唐明文 賈 丹 余 燕 劉 玉 張小瑾 葉小丹 陳 生

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis IPF)是一種原因不明、病死率高、以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的疾病。研究表明，肺泡損傷修復(fù)中抗纖維化和致肺纖維化之間的平衡紊亂是IPF的主要發(fā)病機(jī)制[1]。各種生長(zhǎng)因子在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，尤其是TGF-β被認(rèn)為是關(guān)鍵的致纖維化因子[2]，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積促進(jìn)劑。血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)也在肺纖維化的行程中發(fā)揮著重要作用。TGF-β1與PDGF二者之間呈正相關(guān)的關(guān)系，共同促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生、進(jìn)展。因此探討與研究影響TGF-β1與PDGF表達(dá)的抗肺纖維化藥可作為目前治療肺纖維化的一個(gè)突破口。2018年11月至2019年1月通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察補(bǔ)肺化纖飲對(duì)肺纖維化大鼠TGF-β1與PDGF表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

37只6～7周齡KM雄鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；博萊霉素(上海生工；A606211)；甲強(qiáng)龍(主要成分甲潑尼龍琥珀酸鈉；Pfizer Manufacturing Belgium NV；注冊(cè)證號(hào)H20170197)；TGF-β1抗體(GTX45121)；PDGFB抗體(ab21234)；補(bǔ)肺化纖飲藥劑由深圳市中醫(yī)院呼吸科提供(原藥125g熬制成150ml藥劑)。

2.實(shí)驗(yàn)分組

A組：基礎(chǔ)對(duì)照組6只(A1～A6)。

B組：模型組6只(B1～B6)。

C組：甲強(qiáng)龍治療組7只(C1～C7)。

D組：低劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組9只(D1～D9)。

E組：高劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組9只(E1～E9)。

3.實(shí)驗(yàn)處理

3.1 小鼠肺纖維化動(dòng)物模型制作 造模前每只KM雄鼠稱(chēng)重，以水合氯醛行麻醉手術(shù)，經(jīng)氣管插管后向肺部霧化噴入終濃度為8mg/kg的博來(lái)霉素進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)形成肺纖維化，10天后行第二次博來(lái)霉素噴霧誘導(dǎo)連續(xù)造模。

3.2 第二次給博萊霉素后第二天開(kāi)始給藥 按照實(shí)驗(yàn)分組，A組和B組每天灌胃生理鹽水1ml；C組每天灌胃1mg/kg甲強(qiáng)龍；D組每天灌胃10g/kg補(bǔ)肺化纖飲；E組每天灌胃20g/kg補(bǔ)肺化纖飲，各組均給藥10天。給藥結(jié)束后第2天處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取肺組織用生理鹽水清理殘留血液后置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定，并包埋切片。

4.檢測(cè)指標(biāo)和方法

4.1 肺組織切片行Masson染色

4.2 肺組織切片進(jìn)行TGF-β1和PDGFB免疫組化檢測(cè) 免疫組化染色的半定量判定：A染色強(qiáng)度：無(wú)色、淡黃、棕黃、棕褐分別計(jì)為0分、1分、2分、3分；B染色廣度：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1 Masson染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。

注：A組：基礎(chǔ)對(duì)照組，B組：模型組 ，C組：甲強(qiáng)龍治療組，D組：低劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組，E組：高劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組。圖1 Masson染色結(jié)果

5.2 TGF-β1和PDGFB免疫組化檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2，圖3。

注：A組：基礎(chǔ)對(duì)照組，B組：模型組 ，C組：甲強(qiáng)龍治療組，D組：低劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組，E組：高劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組。圖2 TGF-β1免疫組化檢測(cè)結(jié)果

注：A組：基礎(chǔ)對(duì)照組，B組：模型組 ，C組：甲強(qiáng)龍治療組，D組：低劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組，E組：高劑量補(bǔ)肺化纖飲治療組。圖3 PDGFB免疫組化檢測(cè)結(jié)果

5.3 各組小鼠肺組織TGF-β1和PDGFB蛋白的表達(dá)水平 見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺組織TGF-β1和PDGFB蛋白的表達(dá)水平

6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

低劑量和高劑量治療組分別對(duì)比模型組肺組織TGF-β1和PDGFB蛋白的表達(dá)水平均明顯減低，兩組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示補(bǔ)肺化纖飲可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的膠原合成，減少肺細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，阻斷血小板衍生因子的絲分裂，從而抑制肺纖維化進(jìn)程。

7.討論

肺纖維化屬于纖維增殖性疾病的范疇,其病變主要累及肺間質(zhì),也可累及肺泡上皮細(xì)胞及肺血管,以肺成纖維細(xì)胞的異常增生和膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為主要表現(xiàn),病程一般呈進(jìn)行性發(fā)展，最終導(dǎo)致呼吸功能衰竭而死亡[3]。隨著污染、環(huán)境惡化等因素，肺纖維化已成為當(dāng)今嚴(yán)峻的健康問(wèn)題，但長(zhǎng)期以來(lái)無(wú)藥可醫(yī)。2014年10月,美國(guó)FDA批準(zhǔn)吡非尼酮和尼達(dá)尼布用于特發(fā)性肺纖維化的治療[4],也只能延緩肺纖維化發(fā)展的進(jìn)程。因西醫(yī)治療手段有限，中藥及天然植物中提取有效單體成分已成為纖維化疾病治療的新途徑。中醫(yī)藥古籍中并無(wú)“肺纖維化”一詞,根據(jù)其臨床癥狀,中醫(yī)常將其歸為“肺痹”或“肺痿”,且多認(rèn)為“肺痹”為肺纖維化的中早期階段,“肺痿”為中晚期階段[5]。在“龍江醫(yī)派”學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下，我課題組歷經(jīng)20余年,對(duì)肺纖維化進(jìn)行了大量的臨床、實(shí)驗(yàn)研究，并與廣州呼吸病研究所建立重大疾病(肺纖維化)合作攻關(guān)研究，認(rèn)為其病機(jī)為“肺虛痰瘀”，或因外邪侵襲，或因情志內(nèi)傷、病久體虧，肺氣虧虛，氣虛則血行無(wú)力，瘀血內(nèi)生；子病及母，肺虛及脾，脾虛運(yùn)化失司，水濕不運(yùn)，痰濁內(nèi)生，就則痰瘀互結(jié)，脈絡(luò)瘀阻；最終導(dǎo)致肺氣虛→痰瘀阻絡(luò)→肺氣愈虛→痰瘀阻絡(luò)愈甚的惡性循環(huán)局面。治療上則以“補(bǔ)肺化瘀滌痰”為法，擬定補(bǔ)肺化纖飲為主方。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究，中藥復(fù)方補(bǔ)肺化纖飲對(duì)肺纖維化大鼠TGF-β1、PDGF表達(dá)影響十分明顯，為臨床進(jìn)一步研究提供安全有效的抗肺纖維化的中藥復(fù)方制劑，進(jìn)而為IPF的治療提供良好的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。