何倩倩 劉雨欣 方馨玫 朱天輝 譙天敏 韓珊 李姝江

摘要本文利用病原毒素同源異質(zhì)的特點(diǎn)誘導(dǎo)雜交竹抗病潛力，篩選出抗梢枯病的最佳誘導(dǎo)因子并排除其對(duì)病原菌的直接作用，經(jīng)瓊脂玻片萌發(fā)法測(cè)定3種誘導(dǎo)因子（溫度滅活毒素、蛋白酶降解毒素和細(xì)胞壁成分）對(duì)雜交竹梢枯病病原茵暗孢節(jié)菱孢茵孢子萌發(fā)的抑制作用，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)60°C滅活毒素濃度為40ug/mL處理的孢子萌發(fā)效果最為理想。通過(guò)最佳誘導(dǎo)因子對(duì)雜交竹不同品種誘導(dǎo)持續(xù)期進(jìn)行測(cè)定，采用針刺法先接種誘導(dǎo)因子后挑戰(zhàn)接種病原菌，1～40d內(nèi)觀察抗感品種對(duì)誘導(dǎo)因子響應(yīng)的差異，癥狀上雜交竹8#的感病程度重于3#和6#，40d時(shí)葉片和枝干變黃干枯，病情指數(shù)結(jié)果表明，3個(gè)雜交竹品種接種誘導(dǎo)因子后感病程度降低，誘抗效果顯示雜交竹6#的誘抗指數(shù)高于3#和8#。以上結(jié)果證明誘導(dǎo)因子使不同雜交竹品種均產(chǎn)生了一定的抗性且抗性越強(qiáng)的品種誘導(dǎo)抗性越好。

關(guān)鍵詞雜交竹梢枯病;暗孢節(jié)菱孢菌;誘導(dǎo)因子;抗病性;孢子萌發(fā)

中圖分類號(hào)：S763.1，S 436.8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2018053

激發(fā)子可誘導(dǎo)植物自身抗性，安全性好且抗性較為穩(wěn)定，持效期長(zhǎng)，能對(duì)多種真菌、細(xì)菌和病毒病害起到抵抗作用。生物源誘導(dǎo)因子是來(lái)源于寄主植物或由病原物與寄主植物互作后產(chǎn)生的能激發(fā)寄主植物防衛(wèi)反應(yīng)的物質(zhì)，趙繼紅等按生物化學(xué)結(jié)構(gòu)不同將其主要分為寡聚糖、蛋白類激發(fā)子、糖蛋白。Ye等研究發(fā)現(xiàn)，先接種TMV或煙草霜霉病菌Peronos pora tabacina均可提高煙草對(duì)這兩種病的抗性。從真菌細(xì)胞壁、微生物代謝產(chǎn)物以及植物細(xì)胞壁等處分離得到的激發(fā)子（elicitor）也能與活菌一樣誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)。趙繼紅等通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)及對(duì)植物幼苗活體生物測(cè)定證明了灰霉菌菌絲體提取物的防病效果可達(dá)55.6%。胡景江等研究了楊樹潰瘍病菌細(xì)胞壁裂解物一低聚糖對(duì)楊樹細(xì)胞相關(guān)抗病指標(biāo)的誘導(dǎo)作用。李云鋒等的研究發(fā)現(xiàn)，接種稻瘟菌細(xì)胞壁來(lái)源的糖蛋白稻瘟菌激發(fā)子CSBI能誘導(dǎo)親和性與非親和性互作品種與抗病相關(guān)酶的活性增加。李洪連等報(bào)道，從誘抗菌菌絲細(xì)胞壁中獲取的激發(fā)子，與活的誘抗菌一樣能誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生對(duì)炭疽病的抗病反應(yīng)。因?yàn)樯镌凑T導(dǎo)因子與自然環(huán)境相容性好，因此是研究的熱點(diǎn)。在非生物源誘導(dǎo)因子方面，研究比較多的為水楊酸（SA）及其衍生物、茉莉酸（JA）及其衍生物。郭紅蓮等用不同非生物作為誘抗劑，結(jié)果表明水楊酸的誘抗效果最好。賓金華等用茉莉酸甲酯作為誘抗劑來(lái)處理煙草對(duì)抗炭疽病，明顯提高了幼苗內(nèi)過(guò)氧化氫酶、苯丙氨酸解氨酶等的含量。因此這些物質(zhì)也能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)抗病害的能力。除此之外一些物理因素如冷凍處理、高溫處理以及紫外光照射等都能夠引起植保素的產(chǎn)生和累積，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性。Kubo等利用非生物因素高溫處理作為誘導(dǎo)因子使溫室中黃瓜的抗病能力得到了增強(qiáng)。李寶聚等通過(guò)高溫（40～50℃）預(yù)先對(duì)黃瓜幼苗處理1～2h，不同程度地誘導(dǎo)了黃瓜幼苗對(duì)黑星病Cladosporium cucumerinum的抗性。Dean等發(fā)現(xiàn)通過(guò)機(jī)械損傷、干冰或電磁效果等方法不同程度誘導(dǎo)了煙草對(duì)霜霉病的抗性。因此，誘導(dǎo)抗性在目前眾多植物病害控制中最具有應(yīng)用潛力。

撐×綠雜交竹梢枯病是嚴(yán)重影響雜交竹生長(zhǎng)的重要病害，導(dǎo)致其枯死的病原為暗孢節(jié)菱孢菌Ar-thrinium phaeospermum（Corda）M.B.Ellis。有關(guān)竹類梢枯病的研究較多，而雜交竹梢枯病大多集中于發(fā)病規(guī)律和癥狀、病原菌、培養(yǎng)基篩選等，對(duì)誘導(dǎo)抗病性方面誘導(dǎo)因子的篩選及寄主植物分泌物特性的研究較少。僅李姝江等以雜交竹梢枯病菌一暗孢節(jié)菱孢菌為對(duì)象，對(duì)其毒素致病組分進(jìn)行確定，通過(guò)毒素粗提透析與濃縮以及對(duì)致病毒素進(jìn)行分離、純化和序列分析、致病力測(cè)定等確定了純毒素的基本性質(zhì)。本研究在此純毒素基礎(chǔ)上從溫度滅活毒素、毒素經(jīng)不同蛋白酶降解及細(xì)胞壁成分對(duì)暗孢節(jié)菱孢的抑制作用這三個(gè)方面來(lái)篩選最佳誘導(dǎo)因子，并結(jié)合室外持續(xù)期測(cè)定病情指數(shù)及其誘抗效果，篩選出最佳誘導(dǎo)因子，同時(shí)也能排除滅活毒素對(duì)病原菌的直接影響。

1材料和方法

1.1供試材料

供試雜交竹品種：雜交竹3#（中抗）、雜交竹6#（抗?。㈦s交竹8#（感?。灾灿谒拇ㄞr(nóng)業(yè)大學(xué)溫室大棚。

供試真菌：暗孢節(jié)菱孢菌Arthrinium phaeo-spermum（Corda）M.B.Ellis，分離于雜交竹梢枯病竹，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

該菌株純化毒素由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，將純化后的蛋白毒素用無(wú)菌蒸餾水稀釋成10、20、40、80ug/mL溶液。

1.2主要試劑和儀器

蘇靜安泰SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái);LDZX-40BI立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋;BX51顯微鏡，奧林巴斯株式會(huì)社;BSG-800程控光照培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;DELTA-320pH計(jì)，北京聯(lián)合科力科技有限公司;“U”形玻棒;血球計(jì)數(shù)板;載玻片;葡萄糖;瓊脂。

1.3誘導(dǎo)因子篩選

孢子懸浮液的制作：取25℃培養(yǎng)5～7d的A phaeospermum活化菌株斜面，加入5mL無(wú)菌水，用接種環(huán)將分生孢子刮下，使其懸浮，將菌懸液在旋渦振蕩儀上振蕩10min，轉(zhuǎn)入三角瓶（含玻璃珠）中，置于搖床150r/min振蕩30min，用滅菌脫脂棉（或雙層紗布）過(guò)濾得到孢子懸浮液，適量移入1.5mL離心管中，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.1溫度滅活毒素對(duì)暗孢節(jié)菱孢的抑制作用

采用玻片萌發(fā)法測(cè)定溫度滅活毒素對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用。純毒素分別經(jīng)20、40、60、80、100℃處理15min，而后分別配制毒素終濃度為10、20、40、80ug/mL的病菌孢子懸浮液（孢子濃度數(shù)量級(jí)為10⁷），用1mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8。于無(wú)菌環(huán)境中取潔凈的載玻片，在滅菌并冷卻至50C左右的2%水瓊脂培養(yǎng)基中蘸一下，待凝成薄層后，去掉一面瓊脂培養(yǎng)基，將有瓊脂培養(yǎng)基的一面朝上，平放在培養(yǎng)皿的“U，形玻棒上，再將配制的病菌孢子懸浮液涂抹在培養(yǎng)基上，蓋上蓋玻片和培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿于25～28℃保濕培養(yǎng)，以無(wú)菌水為對(duì)照，分別在5、10和24h后測(cè)定孢子萌發(fā)率，每處理觀測(cè)100～300個(gè)孢子。

1.3.2毒素經(jīng)不同蛋白酶降解后對(duì)暗孢節(jié)菱孢的抑制作用

采用玻片萌發(fā)法測(cè)定毒素經(jīng)蛋白酶降解后對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用。純毒素分別經(jīng)胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶A（羧肽酶B）、蛋白酶K處理20h（最終酶濃度為1mg/mL），然后分別配制毒素終濃度為10、20、40、80ug/mL的病菌孢子懸浮液，用1mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8。按1.3.1方法測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.3.3細(xì)胞壁成分對(duì)暗孢節(jié)菱孢的抑制作用

暗孢節(jié)菱孢菌細(xì)胞壁成分提取：菌種轉(zhuǎn)管活化接種在PDA培養(yǎng)皿中，于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取經(jīng)PDA培養(yǎng)5d后的菌塊;打孔后接種于200mL已滅菌的PD培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)7d的培養(yǎng)液用4層滅菌紗布在超凈臺(tái)中過(guò)濾得到菌絲體，然后用50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）洗滌3次，再懸浮于磷酸鹽緩沖液（含0.5%Triton-100）中，200r/min勻漿3～5rnin，中問(wèn)每隔1min問(wèn)歇1次;隨后4000r/min離心10min，取沉淀用乙醇洗滌，再次對(duì)其進(jìn)行離心并用去離子水洗滌，最后按l g沉淀加10mL蒸餾水的比例將沉淀懸浮于去離子水中，于121℃高溫水解2h，冷卻后11200r/minN心20rain，上清液用0.22um微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液即為細(xì)胞壁成分，低溫保存。

配制細(xì)胞壁成分終濃度為10、20、40、80ug/mL的病菌孢子懸浮液，1mmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8。按1.3.1方法測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.4最佳誘導(dǎo)因子的效果

根據(jù)室內(nèi)試驗(yàn)的篩選結(jié)果，選取最佳誘導(dǎo)因子進(jìn)行誘導(dǎo)抗病性持續(xù)期測(cè)定，比較最佳因子對(duì)不同品種的誘導(dǎo)效果。設(shè)置兩組處理：一組為先接種無(wú)菌水后接種菌懸液處理（a），對(duì)照為先接種誘導(dǎo)因子后接種A phaeospermum菌懸液處理（b）;另一組為先接種最佳誘導(dǎo)因子后再接種無(wú)菌水處理（c），對(duì)照為僅接種無(wú)菌水處理（d）。通過(guò)前人對(duì)誘導(dǎo)處理和挑戰(zhàn)接種問(wèn)隔時(shí)問(wèn)對(duì)誘抗效果影響的研究，確定最佳誘導(dǎo)效果問(wèn)隔時(shí)問(wèn)為3～7d，因此選擇第3天挑戰(zhàn)接種。調(diào)節(jié)誘導(dǎo)因子溶液pH至6.8，加0.05%吐溫80備用。選擇長(zhǎng)勢(shì)均一的雜交竹上部嫩枝8條進(jìn)行噴霧涂布處理，以溶液布滿嫩枝不下流為宜，套袋保濕12h，第2、3天各重復(fù)處理1次，以確保誘導(dǎo)因子能夠被植株有效吸收。以無(wú)菌水為對(duì)照。每個(gè)品種分別處理15株，于最后一次處理后的第1、3、5天針刺接種暗孢節(jié)菱孢菌（針刺部位在嫩枝頂端節(jié)叉處，不刺穿為宜），傷口處滴一滴菌液，約0.05mL;套袋保濕，于接種后1、3、5、10、15、20、25、30、35、40d調(diào)查發(fā)病情況，按照下列方法計(jì)算病情指數(shù)及其誘抗效果。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)枯萎;1級(jí)：25%以下枝枯;2級(jí)：25%～50%（包含25%和50%）枝枯;3級(jí)：50%～75%枝枯（包含759/6）;4級(jí)：75%以上枝枯。

病情指數(shù)=[∑（各病級(jí)數(shù)×病枝數(shù)）/（總枝數(shù)×發(fā)病最重的病級(jí)數(shù)）]×100;

誘抗效果=[（對(duì)照病情指數(shù)一處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1雜交竹梢枯病病害癥狀及病原菌形態(tài)特征

暗孢節(jié)菱孢菌Arthrinium phaeospermum（Corda）M.B.Ellis為雜交竹梢枯病的病原菌，感病的雜交竹竹梢的某一節(jié)或某一枝條的節(jié)杈處出現(xiàn)褐色舌形或菱形病斑且在枝干上生成分生孢子器。該病原菌在PDA培養(yǎng)基上氣生菌絲發(fā)達(dá)，棉絮狀，初為白色，后逐漸變?yōu)榛野咨?，菌落底部可呈褐色。顯微鏡下該病原菌的孢子為暗褐色，分生孢子單細(xì)胞，圓形、橢圓形或透鏡狀（橄欖形），以圓形為多，而透鏡狀（橄欖形）分生孢子中問(wèn)有1條無(wú)色的發(fā)芽縫。

2.2誘導(dǎo)因子的篩選

通過(guò)玻片萌發(fā)法對(duì)3種誘導(dǎo)因子處理后的孢子萌發(fā)進(jìn)行不同時(shí)問(wèn)段觀察，以清水作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)5h時(shí)對(duì)照和經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)處理的孢子萌發(fā)存在一定的差異，且24h時(shí)差異較明顯。分生孢子在清水中5h已經(jīng)開始萌發(fā)，且萌發(fā)力較強(qiáng)。萌發(fā)時(shí)孢子端略開口，從各個(gè)端口長(zhǎng)出菌絲狀的芽管甚至有3～4條芽管的，在24h已基本萌發(fā)完全。而處理組在5～10h也開始萌發(fā)但萌發(fā)較慢，24h清水中和溫度滅活的孢子芽管均較長(zhǎng)且開始分叉（圖2）。

2.2.1溫度滅活毒素對(duì)暗孢節(jié)菱孢菌的抑制作用

毒素經(jīng)過(guò)不同溫度滅活后設(shè)置梯度濃度，在5、10h和24h觀察孢子萌發(fā)率。由表1可見，毒素在經(jīng)過(guò)60℃及以上溫度處理后，幾個(gè)梯度濃度下的孢子5h時(shí)均已萌發(fā)，甚至部分處理萌發(fā)率達(dá)到了50%，10h時(shí)已經(jīng)萌發(fā)約70%，24h萌發(fā)率為70%～84.3%;而毒素經(jīng)過(guò)40℃及以下溫度處理后，5h時(shí)僅有30%左右的孢子萌發(fā)，10h時(shí)萌發(fā)約50%～60%，24h達(dá)到56.3%～82.0%。毒素在20℃和40℃處理下不同濃度作為誘導(dǎo)因子對(duì)孢子萌發(fā)均有明顯的抑制作用，80ug/mL的濃度抑制效果突出。毒素在100℃滅活下不同濃度作為誘導(dǎo)因子孢子萌發(fā)率均與對(duì)照相近，且不同處理孢子萌發(fā)率不存在顯著差異。在60℃處理下20、40ug/mL均與對(duì)照萌發(fā)率接近，特別是40ug/mL的5、10h和24h孢子萌發(fā)率分別為51.3%、70.6%和84.3%與對(duì)照僅相差0.8、1.9和1.2百允點(diǎn)，5h時(shí)萌發(fā)率甚至高于對(duì)照。而10、80ug/mL濃度下抑制作用較大，孢子萌發(fā)率低于40ug/mL，因此選用最佳因子為毒素在60℃下滅活且濃度為40ug/mL。

2.2.2毒素經(jīng)不同蛋白酶降解后對(duì)暗孢節(jié)菱孢的抑制作用

由表2可見，毒素經(jīng)過(guò)4種不同蛋白酶處理后在同一時(shí)問(wèn)段不同濃度處理與對(duì)照有顯著差異，且隨著濃度的升高抑制效果更加明顯。毒素經(jīng)過(guò)胰蛋白酶、K蛋白酶、羧肽酶處理作為誘導(dǎo)因子配制梯度濃度，均為濃度20ug/mL的孢子萌發(fā)效果較好，尤其在10h時(shí)胰蛋白酶處理的與對(duì)照僅差5.2百分點(diǎn)，但在24h時(shí)差距達(dá)到了10.2百分點(diǎn)。而糜蛋白酶處理下濃度10ug/mL的孢子萌發(fā)效果較好，24h時(shí)孢子的萌發(fā)率高于其他3種酶處理下的，但也只達(dá)到76.0%，與對(duì)照85.5%差異顯著。

2.2.3細(xì)胞壁成分對(duì)暗孢節(jié)菱孢的抑制作用

從表3可以看出細(xì)胞壁成分對(duì)孢子萌發(fā)的影響，隨著時(shí)問(wèn)的延長(zhǎng)孢子萌發(fā)率的差異越來(lái)越明顯。20ug/mL處理相比其他濃度萌發(fā)效果較好，在10h和24h時(shí)萌發(fā)率分別達(dá)到60.0%、69.3%，與對(duì)照72.5%、85.5%相差12.5百分點(diǎn)和16.2百分點(diǎn)，且同一時(shí)問(wèn)段隨著濃度的提高孢子萌發(fā)率顯著降低。

通過(guò)玻片萌發(fā)法觀察誘導(dǎo)因子對(duì)病原菌暗孢節(jié)菱孢菌孢子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)3種誘導(dǎo)因子對(duì)孢子萌發(fā)均有一定的抑制作用。在毒素經(jīng)過(guò)溫度滅活作為誘導(dǎo)因子組中，萌發(fā)效果較好的為經(jīng)過(guò)60℃滅活、毒素濃度為40ug/mL處理，其24h時(shí)的萌發(fā)率為84.3%。在毒素經(jīng)過(guò)4種蛋白酶降解作為誘導(dǎo)因子組中，萌發(fā)效果較好的為糜蛋白酶處理下毒素濃度10ug/mL，24h時(shí)的萌發(fā)率為76.0%。在細(xì)胞壁成分作為誘導(dǎo)因子組中20ug/mL的孢子萌發(fā)效果較好，24h時(shí)的萌發(fā)率為69.3%。

從以上結(jié)果可以看出，不同蛋白酶對(duì)毒素處理和細(xì)胞壁提取物不同濃度處理對(duì)病原菌暗孢節(jié)菱孢菌的孢子萌發(fā)均有抑制作用，溫度滅活處理80C和40℃及以下溫度對(duì)孢子萌發(fā)也有抑制作用，而100℃溫度處理孢子萌發(fā)與對(duì)照不存在顯著差異。因此，最終選擇經(jīng)過(guò)60℃滅活毒素，濃度為40ug/mL作為最佳誘導(dǎo)因子。

2.3室外持續(xù)期病情指數(shù)和誘導(dǎo)效果比較

2.3.1雜交竹不同品種誘導(dǎo)后的癥狀

通過(guò)圖3得出，接種后，經(jīng)過(guò)40d持續(xù)觀察，3個(gè)不同雜交竹品種的癥狀表現(xiàn)均不同。對(duì)于3個(gè)不同雜交竹品種，雜交竹8#的感病程度高于其他兩個(gè)品種。從a組來(lái)看雜交竹8#的葉片幾乎全部變黃枯萎枝干也全部干枯，3#葉片大多數(shù)變黃枯萎但枝干僅干枯少部分，而6#僅有少數(shù)葉片變黃枝干未見干枯。b和c組病情指數(shù)均有降低，但8#的葉片變黃枯萎程度依然高于3#和6#。

2.3.2雜交竹不同品種不同處理誘導(dǎo)后的病情指數(shù)

從圖4中變化動(dòng)態(tài)得知，CK2組上升的趨勢(shì)高于處理組1、CKl和CK3，1～10d緩慢上升，10～30d上升的幅度變大，30～40d上升的幅度又開始減緩。CK2中雜交6#的病情指數(shù)在40d時(shí)增加到了37.69，而雜交3#增加到了48.38，雜交8#增加的最高，達(dá)到了63.15。圖中也看出CK28整個(gè)觀察時(shí)問(wèn)段折線一直處于最高。3#、6#和8#對(duì)應(yīng)的折線變化趨勢(shì)與CKl-3#、CKl-6#和CKl-8#相近，1～30d有緩慢的上升趨勢(shì)，30～40d趨于穩(wěn)定。3#、6#、8#在40d時(shí)病情指數(shù)分別為25.42、19.71和32.43，相比CK2低了17.98、22.96、30.72。CKl的3個(gè)雜交竹品種40d時(shí)與CK2相比病情指數(shù)也分別低了16.88、22.26和29.9。而CK3整個(gè)時(shí)問(wèn)段變化不明顯波動(dòng)，幅度也不大，病情指數(shù)也最低，3#、6#和8#分別為13.46、9.08和19.49。

2.3.3雜交竹不同品種誘導(dǎo)后的誘抗效果

通過(guò)圖5可看出10～25d期問(wèn)3條直線都是升高趨勢(shì)，25～40d趨于穩(wěn)定，這可能是開始病原菌對(duì)寄主植物造成一定的傷害，后誘導(dǎo)激發(fā)了寄主植物自身的抗性，增強(qiáng)了對(duì)抗逆境的能力?？剐云贩N的誘抗指數(shù)折線圖整個(gè)時(shí)問(wèn)段一直高于感病品種。從6#的誘抗效果動(dòng)態(tài)變化來(lái)看，1～10d折線先降低，10～20d有緩慢的上升趨勢(shì)，20～40d穩(wěn)定，此時(shí)的誘抗指數(shù)穩(wěn)定在49.23%左右。3#誘抗指數(shù)在1～5d從46.97%降到了38.12%，5～25d又升高到了46.99%，30～40d穩(wěn)定在48.53%左右。8#在1～5d誘抗指數(shù)穩(wěn)定于26.92%左右，10～35d有較大幅度的上升，平均值達(dá)到了47.10%?？傊s交6#的折線在整個(gè)時(shí)問(wèn)段均高于雜交3#和雜交8#，而雜交8#相對(duì)于雜交6#、雜交3#兩個(gè)品種折線波動(dòng)幅度變化更大，尤其在5～25d呈直線上升趨勢(shì)，雜交6#誘導(dǎo)處理后變化幅度最小。

通過(guò)圖4病情指數(shù)比較得知，3個(gè)不同雜交竹品種在4種不同處理方式中均呈現(xiàn)CK3植株的病情指數(shù)最低，CK2的病情指數(shù)最高。處理組1的病情指數(shù)低于CK2，表明誘導(dǎo)因子使植株抗性增加。而圖5誘抗效果比較得出，雜交竹6#整個(gè)時(shí)問(wèn)段的誘抗平均值達(dá)到了50.16%，高于雜交竹3#和8#，說(shuō)明抗性品種對(duì)誘導(dǎo)因子的響應(yīng)更明顯。

3結(jié)論與討論

3.1不同誘導(dǎo)因子對(duì)病原茵孢子萌發(fā)影響不同

誘導(dǎo)因子又稱為誘抗劑、激發(fā)子，是靠誘導(dǎo)物獲得抗性。它與自然獲得抗性具有相同的抗病譜，且誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性與自然產(chǎn)生的抗性和機(jī)理是相同的，誘導(dǎo)物本身對(duì)病原物沒有直接殺傷作用，是能夠誘發(fā)植物產(chǎn)生抗病防衛(wèi)反應(yīng)的物質(zhì)。葛銀林、李洪連、李開本等的研究表明，激發(fā)子是能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)（或植保素）的特殊物質(zhì)，而May-ama、Ehrenshaft、Moussatos、章元壽、董金皋等的研究結(jié)果說(shuō)明毒素可以作為激發(fā)子增加植物體內(nèi)的抗病物質(zhì)，起著與受體問(wèn)相互識(shí)別的作用。本試驗(yàn)選用溫度滅活的毒素、經(jīng)過(guò)不同蛋白酶處理的毒素和病原菌細(xì)胞壁成分作為3種誘導(dǎo)因子，對(duì)誘導(dǎo)因子設(shè)置不同濃度梯度，采用玻片萌發(fā)法觀察其對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響。經(jīng)過(guò)細(xì)胞壁成分處理的孢子在5h時(shí)平均萌發(fā)率為16.25%，經(jīng)過(guò)蛋白酶處理毒素后的孢子平均萌發(fā)率為18.29%，經(jīng)過(guò)溫度滅活處理毒素的孢子萌發(fā)率為19.09%，與對(duì)照相比孢子萌發(fā)率均低于清水中的萌發(fā)率，但經(jīng)過(guò)溫度滅活處理毒素的孢子萌發(fā)率更接近清水中孢子萌發(fā)率，而相比5h時(shí)細(xì)胞壁成分對(duì)病原菌有明顯的抑制作用。10h同樣溫度滅活毒素與清水中孢子萌發(fā)率接近，因此最佳誘導(dǎo)因子選用溫度滅活的毒素。

確定選用溫度作為最佳誘導(dǎo)因子后，對(duì)溫度設(shè)置梯度20、40、60、80、100℃分別對(duì)毒素滅活，進(jìn)而觀察不同溫度滅活后對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響。由表1可知100℃滅活毒素后觀察病原菌孢子萌發(fā)率均與清水對(duì)照差異不顯著，可能毒素已經(jīng)全部失活，20、40、80℃滅活毒素孢子萌發(fā)率與清水存在顯著差異，而60℃滅活毒素在20、40ug/mL的濃度下孢子萌發(fā)率與清水不存在顯著差異，孢子萌發(fā)效果較好，毒素濃度10、80ug/mL處理孢子萌發(fā)率與清水存在顯著差異，因此選用60℃作為最佳溫度。

對(duì)純毒素經(jīng)過(guò)60℃滅活后設(shè)置梯度濃度10、20、40、80ug/mL觀察不同濃度對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的作用。在這4個(gè)不同濃度梯度中40ug/mL與清水對(duì)照不存在顯著差異且萌發(fā)效果最好，因此40ug/mL為最佳濃度處理。

綜上所述，選出的最佳誘導(dǎo)因子為純毒素經(jīng)過(guò)60℃滅活處理、毒素濃度為40ug/mL。3.2不同雜交竹品種誘導(dǎo)抗病性存在差異

Dean、Okuno、冉隆賢、蔡新忠、李紅玉等的研究表明，在一定的濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)因子與抗性寄主植物的誘導(dǎo)抗病性效果存在正相關(guān)關(guān)系，抗性越強(qiáng)的品種誘導(dǎo)抗性越好。劉亞光等研究認(rèn)為灰斑病菌和粗毒素對(duì)抗病品種誘導(dǎo)作用強(qiáng)于感病品種。王敬文等研究PAL在抗馬鈴薯晚疫病中的作用發(fā)現(xiàn)，無(wú)論病原菌還是病原菌毒素處理，PAL的活性大小與品種抗病性呈正相關(guān)。因此對(duì)于大多數(shù)情況而言，在最佳誘導(dǎo)因子的誘導(dǎo)作用下，抗性品種的誘導(dǎo)抗性要高于感病品種且在一定的時(shí)問(wèn)段后，誘導(dǎo)效應(yīng)不再增強(qiáng)而趨于穩(wěn)定。然而對(duì)于不同的寄主植物誘導(dǎo)抗病性也存在差異，前人的研究大部分都是針對(duì)農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)作物等的幼苗期進(jìn)行誘導(dǎo)處理的，本試驗(yàn)所選定的研究對(duì)象是禾本科植物雜交竹。

本試驗(yàn)用室內(nèi)試驗(yàn)篩選的最佳誘導(dǎo)因子作用于不同雜交竹品種，觀察接種后1～40d的病情指數(shù)和誘抗效果。從不同雜交竹品種病情指數(shù)和誘抗指數(shù)的變化圖（圖4、5）可看出，經(jīng)過(guò)最佳誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)后，各品種病情指數(shù)和誘抗效果存在差異。3個(gè)不同抗性品種在1～40d的誘抗指數(shù)平均值分別為雜交竹6#50.16%，雜交竹3#44.77%，雜交竹8#38.64%，結(jié)果與前人的研究相似。雜交竹6#和3#在誘導(dǎo)后1～5d誘抗指數(shù)有降低的趨勢(shì)，5d之后開始上升，25～40d趨于穩(wěn)定，此時(shí)誘抗指數(shù)為48.459/6。雜交竹8#對(duì)誘導(dǎo)因子反應(yīng)較為緩慢，1～5d沒有變化，5d之后迅速呈直線上升，最終穩(wěn)定時(shí)的誘抗指數(shù)為47.54%。雜交竹8#感病品種呈直線上升可能是因?yàn)檎T導(dǎo)因子對(duì)某些生化物質(zhì)的誘導(dǎo)速度快于抗病品種，但最終的誘抗效果依然是抗病品種高于感病品種。