萬麗娜,王劼,杜玉枝,孫菁,孟衛(wèi)東,盧學(xué)峰,周玉碧

(1.中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室，中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室，青海 西寧 810001；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.青海道康農(nóng)牧科技有限公司，青海 都蘭 816100)

疲勞是機體生理機能減退的一種現(xiàn)象，造成這一現(xiàn)象的原因多種多樣[1].1982年第五屆國際運動生化會議統(tǒng)一了疲勞的概念[2].據(jù)WHO調(diào)查，全球有35%以上的人處于疲勞狀態(tài)，中年男性人群疲勞狀態(tài)達60%[3].隨著生活壓力的增大，疲勞已成為影響人們生活質(zhì)量的重要因素.疲勞發(fā)生后，如得不到及時消除，則易導(dǎo)致機體內(nèi)環(huán)境紊亂、免疫力下降、大腦反應(yīng)遲鈍、甚至出現(xiàn)器質(zhì)性病變，如:帕金森病、中風(fēng)等[4].因此，如何緩解疲勞，實現(xiàn)高質(zhì)量的生活成為人們研究的熱點.越來越多的證據(jù)表明，不同中藥材中的提取物，如竹節(jié)人參提取物、黃秋葵水提取物、黃芪提取物、野生水芹提取物在抗疲勞方面均具有較好的功效[5-8].

鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)為鎖陽科鎖陽屬植物，多年生肉質(zhì)寄生草本，多寄生于白刺屬植物的根上[9-10]，主要分布于青海、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏和新疆等荒漠化地區(qū)[11].鎖陽是我國珍貴的傳統(tǒng)中藥材，素有“沙漠人參”的美稱[12]，與肉蓯蓉并稱為“大漠雙雄”[13].鎖陽中含有蛋白質(zhì)、脂肪、無機離子及糖類等人體所需的重要營養(yǎng)成分，同時鎖陽中還含有豐富的三萜類、甾體類、黃酮類、鞣質(zhì)和有機酸等多種活性成分[14-16].近年來隨著現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鎖陽有增強免疫[17]、抗氧化[18]、抗衰老[19]、抗應(yīng)激[20]、清除自由基[21]、抑制血小板凝集[22]等作用，且對心血管疾病有顯著療效[23].

研究表明甘肅產(chǎn)鎖陽黃酮對大鼠有增強運動耐力、提高機體抗氧化、抗疲勞等方面的作用[24]，甘肅產(chǎn)鎖陽水煎劑可提高機體抗疲勞能力[25-26]；熊正英等[27]研究結(jié)果表明，鎖陽多糖具有抗疲勞作用.盡管針對鎖陽抗疲勞方面的研究已有報道，但針對青海產(chǎn)鎖陽的抗疲勞功效研究還未見報道[28].鎖陽是青海省著名的道地藥材,資源儲量大，具有極大的開發(fā)價值[29].因此，本試驗以采自于青海都蘭的鎖陽為原料，探究鎖陽乙醇提取物在小鼠抗運動性疲勞方面的作用，以期為我國西部地區(qū)鎖陽資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗動物

昆明種小鼠60只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供.小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物室，喂飼全價顆粒飼料.飼養(yǎng)條件濕度為50%～80%，溫度21～23 ℃，每12 h明暗循環(huán).

60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，分別為模型對照組(超純水)，鎖陽乙醇提取物低劑量組(0.125 g提取物/mL)、鎖陽乙醇提取物中劑量組(0.25 g提取物/ml)、鎖陽乙醇提取物高劑量組(0.5 g提取物/mL)，紅景天口服液陽性對照組，維生素E軟膠囊陽性對照組.

1.2 藥物與試劑

紅景天口服液產(chǎn)自阿壩州九寨生物科技有限公司，維生素E軟膠囊產(chǎn)自青島雙鯨藥業(yè)有限公司，鎖陽乙醇提取物由本課題組自行制備，質(zhì)量濃度為0.125、0.25、0.5 g/mL.ATP(武漢基因美科技有限公司，貨號JYM0723Mo)；肝糖原(南京建成生物工程研究所，批號20171218)；肌糖原(南京建成生物工程研究所，批號20171218)；血糖(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，批號20171221)；BUN(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，批號20171221)；LD(南京建成生物工程研究所，批號20171218)；MDA(武漢基因美科技有限公司，貨號JYM0345Mo)；CK武漢基因美科技有限公司，貨號JYM0627Mo).

1.3 主要儀器與設(shè)備

離心機(3K15，美國Sigma公司)；恒溫干燥箱(上?！憧茖W(xué)儀器有限公司)；超純水器(Milli-QA-10，美國Millipore公司)；循環(huán)水真空泵(SHZ-Ⅲ，上海亞榮生化儀器廠)；電子天平(AL104，上海天平儀器總廠)；多功能酶標儀(EnSpire，珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司)；可見分光光度計(722，上海棱光技術(shù)有限公司)；游泳箱；有機玻璃桿；記時器；溫度計；直尺.

1.4 試驗方法

1.4.1 鎖陽乙醇提取物的制備 鎖陽采自青海省都蘭縣，由中國科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰研究員鑒定為鎖陽科鎖陽屬鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉質(zhì)莖.清洗，晾干，取已晾干的鎖陽莖1 000 g粉碎，用75%乙醇提取，固液比1∶4，提取溫度80 ℃，提取6次，分別為8、8、6、6、6、6 h，將每次提取液合并后，利用負壓回流濃縮提取液，獲得濃縮液，然后將濃縮液至于80 ℃烘箱中烘干，備用.

1.4.2 藥物處理 將鎖陽乙醇提取物用超純水配成藥物濃度為0.125，0.25，0.5 g/mL的溶液，記為鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量；紅景天口服液拆除包裝后直接取用；維生素E軟膠囊去除膠囊外殼后使用；超純水直接取自純水機.

1.4.3 動物給藥 每天上午固定時間按小鼠體質(zhì)量比例給藥一次,鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組每次均給予15 mL/kg，模型對照組小鼠用等體積超純水進行灌胃，紅景天口服液陽性對照組每次給予7 mL/kg，維生素E軟膠囊陽性對照組每次給予5 mL/kg，連續(xù)灌胃給藥.

1.4.4 體質(zhì)量測量 分組方法同1.4，給藥方法同2.3，連續(xù)灌胃給藥14 d后，用電子秤稱量體質(zhì)量，與給藥前的體質(zhì)量進行比較(禁食不禁水12 h).

1.4.5 抗疲勞試驗

1.4.5.1 小鼠爬桿試驗 分組方法同1.4，給藥方法同2.3，連續(xù)灌胃給藥14 d，末次給藥30 min后(禁食不禁水12 h)，將小鼠放于一根垂直固定的直徑8 mm，長120 cm的有機玻璃桿上，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌下的時間，聯(lián)系懸掛3次，第3次跌落時終止試驗，累計3次的時間作為小鼠爬桿時間，記錄數(shù)據(jù).

1.4.5.2 小鼠負重游泳試驗 分組方法同1.4，給藥方法同2.3，連續(xù)灌胃給藥14 d，末次給藥30 min后(禁食不禁水12 h)，于小鼠尾部系一質(zhì)量為其體重5%的重物，將小鼠置于水溫為 (25±1) ℃，水深為30 cm，游泳面積114.8 cm2/只的游泳箱中，強迫游泳至力竭，以小鼠游泳至死亡結(jié)束，記錄時間作為小鼠負重游泳時間.

1.4.5.3 生化指標檢測 分組方法同1.4，給藥方法同2.3，連續(xù)灌胃給藥14 d，末次給藥30 min后(禁食不禁水12 h)，將小鼠置于水溫為(25±1) ℃，水深為30 cm，游泳面積114.8 cm2/只的游泳箱中，游泳90 min后將小鼠撈起，即刻進行摘眼球采血備用.將所采血液常規(guī)分離血清，4 ℃ 3 000 r/min離心20 min，取上清液待測.肝糖原、肌糖原含量的測定采用蒽酮試劑法，血糖含量的測定采用葡萄糖氧化酶法，BUN含量的測定采用Fearon反應(yīng)，ATP、MDA、CK采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗進行含量測定，LD采用比色法進行含量測定.

肝糖原、肌糖原、LD指標測定采用可見分光光度計完成，其余指標測定均采用EnSpire多功能酶標儀檢測完成.

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鎖陽乙醇提取物對小鼠體質(zhì)量的影響

鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量進行灌胃給藥14 d后，與模型組相比，體質(zhì)量均有所增加，但差異均不顯著(P>0.05)，說明該劑量鎖陽乙醇提取物處理對小鼠肌肉質(zhì)量和體質(zhì)量影響不大；組間兩兩比較差異均不顯著(P>0.05)(表1).

2.2 鎖陽乙醇提取物對小鼠爬桿及負重游泳時間的影響

在小鼠爬桿及負重游泳試驗中，與模型對照組比較，鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組均能明顯延長小鼠爬桿及負重游泳時間，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).鎖陽乙醇提取物高劑量組與維生素E軟膠囊陽性對照組相比，在延長小鼠爬桿及負重游泳時間上能力相近(P>0.05).鎖陽乙醇提取物(中、高)劑量組在延長小鼠爬桿及負重游泳時間上與鎖陽乙醇提取物低劑量組有顯著差異(P<0.05)，見表2.

組別Group給藥前體質(zhì)量/gBody mass before administration給藥后體質(zhì)量/gBody mass after administration模型對照組Model control group19.9±5.9a30.4±3.1a鎖陽乙醇提取物低劑量組Low dose group of ethanol extract of C.songaricum22.1±2.5a30.5±3.6a鎖陽乙醇提取物中劑量組Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum21.9±2.0a31.3±3.4a鎖陽乙醇提取物高劑量組High dose group of ethanol extract of C.songaricum19.2±5.8a30.9±4.1a維生素E軟膠囊陽性對照組Vitamin E soft capsule positivecontrol group21.6±2.5a30.1±4.0a紅景天口服液陽性對照組Rhodiola oral liquid positive control group22.4±1.8a30.7±4.4a

組別Group爬桿時間/minClimbing time負重游泳時間/minWeight-bearing swimming time模型對照組Model control group44.6±16.378.3±7.7鎖陽乙醇提取物低劑量組Low dose group of ethanol extract of C.songaricum48.3±10.1c**88.4±9.6c*鎖陽乙醇提取物中劑量組Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum70.2±8.4b**98.0±14.4b**鎖陽乙醇提取物高劑量組High dose group of ethanol extract of C.songaricum79.7±15.9b**105.9±17.3ab**維生素E軟膠囊陽性對照組Vitamin E soft capsule positivecontrol group78.8±13.1b**101.0±16.2ab**紅景天口服液陽性對照組Rhodiola oral liquid positive control group111.6±25.8a**113.0±21.6a**

與模型對照組比較*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

2.3 鎖陽乙醇提取物對疲勞小鼠肝糖原、肌糖原、血糖的影響

由表3所示，通過檢測發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組能顯著增加小鼠血糖、肝糖原、肌糖原含有量(P<0.01)，表明鎖陽乙醇提取物具有促進糖原儲備的作用，從而有利于機體對抗運動性疲勞.鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組與維生素E軟膠囊、紅景天陽性對照組相比，在增加疲勞小鼠肝糖原、肌糖原、血糖含量上能力相近(P>0.05).鎖陽(低、中、高)劑量組在增加疲勞小鼠肝糖原、血糖含量上差異不明顯(P>0.05)；在增加疲勞小鼠肌糖原含量上，鎖陽高劑量組與鎖陽(低、中、)劑量組存在顯著差異，結(jié)果見表3.

組別Group肝糖原/(mg·g-1)Hepatic glycogen肌糖原/(mg·g-1)Muscle glycogen血糖/(μmol·mL-1)Blood sugar模型對照組Model control group12.3±0.413.3±1.01.1±0.2鎖陽乙醇提取物低劑量組Low dose group of ethanol extract of C.songaricum16.9±2.0b**15.7±1.0c**2.2±0.5b**鎖陽乙醇提取物中劑量組Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum17.4±2.6b**16.6±1.4c**2.4±0.6b**鎖陽乙醇提取物高劑量組High dose group of ethanol extract of C.songaricum17.7±2.9b**21.0±2.5ab**2.5±0.9b**維生素E軟膠囊陽性對照組Vitamin E soft capsule positive control group18.6±2.3ab**20.2±1.8b**3.3±0.8a**紅景天口服液陽性對照組Rhodiola oral liquid positive control group20.7±2.2a**22.3±2.2a**3.5±0.6a**

與模型對照組比較*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

2.4 鎖陽乙醇提取物對疲勞小鼠BUN、CK的影響

通過檢測發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組能極顯著降低小鼠CK含有量(P<0.01)，提示鎖陽乙醇提取物對小鼠力竭游泳后肌肉損傷有較好的保護作用；鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組能顯著降低小鼠BUN含有量(P<0.05)；鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組與維生素E軟膠囊、紅景天陽性對照組相比，在降低疲勞小鼠BUN、CK含量上能力相近(P>0.05).鎖陽乙醇提取物不同劑量組之間在降低CK、BUN含量上差異不明顯，結(jié)果見表4.

組別Group尿素氮/(mg·g-1)BUN肌酸激酶/(ng·mL-1)CK模型對照組Model control group1.5±0.34.4±0.8鎖陽乙醇提取物低劑量組Low dose group of ethanol extract of C.songaricum1.0±0.5a*2.4±0.5a**鎖陽乙醇提取物中劑量組Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum1.0±0.3*a2.2±0.7a**續(xù)表4 Continued table 4組別Group尿素氮/(mg·g-1)BUN肌酸激酶/(ng·mL-1)CK鎖陽乙醇提取物高劑量組High dose group of ethanol extract of C.songaricum0.7±0.4a**2.0±0.5a**維生素E軟膠囊陽性對照組Vitamin E soft capsule positive control group0.9±0.5a**2.3±0.5a**紅景天口服液陽性對照組Rhodiola oral liquid positive control group0.7±0.5a**1.9±0.1a**

與模型對照組比較*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

2.5 鎖陽乙醇提取物對疲勞小鼠LD、ATP、MDA的影響

通過檢測發(fā)現(xiàn)，與模型對照組比較，鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組能極顯著降低小鼠LD含量(P<0.01)，且不同劑量組之間差異顯著；鎖陽乙醇提取物(低、中、高)劑量組極顯著增加了小鼠ATP含量(P<0.01)，且鎖陽乙醇提取物高劑量組與鎖陽乙醇提取物(低、中)劑量組存在明顯差異；鎖陽乙醇提取物中、高劑量組能顯著降低小鼠MDA含有量(P<0.05)，說明鎖陽乙醇提取物能提高力竭游泳小鼠抗氧化及抗疲勞能力.與陽性對照組比較，在降低疲勞小鼠血清中LD含量以及增加ATP含量上，鎖陽乙醇提取物各劑量組與維生素E軟膠囊陽性對照組相比能力相近(P>0.05)，結(jié)果見表5.

組別Group乳酸/(mmol·L-1)LD三磷酸腺苷/(ng·mL-1)ATP丙二醛/(ng·mL-1)MDA模型對照組Model control group17.5±1.615.5±1.1139.8±17.2鎖陽乙醇提取物低劑量組Low dose group of ethanol extractof C.songaricum14.1±0.9a**18.4±2.7b*131.8±21.1a鎖陽乙醇提取物中劑量組Middle dose group of ethanol extract of C.songaricum8.4±1.7b**19.0±3.5b**121.3±8.8a*鎖陽乙醇提取物高劑量組High dose group of ethanol extractof C.songaricum6.6±1.2c**20.35±2.5ab**121.7±15.1a*維生素E軟膠囊陽性對照組Vitamin E soft capsule positive control group6.2±1.3cd**20.9±4.7a**68.2±5.8b**紅景天口服液陽性對照組Rhodiola oral liquid positive control group5.2±1.6d**22.4±2.8a**76.6±20.7b**

與模型對照組比較*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Compared with model control，* means significant difference (P<0.05)；** means extremely significant difference (P<0.01).The different letters in the same column means significant difference (P<0.05).

3 討論

力竭時間是衡量機體運動能力的重要指標，運動能力的提高表明機體抗疲勞能力的增強[30].在抗疲勞研究領(lǐng)域中，常以負重游泳力竭時間來反映機體的運動耐力，機體運動耐力的提高，則可直接反映機體抗疲勞能力的增強.本研究通過爬桿實驗、負重游泳試驗發(fā)現(xiàn)鎖陽乙醇提取物能明顯延長小鼠的運動時間，說明在一定劑量下，鎖陽乙醇提取物能提高小鼠運動耐力，具有一定的抗運動性疲勞的作用.

本試驗測定了與疲勞密切相關(guān)的肝糖原、肌糖原、血糖、BUN、LD、ATP、MDA、CK八項生化指標.血糖水平不僅可以用來反映機體的糖代謝水平，還可以反映中樞疲勞狀況[31].通常情況下，機體血糖濃度保持在一定的平衡狀態(tài)，但在激烈運動過程中，血糖大量消耗且得不到及時補充時，血糖水平會逐漸下降.與模型組比較，鎖陽乙醇提取物低、中、高劑量組能顯著增加小鼠體內(nèi)血糖含量，說明鎖陽乙醇提取物可改善疲勞后的能量供應(yīng)，具有一定的抗疲勞功效.糖原是機體運動的主要能量來源，可以通過肝糖原、肌糖原的儲備量來說明疲勞產(chǎn)生的快慢或程度.與模型組比較，鎖陽乙醇提取物低、中、高劑量組可顯著增加小鼠體內(nèi)肝糖原和肌糖原的含量，進而說明鎖陽乙醇提取物可通過提高小鼠游泳力竭后的糖原儲備能力，有一定緩解小鼠運動性疲勞產(chǎn)生的作用.

機體運動時所需能量直接來源于ATP的分解，開始運動時，機體首先以消耗ATP為主，ATP含量的高低可直接衡量機體的供能狀態(tài)和運動能力.與模型組比較，鎖陽乙醇提取物低、中、高劑量組顯著增加了小鼠血清中的ATP含量，為運動小鼠直接提供了能量來源，有一定抗小鼠運動性疲勞產(chǎn)生的作用.

乳酸是丙酮酸在乳酸脫氫酶作用下還原生成的一種酸性代謝產(chǎn)物，乳酸堆積是生理性運動疲勞產(chǎn)生的重要原因之一.尿素氮是氨基酸和蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，與機體疲勞程度以及負荷量的大小密切相關(guān)且呈正相關(guān)，可被用來作為評定運動量的指標[32].一般在短時運動時，蛋白質(zhì)不參與機體供能，當(dāng)長時間劇烈運動使正常的能量代謝平衡受到破壞，機體不能通過糖或脂肪分解獲得足夠的能量時，機體便會增加蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝用以供能.與模型組比較，鎖陽乙醇提取物低、中、高劑量組顯著降低了運動小鼠體內(nèi)LD的產(chǎn)生，減少了代謝產(chǎn)物的堆積，同時顯著降低了BUN水平，減少了體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝，具有改善能量代謝，加速疲勞消除的作用.

CK主要存在于細胞質(zhì)和線粒體中，是一個與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，當(dāng)肌膜嚴重損傷或細胞膜通透性改變時，骨骼肌中的CK會通過細胞膜滲出并進入血液中，使得血清中的CK含量升高.運動后可導(dǎo)致CK明顯增高，且運動越劇烈、時間越長，CK升高越明顯，因此血清中的CK含量可間接反映出機體運動肌肉損傷程度[33].鎖陽乙醇提取物低、中、高劑量組可降低游泳小鼠血清中CK的含量，對運動肌肉損傷有一定的保護作用.MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量既可以反映機體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的程度，也可以反映生物膜的受損程度.鎖陽乙醇提取物低、中、高劑量組MDA含量均顯著低于模型對照組，說明鎖陽乙醇提取物低、中、高劑量組可以消除自由基的攻擊，降低力竭及恢復(fù)狀態(tài)下MDA的生成，保護機體，對延緩運動性疲勞的發(fā)生有積極的作用[34].

綜上所述，鎖陽乙醇提取物可在一定程度上通過增強小鼠運動耐力，改善小鼠力竭游泳后氧化應(yīng)激和能量代謝能力，有顯著抗疲勞作用.