，并以先涂抹無菌水后接種病原菌作為對照。25℃保濕培養(yǎng)10d后，采用十字交叉法測量病疤長度，計算病疤面積。

病疤面積（cm²）=1/4×π×長徑×短徑;

抑菌率=（對照病疤面積-處理病疤面積）/對照病疤面積×100%。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2007整理，采用DPS 7.5統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析及其差異顯著性檢驗（Duncan氏新復極差法，P<0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1不同礦物源農(nóng)藥對蘋果樹腐爛病菌毒力效果

結(jié)果表明，供試礦物源農(nóng)藥對蘋果樹腐爛病菌菌落生長均具有顯著的抑制作用，其中70%腐植酸鈉GR對蘋果樹腐爛病菌菌落生長的抑制率最高。當77%氫氧化銅WP、80%波爾多液WP、77%硫酸銅鈣WP、86.2%氧化亞銅WG和70%腐植酸鈉GR為最高質(zhì)量濃度257、400、385、172、5ug/mL時，接種培養(yǎng)第5天時其抑菌率分別為97.67%、98.94%、98.43%、100.00%和97.55%;當分別為最低質(zhì)量濃度64、133、77、66、1mg/mL時，其抑菌率分另0為48.45%、41.44%、45.82%、46.93%和32.76%。同時，隨著不同藥劑濃度的升高，其抑菌活性均呈逐漸增加趨勢，接種培養(yǎng)第5天時其EC50分別為71.15、159.60、95.73、77.40和2.60ug/mL（表3）。

2.2不同礦物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用

結(jié)果表明，5種藥劑中70%腐植酸鈉GR對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用最強，處理36h后，其抑菌率為92.62%，EC50為1.38ug/mL;86.2%氧化亞銅WG和77%氫氧化銅WP次之，EC50分別為65.48、69.30ug/mE;77%硫酸銅鈣WP的抑制作用較差，EC50為102.98ug/mL;80%波爾多液WP對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用最差，EG50為145.41ug/mL（表4）。

2.3不同礦物源藥劑對接種病原菌的離體枝條防治效果

與對照相比，5種礦物源藥劑對接種蘋果樹腐爛病菌的離體枝條具有不同程度的防治效果，其中70%腐植酸鈉GR的防治效果顯著高于其他藥劑，其病疤擴展面積最小，為2.08cm²，且與對照差異顯著;86.2%氧化亞銅WG對接種病原菌的離體枝條保護作用次之，病疤面積為2.95cm²;80%波爾多液WP和77%硫酸銅鈣WP相比較低，病疤面積分別為7.16和6.74cm²;77%氫氧化銅WP在接菌后對離體枝條的保護作用最弱，病疤擴展面積最大，病疤面積為8.80cm²（圖1和表5）。

3結(jié)論與討論

蘋果樹腐爛病長期以來使用化學農(nóng)藥進行防治，但由于抗藥性等問題的產(chǎn)生，該病的防治出現(xiàn)了較大的困難，因此高效低毒的礦物源制劑產(chǎn)品成為蘋果生產(chǎn)發(fā)展的迫切需要。本試驗對5種低毒的礦物源農(nóng)藥殺菌劑（77%氫氧化銅WP、80%波爾多液WP、77%硫酸銅鈣WP、86.2%氧化亞銅WG、70%腐植酸鈉GR）對蘋果樹腐爛病菌菌落生長、分生孢子萌發(fā)及其離體枝條防治效果等方面進行了測定。結(jié)果表明，供試的5種礦物源藥劑對該病菌菌落生長均具有較強的抑制作用，其中，70%腐植酸鈉GR的抑菌效果最好，接種培養(yǎng)第5天時其最高抑菌率為97.55%，其EC50為2.60ug/mL。同時，隨著不同藥劑濃度的升高，其抑菌活性均呈逐漸增加的趨勢。韓盛等在對番茄細菌性斑點病的試驗中也對氫氧化銅和波爾多液等礦物源農(nóng)藥進行了相關(guān)研究，表明其對番茄細菌性斑點病具有很好的防治效果。

供試5種礦物源藥劑對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用測定結(jié)果表明，5種藥劑中70%腐植酸鈉GR對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用最強，處理36h后，其最高抑菌率為96.33%，ECso為1.38ug/mL。郭曉峰等通過測定5種化學藥劑對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用得出20g/L海藻酸AS對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)抑制效果最差，EG50為15.3820ug/mL。而本試驗篩選出的具有高效低毒、低殘留、活性高，作用機理獨特，對環(huán)境友好，還具有加工劑型多和不污染農(nóng)產(chǎn)品等優(yōu)點的70%腐植酸鈉GR對蘋果樹腐爛病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用僅次于化學農(nóng)藥海藻酸鈉的效果。

離體枝條防效測定表明，5種礦物源藥劑對接種蘋果樹腐爛病菌的離體枝條具有不同程度的防治效果，其中70%腐植酸鈉GR對接種病原菌的離體枝條的防治效果顯著高于其他藥劑，其病疤擴展面積最小，為2.08cm²，且與對照相比差異顯著，77%氫氧化銅WP在接菌后對離體枝條的保護作用最弱，病疤擴展面積最大，病疤面積為8.80cm²。翟慧者等曾測定10種化學殺菌劑對離體枝條蘋果樹腐爛病的治療作用，其中3.315%甲硫·萘乙酸涂抹劑和6.5%菌毒清AS的防效均為87.5%，而本試驗所篩選出的70%腐植酸鈉GR對該病的防效也達到了86.83%，與化學農(nóng)藥3.315%甲硫·萘乙酸涂抹劑和6.5%菌毒清AS的防治效果相差不大。本試驗結(jié)果表明，70%腐植酸鈉GR對蘋果樹腐爛病菌的抑制作用最佳，對離體枝條的保護作用也最好，可作為主要推廣的防治藥劑。同時，采用平板培養(yǎng)法進行的殺菌劑室內(nèi)抑菌效果僅代表藥劑與病原菌直接接觸時藥劑對病原菌菌絲生長的抑制作用，而藥劑在田問對病害的防治效果不僅與藥劑對病原菌菌絲抑制有關(guān)，還與對孢子產(chǎn)生、孢子萌發(fā)、藥劑的特效性，施藥技術(shù)，施藥時期等因素有關(guān)。因此，在后續(xù)研究中，還需要與田問小區(qū)藥效試驗相結(jié)合，為有效防治蘋果樹腐爛病，進行無公害生產(chǎn)提供科學依據(jù)。