樊榮輝 黃敏玲 鐘淮欽 葉秀仙 羅遠(yuǎn)華

摘要小蒼蘭花葉病毒Freesia mosaic virus（FreMV）是侵染蘭花的主要病毒，嚴(yán)重影響其觀賞價(jià)值。本研究根據(jù)FreMV的外殼蛋白基因序列設(shè)計(jì)了一組特異性引物，經(jīng)過(guò)一系列條件優(yōu)化，建立了該病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法。結(jié)果顯示設(shè)計(jì)引物能特異擴(kuò)增FreMV，與其他4種病毒（菜豆黃花葉病毒Bean yellow mosaic virus、黃瓜花葉病毒Cucumbermosaic virus、建蘭花葉病毒Cymbidium mosaic virus和齒蘭環(huán)斑病毒Odontoglossum ringspot virus）不發(fā)生反應(yīng);該方法靈敏度為RT-PCR的10倍。田間檢測(cè)20份樣品中，RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致，檢出率為60%。在產(chǎn)物中加入熒光染料SYBR GreenI直接用肉眼觀察就可判斷樣品是否感染FreMV，可省去電泳分析的時(shí)間。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞小蒼蘭花葉病毒;RT-LAMP;檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2018164

小蒼蘭Freesia hybrida為鳶尾科香雪蘭屬花卉，因其花色艷麗、高雅芳香、花序柔美搖曳，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。小蒼蘭花葉病毒Freesia mosaic virus（FreMV）是危害小蒼蘭最嚴(yán)重、最常見(jiàn)的病毒之一，造成花色雜，植物生長(zhǎng)不良，觀賞價(jià)值降低，甚至造成種球退化，失去再利用的價(jià)值，已經(jīng)成為小蒼蘭大規(guī)模生產(chǎn)的主要限制因素。目前，小蒼蘭病毒尚無(wú)特別有效的化學(xué)防治方法，培育和栽培無(wú)病毒苗成為防治小蒼蘭病毒的根本措施，在無(wú)毒苗培育過(guò)程中，經(jīng)常需要對(duì)母本及脫毒苗進(jìn)行病毒檢測(cè)，建立快速、靈敏的檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重要。

目前，病毒檢測(cè)主要有酶聯(lián)免疫法和PCR檢測(cè)法等方法。酶聯(lián)免疫法是目前較常用的一種方法，但其存在靈敏度不高、假陽(yáng)性等缺點(diǎn)。近幾年，靈敏度較高的PCR技術(shù)已成為常規(guī)的病毒檢測(cè)手段，但其對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求比較高，不利于向基層檢驗(yàn)部門(mén)推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（100p-mediated isothermal amplification，LAMP）采用6區(qū)域4條特異引物，在DNA鏈置換聚合酶（BstDNA polymerase）作用下，對(duì)靶基因進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)結(jié)果肉眼可判等特點(diǎn)，擺脫了對(duì)昂貴儀器的依賴(lài)，能滿(mǎn)足基層的檢測(cè)需要。本研究以FreMV的外殼蛋白（CP）基因?yàn)榘袠?biāo)基因，設(shè)計(jì)4條引物，建立了可特異檢測(cè)該病毒的RT-LAMP檢測(cè)方法。

3討論

小蒼蘭由于香氣濃郁，花色種類(lèi)豐富，顏色鮮艷，備受人們喜愛(ài)，是重要的切花及盆花。但當(dāng)病毒病積累時(shí)會(huì)造成種球退化，限制小蒼蘭大規(guī)模生產(chǎn)。對(duì)種球進(jìn)行復(fù)壯及培育無(wú)病毒苗是防止病毒病的重要措施，因此，建立快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法，及時(shí)檢測(cè)出帶毒種球或脫毒苗，對(duì)阻止病毒病的傳播，從根源上預(yù)防病毒病具有重要意義。本試驗(yàn)針對(duì)小蒼蘭花葉病毒建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有擴(kuò)增快速、高效、特異性好、操作簡(jiǎn)便、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，可以針對(duì)性地對(duì)小蒼蘭復(fù)壯種球和脫毒種苗進(jìn)行檢測(cè)，從種源遏制病毒病的發(fā)生。本研究技術(shù)具有較高的應(yīng)用價(jià)值，在基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中有很好的應(yīng)用前景。

目前，常用的病毒檢測(cè)方法是PCR和酶聯(lián)免疫技術(shù)，這些方法均具有較好的檢測(cè)效果，但也存在耗時(shí)長(zhǎng)，成本高的特點(diǎn)，不太適用于基層檢測(cè)。與常規(guī)PCR方法相比，本研究建立的LAMP技術(shù)保持了PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，且不需特殊儀器，成本低，由于不需要熱循環(huán)，整個(gè)過(guò)程可以在60min內(nèi)完成，更加省時(shí)。若在PCR產(chǎn)物中加入SYBR Green工可目測(cè)檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)更快捷方便，適合在基層應(yīng)用。

LAMP技術(shù)使用4～6條引物，會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)反應(yīng)的特異性。引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，也較復(fù)雜和困難，除要遵循一般引物設(shè)計(jì)原則外，還有LAMP引物設(shè)計(jì)自身要注意的事項(xiàng)。對(duì)于GC含量較高序列或較短序列其引物設(shè)計(jì)更加困難。本試驗(yàn)針對(duì)小蒼蘭花葉病毒CP基因設(shè)計(jì)引物，經(jīng)驗(yàn)證該引物的特異性良好。同時(shí)，本試驗(yàn)建立的LAMP方法檢測(cè)FreMV具有較高的靈敏度，是RT-PCR的10倍，在病毒含量很少的脫毒苗的快速檢測(cè)方面有一定的優(yōu)勢(shì)。