張濤，吳金平，陳建武，何力

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(武漢)，農(nóng)業(yè)部淡水魚類種質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223)

匙吻鱘(Polyodonspathuln)隸屬鱘形目(Acipenseriformes)、匙吻鱘科(Polyodontidae)，主要分布在美國北部一些天然水域，包括密西西比河流域以及從亞拉巴馬州西部到德克薩斯休倫湖、伊利湖和密執(zhí)安湖等水域[1].1988年我國首次引進(jìn)這一優(yōu)良品種，當(dāng)年即在湖北省仙桃市試養(yǎng)成功[2].于2001年3月宜昌市天峽特種漁業(yè)公司率先取得匙吻鱘的全人工繁殖成功[3].2009年2月25日全國水產(chǎn)原良種審定委員會將匙吻鱘審定為良種，認(rèn)為該品種適宜在我國內(nèi)陸水域推廣養(yǎng)殖[4].由于匙吻鱘具有體型體色好，食性類似于鳙，養(yǎng)殖成本低，生長速度快，養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益顯著，其卵經(jīng)加工后可制成具有較高經(jīng)濟(jì)價值的魚子醬，目前已在多個省份推廣養(yǎng)殖，以池塘和水庫養(yǎng)殖居多.為促進(jìn)匙吻鱘這一優(yōu)良品種的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，保護(hù)和增殖匙吻鱘種群，有必要推進(jìn)制定其種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作進(jìn)度，而形態(tài)特征和生化遺傳特性是制定種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)所需考察的重要參數(shù).形態(tài)特征是最為簡單和直觀的種質(zhì)資源鑒定參考指標(biāo)[5].鑒于同工酶標(biāo)記能較好的反映種屬特性和遺傳多樣性，也就作為最常用的生化遺傳標(biāo)記應(yīng)用在魚類種質(zhì)鑒定等領(lǐng)域中[6].自從發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶開始，人們就著手認(rèn)識和研究同工酶了，乳酸脫氫酶是研究最透徹的同工酶之一，魚類乳酸脫氫酶多由3種基因編碼，即LDH-A、LDH-B和LDH-C，其中LDH-C基因在魚類中一般具有組織特異性，電泳時通常趨向陰極.LDH能使細(xì)胞在供氧不足情況下仍能進(jìn)行正常的生理活動，保證肌纖維在缺氧而機(jī)體尚需劇烈運動時仍能繼續(xù)完成葡萄糖的無氧酵解過程，以提供ATP補(bǔ)充肌肉收縮所需能量.酯酶可催化生物體內(nèi)多種脂類的分解反應(yīng)，它是可催化脂類化合物水解的一系列非特異性酶組成的酶系.LDH和EST在機(jī)體中扮演重要的生理功能，已有的研究表明可作為生化遺傳標(biāo)記用于不同種鱘魚的種質(zhì)鑒定[7].目前有關(guān)匙吻鱘形態(tài)特征的報道主要有王學(xué)功[4]、董宏偉[8]、王凡[9]、劉耀輝[10]以及陳細(xì)華[11]等，但現(xiàn)有報道多是關(guān)于匙吻鱘外部形態(tài)特征的描述，缺乏可量性狀等數(shù)據(jù)，或者即使有少數(shù)可量性狀數(shù)據(jù)，又缺乏內(nèi)部構(gòu)造特征等相關(guān)數(shù)據(jù)，因此尚未見較為系統(tǒng)的匙吻鱘形態(tài)特征報道.有關(guān)匙吻鱘生化遺傳特性方面的報道僅見王學(xué)功等[4]、張海花等[12]的研究.但未見關(guān)于匙吻鱘各主要組織的多種同工酶表達(dá)情況的報道.本研究通過觀察匙吻鱘外部形態(tài)特征并作描述、測定其可量可數(shù)指標(biāo)，同時借助聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，研究匙吻鱘5種組織中的乳酸脫氫酶和酯酶表達(dá)情況.旨在進(jìn)一步豐富匙吻鱘形態(tài)特征和生化遺傳方面的研究內(nèi)容，同時篩選出鑒定其種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記，為制定匙吻鱘種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、探討種質(zhì)鑒定在匙吻鱘標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和增殖過程中的應(yīng)用開展基礎(chǔ)工作.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用匙吻鱘為水泥池人工繁殖培育的成鱘，于2018年4月采自湖北仙桃，共31尾，體質(zhì)量185.2～667.3 g，均值(358.62±100.25)g；體長37.8～55.8 cm，均值(45.54±4.16)cm.

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)測定 按照《GB/T 18654.3-2008 養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗·第3部分：性狀測定》[13]的規(guī)定，用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)對31尾匙吻鱘進(jìn)行測定.可量性狀包括全長、體長、體高、頭長、吻長、吻寬、眼徑、眼間距、尾柄高和尾柄長，共10個指標(biāo).可數(shù)性狀包括背鰭、胸鰭、腹鰭和臀鰭的鰭式、脊椎骨總數(shù)以及幽門垂總數(shù)，共6個指標(biāo).

1.2.2 組織酶液的制備、電泳和染色 除EST所用凝膠濃度為9.5%的連續(xù)膠外，組織酶液的制備、電泳及染色參照張濤等[14]的方法.

1.2.5 繪制電泳圖譜模式圖 借助Bandscan 5.0對本研究所獲電泳圖譜中的酶帶進(jìn)行灰度識別，結(jié)合灰度識別繪制電泳圖譜模式圖.

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)描述及可數(shù)、可量性狀

觀察31尾匙吻鱘(圖1)體表裸露無鱗、濕潤，身體呈流線型，背部灰黑色，可見一些斑點夾雜于其中，自背部往腹部方向兩側(cè)逐漸變淺，腹部灰白色.頭部有一大而長形如匙柄的吻.口較大，位于吻末端腹面.眼小，位于口前端上方.鰓耙較長而且較薄，排列細(xì)密.鰓蓋大而向后延伸至胸鰭至腹鰭的1/2處.胸鰭短小，下位，背鰭起點位于腹鰭起點之后，身體在腹鰭前渾圓，腹鰭之后逐漸側(cè)扁，尾柄披有甲鱗，該甲鱗為梗節(jié)狀.尾鰭歪形，上葉長于下葉，不對稱，上葉尖長，下葉寬短.

圖1 匙吻鱘外觀形態(tài)Figure 1 Morphological measurement of Polyodon spathuln

體內(nèi)骨骼大部分由軟骨組成，鰾為一室，呈梭形.表1給出了匙吻鱘可數(shù)、可量性狀，均值反映了所測指標(biāo)的集中程度，范圍給出了各測定指標(biāo)的上下限.可數(shù)性狀中變異程度較大的有背鰭條數(shù)和臀鰭條數(shù).可量性狀中給出了眼徑、眼間距和吻長等頭部主要參數(shù)與頭長的比例關(guān)系，也反映了尾柄長、尾柄高和體高等軀干部主要參數(shù)與體長的比例關(guān)系以及吻長與吻寬、尾柄長與尾柄高的比例關(guān)系.

2.2 LDH的表達(dá)

匙吻鱘5種組織的LDH同工酶表達(dá)情況見圖2，5種組織中共檢測到5條LDH酶帶，將離陰極最遠(yuǎn)的一條LDH酶帶定義為LDH1，自陽極向陰極方向各LDH酶帶依次編號為LDH2、LDH3、LDH4、LDH5.從圖2可以看出匙吻鱘LDH呈現(xiàn)出明顯的組織特異性，表現(xiàn)在不同組織中酶帶數(shù)目和活性不同.心臟組織中共有4條酶帶檢出，LDH1～LDH3在5尾樣本魚中都有表達(dá)，其中LDH1和LDH2表達(dá)活性程度較強(qiáng)，LDH3表達(dá)活性次之，LDH4活性最弱，而且LDH4在3號魚和4號魚中未檢出(圖2-A)；眼睛晶狀體組織中共檢測到4條酶帶，5尾不同樣本魚酶帶條數(shù)不同，僅4號魚中未檢出LDH4，LDH1～LDH3為5尾樣本魚共有的酶帶，LDH2和LDH3表達(dá)活性較強(qiáng)(圖2-B)；LDH在肌肉組織中表達(dá)活性較其它4種組織都弱，僅檢測到2條LDH酶帶，5尾樣本魚的酶帶數(shù)不同，LDH1僅在3號魚中有檢出，LDH2為5尾樣本魚共有的酶帶(圖2-C)；脾臟中共檢測到5條LDH酶帶，LDH2～LDH5為5尾樣本魚共有的酶帶，5尾不同樣本魚酶帶條數(shù)和活性不同，除3號魚和4號魚中未檢測到LDH1酶帶外，其余3尾均有檢出，而且2號魚和5號魚的LDH2和LDH5表達(dá)活性較其它3尾魚強(qiáng)(圖2-D)；肝臟組織中共檢測到5條酶帶，5尾樣本魚LDH酶帶數(shù)和表達(dá)活性均相同，為單態(tài)，LDH1表達(dá)活性最弱，LDH4和LDH5表達(dá)活性最強(qiáng)，其余2條酶帶表達(dá)活性居中(圖2-E).

表中可量性狀單位是cm；

The unit of measurable parameters in Tab.1 was centimeter.

A、B、C、D、E分別表示心臟、眼睛晶狀體、肌肉、脾臟和肝臟的LDH酶譜；1～5泳道分別表示不同個體的酶譜.A,B,C,D,and E show electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart,eye,muscle,spleen and liver respectively.1～5 show the zymograms of different individuals.圖2 匙吻鱘5種組織LDH電泳圖譜Figure 2 Electrophoretogram of LDH isozymes expressed in five tissues of Polyodon spathuln

2.3 EST的表達(dá)

匙吻鱘5種組織EST同工酶的表達(dá)情況見圖3，5種組織中共檢測到5條EST酶帶，將靠近離陰極最遠(yuǎn)的一條EST酶帶定義為EST1，自陽極向陰極方向各EST酶帶依次編號為EST2、EST3、EST4、EST5.從圖3可以看出匙吻鱘EST也呈現(xiàn)出一定的組織特異性，不同組織中EST酶帶數(shù)和活性不同.心臟組織中共有2條EST酶帶檢出，各樣本魚的酶帶數(shù)和表達(dá)活性相同，EST2表達(dá)活性較強(qiáng)，另一條酶帶表達(dá)活性相對較弱(圖3-A)；所有樣本魚的眼睛晶狀體組織中未檢測到EST的表達(dá)(圖3-B)；EST在肌肉組織中表達(dá)活性相對其它3種組織低，僅1號魚檢測到2條EST酶帶，其余4尾魚均只檢測到1條即EST2酶帶(圖3-C)；和心臟組織相同，EST在5尾樣本魚脾臟中均檢測到2條EST酶帶，各樣本魚2條EST酶帶表達(dá)活性相同(圖3-D)；5種組織中EST在肝臟組織中的表達(dá)的酶帶數(shù)最多，共檢測到4～5條EST酶帶，EST5僅在1號魚和2號魚中有檢出，EST1～EST4為5尾樣本魚的共有酶帶，EST3表達(dá)活性最強(qiáng)，EST2和EST4表達(dá)活性居中，其余2條酶帶表達(dá)活性最弱(圖3-E).

A、B、C、D、E分別表示心臟、眼睛晶狀體、肌肉、脾臟和肝臟EST酶譜；1～5泳道分別表示不同個體的酶譜.A,B,C,D,and E show electrophoretograms of EST isozymes expressed in heart,eye,muscle,spleen and liver respectively.1～5 show the zymograms of different individuals.圖3 匙吻鱘5種組織EST電泳圖譜Figure 3 Electrophoretogram of EST isozymes expressed in five tissues of Polyodon spathuln

2.4 匙吻鱘生化遺傳標(biāo)記

本研究中5尾樣本魚心臟、眼晶狀體、肌肉和脾臟組織中LDH酶帶均有多態(tài)，表現(xiàn)在不同樣本魚之間LDH酶帶數(shù)不同，或者即使酶帶數(shù)相同但表達(dá)活性程度不同(圖2).所有樣本魚肝臟中LDH酶帶數(shù)和表達(dá)活性雖都相同，但有拖帶，分離效果并不理想(圖2-E)，而且肝臟成分相對較為復(fù)雜，離心后容易形成脂肪層，吸取上清液電泳時容易引入雜質(zhì)影響電泳效果.5尾樣本魚的眼晶狀體組織中未檢測到EST的表達(dá)(圖3-B)，肌肉中EST表達(dá)活性很低(圖3-C)，而且肌肉和肝臟中EST的表達(dá)呈現(xiàn)出個體差異性(圖3-C～E)，不適宜作為匙吻鱘的特征生化遺傳參數(shù).而脾臟中雖然各樣本魚EST表達(dá)的酶帶條數(shù)和活性相同，但有拖帶，分離效果欠佳(圖3-D).5尾樣本魚心臟中EST表達(dá)活性和酶帶條數(shù)都相同，為單態(tài)，而且酶帶清晰，分離效果好(圖3-A)，因此擬采用心臟EST作為從生化遺傳層面鑒定匙吻鱘種質(zhì)的考察指標(biāo).進(jìn)一步選取30尾樣本魚的心臟組織在相同實驗條件下電泳，以確定30尾匙吻鱘心臟組織EST酶帶表達(dá)情況，所有樣本魚心臟組織EST同工酶表達(dá)情況相同，隨機(jī)選取10尾樣本魚心臟組織EST圖譜見圖4，所有樣本魚EST酶帶數(shù)和表達(dá)活性程度相同.因此，本研究采用心臟組織EST作為鑒定匙吻鱘種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記.

1～10泳道分別表示不同個體的酶譜.1～10 show the zymograms of different individuals.圖4 匙吻鱘心臟組織EST電泳圖譜Figure 4 Electrophoretogram of EST isozymes expressed in heart from Polyodon spathuln

3 討論

3.1 匙吻鱘的形態(tài)學(xué)比較

3.1.1 匙吻鱘形態(tài)特征比較 通過與文獻(xiàn)中已報道匙吻鱘的形態(tài)特征比較，本研究結(jié)果與已有文獻(xiàn)在可數(shù)性狀方面比較接近，不同之處主要在可量性狀比值方面.本研究與王學(xué)功等[4]的研究結(jié)果相比，除體長/吻長外，其他諸如體長/體高、體長/頭長等參數(shù)的變動范圍，兩者的研究結(jié)果吻合，但本研究與王學(xué)功[4]關(guān)于體長/吻長的研究結(jié)果分別為2.37～2.96和1.13～2.39.本研究結(jié)果與董宏偉[8]的研究結(jié)果相比，除體長/頭長、尾柄長/尾柄寬外，其他諸如體長/體高、吻長/吻寬等參數(shù)的變動范圍，兩者的研究結(jié)果吻合，但本研究與董宏偉[8]關(guān)于體長/頭長的研究結(jié)果分別為1.63～1.89和4.76～5.75，關(guān)于尾柄長/尾柄寬的研究結(jié)果分別為1.36～2.21和1.14～1.30.造成這一差異的原因可能與所測樣本魚的規(guī)格和樣本量大小有關(guān).如本研究、王學(xué)功[4]、董宏偉[8]所測樣本魚的體長范圍分別為37.8～55.8、34.9～69.7、47.7～49.6 cm，樣本量分別為31尾、不詳和10尾.也可能是由于三者的測量方法不同，尤其是對同一個參數(shù)的測量起始和終末點的認(rèn)識和界定不同，導(dǎo)致測量結(jié)果差異.鑒于此，建議研究魚類形態(tài)特征時嚴(yán)格遵照《GB/T 18654.3-2008養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗·第3部分：性狀測定》[13]中關(guān)于各可量性狀參數(shù)的國標(biāo)方法進(jìn)行測定.

3.1.2 與白鱘形態(tài)比較 鱘形目魚類現(xiàn)存2科即匙吻鱘科(Polyodontidae)和鱘科(Acipenseridae)，而匙吻鱘科下分2屬2種，匙吻鱘屬(Polyodon)的匙吻鱘(Polyodonspathuln)和白鱘屬(Psephurus)的白鱘(Psephurusgladius).兩者外部形態(tài)特征相同之處：吻都較長，體表均裸露無鱗，腹部皆為灰白色；背鰭均靠后，離尾鰭較近；腹鰭起點均在背鰭起點前下方；身體均在腹鰭前渾圓，自腹鰭后逐漸變細(xì)；尾鰭均為歪形尾，上葉長于下葉；兩者眼睛都很小，視覺不發(fā)達(dá)；口都較大，位于吻末端腹面.兩者外部形態(tài)不同之處見表2.

匙吻鱘主要生活在淡水中，性情相對溫順，喜歡棲息在流速中等的水體中，主要攝食浮游動物.白鱘屬江海洄游型魚類，以淡水生活為主，健勇兇猛，為單純的動物食性，以魚類為主要食物，其次是蝦蟹[11].分析認(rèn)為匙吻鱘與白鱘形態(tài)上的差異與其生態(tài)環(huán)境以及食性有關(guān)，如白鱘吻端較尖、略向上翹與其游泳速度快、洄游距離長相適應(yīng).匙吻鱘吻端圓滑、呈扁平漿狀與其游泳速度相對較慢、性情較為溫順相關(guān).白鱘口中有牙，而匙吻鱘僅在幼體時有牙，這與兩者食性不同密切相關(guān).

表2 匙吻鱘與白鱘外部形態(tài)特征比較

3.2 同工酶表達(dá)的組織特異性

本研究發(fā)現(xiàn)匙吻鱘的各主要組織中均有LDH同工酶檢出(圖2)，由此可以看出匙吻鱘體內(nèi)廣泛分布著LDH同工酶，而EST同工酶在除眼晶狀體外的4種組織中有表達(dá).本研究中匙吻鱘LDH和EST同工酶的表達(dá)具有組織特異性，表現(xiàn)在同一個體的不同組織中即使同一種同工酶表達(dá)的酶帶數(shù)和活性程度不同.如匙吻鱘心臟中共有3～4LDH條酶帶檢出(圖2-A)，而其肌肉中僅檢測到1～2條LDH酶帶(圖2-C)，肌肉LDH表達(dá)活性程度比其它組織弱，相應(yīng)的表現(xiàn)在其酶帶著色淺和染色時顯色最慢.匙吻鱘EST同工酶的表達(dá)也表現(xiàn)出組織特異性(圖3)，如本研究中心臟和肝臟中EST酶帶表達(dá)活性都比肌肉組織強(qiáng)(圖3)，張海花[12]在研究匙吻鱘4種組織酯酶時也得到同樣的結(jié)果.EST同功酶能通過水解大量非生理存在的脂類化合物具有解毒功能，而肝臟是重要的解毒器官，自然要求其中EST同功酶的表達(dá)活性較高，而肌肉沒有解毒功能，相應(yīng)其EST同功酶的表達(dá)活性也較低，所以某組織或器官同工酶表達(dá)活性與其行使相應(yīng)生理功能密切相關(guān).造成這種組織特異性表達(dá)的原因可能是由于組織或者器官中同工酶的表達(dá)受到遺傳基因的調(diào)控，然而酶基因的表達(dá)對組織或器官有選擇性，僅在一些專屬的組織或器官中有表達(dá)；另一方面也不排除是為便于不同組織行使不同的生理功能，從而使遺傳因子表達(dá)后受到不同基因的調(diào)控，因而造成組織或器官間同類同工酶在含量和活性表達(dá)上的不同[17].

3.3 同工酶表達(dá)的個體差異性

本研究中匙吻鱘心臟、眼晶狀體、肌肉和脾臟組織LDH同工酶均表現(xiàn)出明顯的個體差異性(圖2)，表現(xiàn)在即使相同組織不同個體LDH同工酶酶帶數(shù)不同，表達(dá)活性也存在差異，如3號魚的心臟組織和脾臟LDH酶帶數(shù)分別為3條和4條，而5號魚分別為4條和5條(圖2-A，D).EST同工酶也存在類似的現(xiàn)象，如1號魚的肌肉和肝臟組織中EST同工酶酶帶數(shù)分別為2條和5條，而5號魚分別為1條和4條(圖3-C，E).個體差異性除表現(xiàn)在酶帶條數(shù)外，還表現(xiàn)在酶帶的表達(dá)活性程度上，如2號魚和5號魚脾臟組織中LDH2表達(dá)活性比其余3尾魚脾臟中LDH2表達(dá)活性強(qiáng)(圖2-D).其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)過類似現(xiàn)象，如余敏等[18]的研究.可見同工酶在同一物種不同個體相同組織中的表達(dá)存在差異，分析這一現(xiàn)象的原因，可能與處于不同生長發(fā)育階段、健康狀態(tài)、地理環(huán)境(生境)等因素有關(guān)[19-21].推測本研究中匙吻鱘同工酶表達(dá)的個體差異可能與不同樣本魚的規(guī)格或健康狀況有關(guān)，但具體原因有待進(jìn)一步探索.

3.4 匙吻鱘生化遺傳標(biāo)記

關(guān)于匙吻鱘生化遺傳標(biāo)記的研究，王學(xué)功等[4]報道了匙吻鱘心臟組織中EST有2個基因位點，其表現(xiàn)型為2條譜帶，這一研究結(jié)果與本研究吻合.此外張海花等[12]比較了高首鱘(Acipensertransmonstanus)、匙吻鱘和雜交鱘(Hdauricus♀×Aschrencki♂)心臟組織同工酶的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)高首鱘和匙吻鱘EST同工酶活力高于雜交鱘，3者呈現(xiàn)不同的多態(tài)性.這一研究結(jié)果佐證了心臟組織EST可作為匙吻鱘區(qū)別其他鱘魚生化遺傳標(biāo)記的可能性.本研究通過綜合比較匙吻鱘5種組織中LDH和EST的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：心臟組織EST同工酶酶帶清晰，分離效果好，表達(dá)穩(wěn)定，沒有個體差異，可作為鑒定匙吻鱘種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記，也可為制定匙吻鱘種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供生化遺傳指標(biāo)，該技術(shù)已運用在其它鱘類中.種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)“GB/T 32781-2016中華鱘”[22]和“GB/T 33111-2016達(dá)氏鱘”[23]中分別將中華鱘和達(dá)氏鱘的眼晶狀體蘋果酸脫氫酶(MDH)作為鑒定兩者種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記.趙金良[24]的研究表明，人工雌核發(fā)育團(tuán)頭魴與選育群體在酯酶上存在穩(wěn)定差異，并可將兩個群體酯酶上的差異作為區(qū)分兩者的生化遺傳標(biāo)記.Chen[25]發(fā)現(xiàn)，藏北高原色林錯裸鯉、納木錯裸鯉和錯鄂裸鯉的LDH、MDH和EST 3個酶譜均表現(xiàn)出種間的差異，而且在同一種群的不同個體間也存在明顯的分化.

4 結(jié)論

本研究采用觀察描述匙吻鱘外部形態(tài)特征、測定其可數(shù)、可量性狀，并與分類地位相近鱘類比較，研究結(jié)果可直觀的從形態(tài)學(xué)特征角度對匙吻鱘種質(zhì)鑒定提供參考指標(biāo).同時借助聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳對匙吻鱘5種組織(心臟、眼晶狀體、肌肉、脾臟和肝臟組織)LDH和EST進(jìn)行了分析，2種同工酶具有組織特異性，確定了心臟組織EST可作為鑒定匙吻鱘種質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記.本研究結(jié)果可為制定匙吻鱘種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù).