王玉奎 張賀翠 白曉璟 廉小平 施松梅 劉倩瑩 左同鴻 朱利泉,*

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甘藍(lán)家族基因的特征和表達(dá)分析

王玉奎1,**張賀翠1,**白曉璟1廉小平2施松梅2劉倩瑩1左同鴻1朱利泉1,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2西南大學(xué)園藝園林學(xué)院, 重慶 400100

為了探索植物生長素極性運(yùn)輸載體蛋白編碼基因家族參與甘藍(lán)自交不親和性的成員數(shù)目與參與方式, 本文通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得家族在甘藍(lán)自花和異花授粉后的表達(dá)情況, 利用分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法對該家族的基因結(jié)構(gòu)、蛋白進(jìn)化親緣關(guān)系和表達(dá)模式等特征進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 甘藍(lán)基因家族包含8個成員, 含有5~9個外顯子和4~8個內(nèi)含子; 其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)在350~650之間, 相對分子質(zhì)量為38~70 kD; 除了BoPIN5和BoPIN8不含中間親水區(qū)以外, 其余6個BoPINs家族成員都含有位于兩端的疏水區(qū)和中間親水環(huán), 它們可能以膜錨定蛋白的形式發(fā)揮作用; 甘藍(lán)與蕪菁、擬南芥基因家族親緣關(guān)系較近; 染色體定位分析表明,、和與S位點(diǎn)之間發(fā)生不同程度的連鎖; 啟動子活性分析表明, BoPINs家族蛋白參與甘藍(lán)SI反應(yīng), 可能受IAA、ABA等激素相互交叉影響;、、、、、、、和在柱頭中表達(dá)量均較高; 數(shù)據(jù)表達(dá)譜和熒光定量分析表明, 8個家族成員中的6個基因在自花授粉后下調(diào)表達(dá); 自花授粉后柱頭生長素含量降低, 與SI反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。因此, 在甘藍(lán)家族的8個成員中有6個基因家族成員可能在膜上以負(fù)調(diào)節(jié)方式調(diào)控自交不親和反應(yīng)。

甘藍(lán); 生長素; 自花授粉;家族; 自交不親和

生長素是植物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)劑, 在植物的胚胎發(fā)育、頂端分生組織和微管組織分化等過程中扮演重要角色, 尤其是在調(diào)控雌蕊發(fā)育、花粉萌發(fā)和花粉管生長方面發(fā)揮重要作用[1-2]。生長素在細(xì)胞之間呈不對稱分布-即存在生長素濃度梯度, 這種分布模式是生長素合成代謝及極性運(yùn)輸?shù)墓餐Y(jié)果。主要以特定質(zhì)膜結(jié)合極性運(yùn)輸載體介導(dǎo)生長素在細(xì)胞間移動實(shí)現(xiàn)在組織中的不對稱分布[3]。外源生長素常常抑制花器官的發(fā)育, Okada等[4]研究發(fā)現(xiàn)生長素極性運(yùn)輸抑制劑N-1-氨甲酰苯甲酸萘酯(N-1- naphthylphthalamic acid, NPA)處理會導(dǎo)致擬南芥原基分化和發(fā)育異常, 輸出載體PIN1(pin-formed 1)的弱突變體花發(fā)育異常、花柱缺失、雌蕊內(nèi)沒有胚珠, 而強(qiáng)突變體將不能起始花發(fā)育, 形成針狀花序?；ㄔ纬珊? 生長素在花的發(fā)育和性別方面擔(dān)負(fù)著重要角色, 直接或間接地參與花粉與雌蕊之間的相互作用[5-7]。有研究表明, 通過改變可可樹中生長素濃度梯度可能會影響或控制自交不親和性(self-incompatibility)[8]。生長素反應(yīng)因子(auxin response factor, ARF3)以非細(xì)胞自主調(diào)節(jié)方式抑制生長素應(yīng)答報告基因表達(dá), 從而促進(jìn)十字花科植物自花花粉的排斥反應(yīng)[9]。這是自交不親和途徑與生長素信號傳導(dǎo)途徑之間存在交叉的重大突破。迄今為止, 對于生長素相關(guān)基因是否參與甘藍(lán)自交不親和途徑鮮有報道。PINs家族作為生長素極性運(yùn)輸載體調(diào)節(jié)生長素分布的重要家族蛋白, 通過調(diào)節(jié)生長素的時空分布影響器官發(fā)生、胚胎發(fā)育、根系發(fā)育和花系統(tǒng)形成[10]。擬南芥PINs家族蛋白的功能、定位以及基因缺失導(dǎo)致的生理表型除了PIN6外均已報道[11]。但該家族是否可能通過改變植物體內(nèi)的生長素濃度梯度和生長素極性分布來影響自交不親和反應(yīng)目前還不是十分清楚。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析甘藍(lán)親和授粉和不親和授粉后得到的家族基因的表達(dá)情況, 以確定該家族中某些生長素極性運(yùn)輸載體基因是否可能參與自交不親和反應(yīng); 利用模式植物中功能已知的擬南芥AtPINs蛋白家族為參考序列, 對BoPIN蛋白家族的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、進(jìn)化分析、組織特異性表達(dá)分析和功能分析, 以期進(jìn)一步明確家族基因的特征及其與自交不親和性之間的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

甘藍(lán)高度自交不親和系A(chǔ)4和F1植株由西南大學(xué)十字花科研究所提供, 于2017年3月下旬在開花前1~2 d對長勢一致的A4植株人工去雄, 然后分別取A4和F1植株的花粉對A4植株的柱頭人工授粉, 稱為自花授粉(self-pollnation, SI)和異花授粉(cross-pollnation, CP)。授粉時間為0、15、30和60 min。授粉結(jié)束后快速掃去柱頭上的花粉, 立即置液氮中保存。分別提取上述處理的甘藍(lán)柱頭RNA, 并送北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2 甘藍(lán)BoPIN家族基因序列的收集

通過擬南芥數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥AtPIN家族蛋白的氨基酸序列, 進(jìn)行BLASTp檢索; 同時與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所獲得CDS序列比對, 獲取甘藍(lán)家族轉(zhuǎn)錄組號。

1.3 數(shù)字表達(dá)譜測序分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中家族的FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)值結(jié)果, 采用Multiple Array Viewer軟件繪制熱圖, 進(jìn)行表達(dá)聚類分析。

1.4 甘藍(lán)BoPIN家族成員的序列分析、在染色體上的分布分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

用Editseq軟件進(jìn)行ORF查詢, 利用ExPASy (http://Hwww.expasy.org/tools)中的proPram (http://web. expasy.org/protparam/)分析BoPINs蛋白的理化性質(zhì)。使用WOLF PSORT (http://www.genscript.com/wolf-psort.html)分析亞細(xì)胞定位。采用Mapchart分析BoPINs家族成員在染色體上的分布。利用GSDS在線軟件(http://gsds1.cbi. pku.edu.cn/)分析基因結(jié)構(gòu)。利用Smart (http://smart.embl- heidelberg.de/)和NCBI Conserved Domain Search對BoPINs家族成員進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測和保守序列分析。利用MEGA6.0軟件選用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析, 校驗(yàn)參數(shù)為Bootstrap=1000。

1.5 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR檢測

按照THUNDERBIRD SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒說明書, 利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計家族熒光定量PCR引物(附表)。反應(yīng)體系包含1 μL濃度為100 ng μL-1cDNA模板、SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL和無RNA酶水8 μL。qPCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40個循環(huán), 以上反應(yīng)每個樣品3次平行重復(fù)。選取作為內(nèi)參基因, 按照2–ΔΔCT法計算家族的相對表達(dá)量[12]。

1.6 BoPINs家族啟動子活性分析

從NCBI甘藍(lán)基因組中下載基因轉(zhuǎn)錄起始位置上游1500 bp的序列, 并利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行順式作用元件分析。

1.7 BoPINs家族的組織特異性表達(dá)分析

對自花授粉后的柱頭、花瓣、萼片、葉片、花蕾和花藥各個組織進(jìn)行熒光定量PCR檢測, 分析在家族不同組織中的表達(dá)模式。利用熱圖軟件進(jìn)行表達(dá)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoPINs家族的基本特征分析

通過擬南芥數(shù)據(jù)庫家族的氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對(取E-value≤1×10–20), 結(jié)合甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫序列, 從甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定出8個家族基因[13-15]。根據(jù)它們的染色體位置, 將、和的同源拷貝依次命名為、、、、和。其編碼多肽鏈的氨基酸殘基數(shù)在350~650之間, 相對分子質(zhì)量為38~70 kD。編碼氨基酸鏈最長的是BoPIN2, 其相對分子質(zhì)量為70.46 kD; 編碼氨基酸鏈最短的是BoPIN8, 其相對分子質(zhì)量為38.22 kD。BoPINs蛋白的理論等電點(diǎn)(pI)在6~9之間。不穩(wěn)定系數(shù)分析發(fā)現(xiàn), 大部分BoPINs蛋白為穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)小于40), 只有BoPIN1-1和BoPIN5屬于不穩(wěn)定蛋白。根據(jù)親水性指數(shù)(GRAVY為負(fù)值表示親水性, 正值表示疏水性, 介于-0.5 ~ +0.5的為兩性蛋白)的原則, 發(fā)現(xiàn)BoPIN5和BoPIN8蛋白為疏水性蛋白, 其余BoPIN家族蛋白均為兩性蛋白[16]。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析表明,BoPIN1-1、BoPIN1-2、BoPIN2、BoPIN3、BoPIN4、BoPIN7-1和BoPIN7-2定位于細(xì)胞膜; BoPIN5、BoPIN6和BoPIN8定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[17-18](表1)。SignalP在線工具分析顯示, BoPINs家族蛋白都不存在信號肽, 均為非分泌型蛋白。

2.2 甘藍(lán)BoPINs的基因結(jié)構(gòu)和蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CDS序列, 結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中的甘藍(lán)基因組信息, 序列比對分析甘藍(lán)家族成員的基因結(jié)構(gòu)特征。由圖1可知,、、和均具有6個外顯子和5個內(nèi)含子;具有9個外顯子和8個內(nèi)含子;具有7個外顯子和6個內(nèi)含子;具有5個外顯子和4個內(nèi)含子; 因此甘藍(lán)家族成員的基因均含有數(shù)目不等的外顯子和內(nèi)含子, 且數(shù)目差別明顯, 甘藍(lán)BoPINs蛋白結(jié)構(gòu)特征存在于其外顯子編碼的氨基酸序列變異中。以系數(shù)0.54為標(biāo)準(zhǔn), BoPIN1-1、BoPIN3-1、BoPIN3-2、BoPIN4、BoPIN5、BoPIN7-1和BoPIN7-2的進(jìn)化關(guān)系相近, BoPIN5和BoPIN8進(jìn)化關(guān)系相近。

表1 甘藍(lán)BoPINs家族蛋白信息

圖1 甘藍(lán)BoPINs的進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)圖

左側(cè)為進(jìn)化樹, 用MEGA6.0軟件構(gòu)建; 右側(cè)為甘藍(lán)家族的基因結(jié)構(gòu)圖。

The phylogenetic tree is constructed with MEGA6.0 software on the left and the gene structure map of thefamily on the right.

為了更好理解不同植物PIN蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系, 利用MEGA6.0軟件對十字花科植物(甘藍(lán)、擬南芥、蕪菁、蘿卜)、單子葉植物(玉米、水稻) 6種植物共55個PIN蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。表明甘藍(lán)BoPINs與蕪菁BrPINs、擬南芥AtPINs和蘿卜親緣關(guān)系最近, 與玉米ZmPINs、水稻OsPINs親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以水稻OsPIN9為外群, 按照親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的原則分為6組, 第I組是14個十字花科特異性組, BoPIN3和BoPIN7在進(jìn)化過程中發(fā)生基因復(fù)制事件; 第II、III組均有單子葉植物和十字花科植物聚類在一起, 表明PIN1、PIN2在物種進(jìn)化過程中未發(fā)生基因丟失事件; 第IV組包括4個十字花科物種, 表明PIN6只存在于十字花科植物中, 而不存在于以玉米、水稻為代表的單子葉植物中; 第V、VI組中AtPIN5和AtPIN8的直系同源物分別對應(yīng)甘藍(lán)BoPIN8和BoPIN5 (圖2)。

圖2 甘藍(lán)家族BoPINs的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 甘藍(lán)BoPINs家族基因成員的染色體定位

、、、、有1個拷貝;、和有2個同源拷貝,、、、、和分布在不同染色體上。從圖3可以看出, 甘藍(lán)自交不親和關(guān)鍵元件S位點(diǎn)糖蛋白(S-locus glycoprotein, SLG)、S半胱氨酸富集蛋白(S-locus cystine-rich protein, SCR)以及S位點(diǎn)受體激酶(S-locus receptor kinase, SRK)和家族成員主要集中在第6染色體上, 蕓薹屬自交不親和反應(yīng)受多態(tài)性S位點(diǎn)復(fù)等位基因控制。在第6染色體上存在一個多態(tài)性S位點(diǎn), 而該基因家族成員、、和都位于該多態(tài)性位點(diǎn)附近。按照1,000,000 nt為1 cM計算, 遺傳圖距分別是13.8、4.21、11.37和31.1 cM。這不同程度地連鎖反映了該家族基因與S位點(diǎn)的遺傳距離, 遺傳距離近的可能存在順式作用, 遺傳距離遠(yuǎn)的可能存在反式作用。

2.4 BoPINs家族自花授粉和異花授粉后的授粉依賴性表達(dá)

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到基因家族在自花和異花授粉0、15、30和60 min的表達(dá)模式。將家族基因的FPKM值均一化, 采用Multiple Array Viewer 軟件繪制熱圖(圖4)。在自花授粉后下調(diào), 在異花授粉后表達(dá)量變化不明顯。在自花授粉15~60 min劇烈下調(diào), 在60 min后表達(dá)量達(dá)到最低。在自花授粉0~60 min過程中下調(diào), 而異花授粉后15~60 min表達(dá)量上調(diào), 在異花授粉60 min時,達(dá)到了在未授粉時的表達(dá)量。、與表達(dá)模式一致。和在自花授粉0~60 min過程表達(dá)量下調(diào), 而異花授粉后15~60 min表達(dá)量上調(diào), 而后急劇下調(diào)。綜上所述, 在自花授粉0~60 min過程中,、、、、和處于下調(diào)狀態(tài), 這與自交不親和關(guān)鍵元件SRK (Bo6g101190)在自花授粉0~60 min的表達(dá)模式是一致的。

圖3 BoPINs家族在甘藍(lán)染色體的分布

圖4 BoPINs基因家族在自花授粉和異花授粉后的表達(dá)模式

為了進(jìn)一步確定甘藍(lán)家族在自花授粉和異花授粉處理后的表達(dá)模式, 利用熒光定量PCR對該基因家族進(jìn)行表達(dá)分析。、、、、和在自花授粉后顯著下調(diào)表達(dá), 在60 min后達(dá)到最低, 而在異花授粉后表達(dá)差異不大。在自花授粉后下調(diào)表達(dá), 在異花授粉后顯著上調(diào)表達(dá)。在自花授粉后的表達(dá)模式與異花授粉后的表達(dá)模式呈現(xiàn)出相反的趨勢。在自花授粉后顯著上調(diào)表達(dá), 在30 min達(dá)到最高而后急劇下調(diào)表達(dá), 異花授粉后表達(dá)量差異不顯著(圖5), 說明、、、、、和的表達(dá)受到SI的抑制, 而基因的表達(dá)既受到SI抑制還受到CP促進(jìn),基因的表達(dá)受到與相反的調(diào)控,基因受SI抑制具有先期時限性。

2.5 BoPINs家族的啟動子順式作用元件分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500 bp的序列, 結(jié)合PlantCARE在線軟件分析該家族啟動子的順式作用元件研究是否受自花授粉顯著誘導(dǎo)。由表2可知,包含光、ABA、IAA、水楊酸、脫落酸、赤霉素、脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。其中、、和含有生長素響應(yīng)相關(guān)元件, 除了其余基因家族成員都含有脅迫響應(yīng)相關(guān)元件。表明BoPINs家族蛋白可能受IAA、ABA等激素相互交叉影響參與甘藍(lán)SI反應(yīng)[19-20]。

2.6 BoPINs家族的組織特異性表達(dá)分析

為了探究在自花授粉后甘藍(lán)基因家族在不同組織中的表達(dá)量, 利用qRT-PCR技術(shù)對甘藍(lán)基因家族在花蕾、花藥、萼片、花瓣、葉片和柱頭6種組織進(jìn)行特異性表達(dá)分析, 將熒光定量所得數(shù)據(jù)均一化進(jìn)行數(shù)據(jù)表達(dá)譜分析。在萼片中表達(dá)量最高, 在花瓣中表達(dá)量最低;在花藥中表達(dá)量最高, 在花瓣中表達(dá)量最低;在柱頭的表達(dá)量最高, 在花粉和花瓣的表達(dá)量較低;和在柱頭的表達(dá)量最高, 花粉次之, 在花瓣的表達(dá)量最低;在花蕾和萼片的表達(dá)量最高, 在柱頭和花瓣的表達(dá)量最低。、、、、、、和在柱頭的表達(dá)量高于其他組織(圖6)。結(jié)合該家族在授粉后各個時期的表達(dá)模式表明該家族部分成員可能參與自交不親和反應(yīng)。

圖5 甘藍(lán)BoPINs家族在自花和異花授粉后的表達(dá)分析

SI: self-pollination; CP: cross-pollination.

表2 BoPINs基因啟動子的順式作用元件

圖6 BoPINs基因家族成員在自花授粉后不同組織中的表達(dá)量分析

2.7 甘藍(lán)柱頭授粉后生長素含量的變化

色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Tryptophan aminotransferase, TAA1)通過吲哚丙酮酸途徑(indole-3-pyruvate, IPA)參與生長素的合成, 它將Trp轉(zhuǎn)化成IPA, 從而參與生長素生物合成。TAA1的mRNA的含量與生長素含量成正比關(guān)系[21-22]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的TAA1的mRNA來表征柱頭授粉后的生長素含量變化。結(jié)果表明(圖7), 在自花授粉后TAA1的mRNA含量一直降低, 異花授粉后mRNA含量變化不明顯, 說明甘藍(lán)柱頭在自花授粉后生長素含量降低, 與SI反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。

圖7 柱頭授粉后生長素生物合成關(guān)鍵酶TAA1的mRNA含量變化

3 討論

本研究在自花授粉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中首次獲得甘藍(lán)生長素輸出載體基因家族8個成員。在其他植物中, 研究發(fā)現(xiàn)生長素在花粉發(fā)育、花粉管生長和花序維管組織發(fā)育等生物過程起著關(guān)鍵作用, 已有研究表明, 梨自花授粉后柱頭內(nèi)的IAA含量變化較顯著, 在可可樹自花授粉后生長素含量減少, 乙烯含量增加, 可可樹自交不親和性受生長素調(diào)節(jié)控制[23-24]。IAA在煙草自交不親和的花粉與柱頭的識別過程中出現(xiàn)了相似的顯著變化[25], 在本文中首次發(fā)現(xiàn),、、、、等成員的表達(dá)量與自交不親和性之間存在負(fù)相關(guān), 從表達(dá)量和功能研究兩方面印證了柱頭表面細(xì)胞內(nèi)未知的生長素響應(yīng)元件的抑制促進(jìn)了柱頭對自身花粉的抑制作用[26]。

生長素輸出載體基因編碼一類生長素極性運(yùn)輸跨膜蛋白, 它是細(xì)胞內(nèi)IAA運(yùn)輸?shù)桨獾年P(guān)鍵載體因子。PINs家族作為生長素信號傳導(dǎo)通路中主要的輸出載體蛋白, 通過對生長素濃度梯度極性分布調(diào)節(jié), 參與包括SI在內(nèi)的諸多植物生理過程。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析, 獲得了8個甘藍(lán)的家族成員。除了BoPIN5和BoPIN8蛋白缺失了中間親水區(qū), 其他蛋白均含有兩端疏水結(jié)合區(qū)和中間親水環(huán)。進(jìn)化分析表明, 除BoPIN5與AtPIN8親緣關(guān)系最近、BoPIN8和AtPIN5親緣關(guān)系最為密切之外, 其他BoPINs家族都與AtPINs家族同屬同一進(jìn)化分支, 也存在較近的親緣關(guān)系。啟動子活性分析表明基因家族受多種植物激素相互交叉影響參與自交不親和反應(yīng)。染色體定位分析表明,主要定位于第2、第4、第6和第9染色體上, 其中、和定位于第6染色體上, 而自交不親和關(guān)鍵元件、、均位于第6染色體上, 與S位點(diǎn)基因存在緊密連鎖性?？赡軈⑴c自花授粉響應(yīng), 調(diào)節(jié)柱頭乳突細(xì)胞的生長素濃度梯度和花器官內(nèi)生長素的時空分布。PINs家族蛋白在自花授粉后下調(diào)表達(dá)可能是胞內(nèi)生長素的濃度反饋調(diào)節(jié)基因表達(dá)引起[27]。生長素對基因表達(dá)調(diào)節(jié)可能與(plethora)基因有關(guān), PLT蛋白是一類含有AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子, 是根尖干細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育主要決定因子。在雙突變體中, 根尖干細(xì)胞缺失, 根系發(fā)育異常, PIN1、PIN4和PIN7的蛋白表達(dá)量明顯降低。這種反饋模式對于維持植物細(xì)胞生長素梯度平衡至關(guān)重要[28]。PIN蛋白表達(dá)量受諸多因素影響, 如生長素的反饋調(diào)節(jié)、生長素自身分布和生長素信號[29-30]。PIN蛋白作為ARF和Aux/IAA蛋白下游信號元件, ARF直接或間接地促進(jìn)PIN蛋白的表達(dá), Aux/IAA蛋白通過泛素蛋白降解途徑抑制PINs蛋白表達(dá)[31]。有研究表明ARF3 (ETTIN)和ARF5 (MONOPTEOS) 可以直接靶向激活、和的表達(dá), 特別是ARF3作為增強(qiáng)SI反應(yīng)的雌蕊發(fā)育調(diào)節(jié)因子,、和可能作為靶向基因下調(diào)生長素反應(yīng)促進(jìn)自花花粉的抑制[32-33]。PIN蛋白的極性定位與囊泡運(yùn)輸密切相關(guān), 當(dāng)用囊泡運(yùn)輸抑制劑BFA (brefeldin)處理時, 膜定位的PIN1、PIN3等可逆地在胞質(zhì)內(nèi)聚集, 用生長素抑制劑(NPA)處理會導(dǎo)致PIN1的持續(xù)內(nèi)在化[34]。擬南芥GNOM/EMB30缺失突變體中定位異常, 表現(xiàn)出極性運(yùn)輸缺失相似的表型, 例如胚胎發(fā)育異常、器官融合等。GNOM介導(dǎo)下游的SNX1 (sorting nexin 1)調(diào)節(jié)VPS29 (vaculolar protein sorting 29)蛋白, 從而調(diào)節(jié)PIN1在胞內(nèi)的極性定位, 影響生長素的極性運(yùn)輸[35-36]。通過酵母雙雜技術(shù)篩選出SNX1能與SRK發(fā)生相互作用, 進(jìn)一步研究證明了PIN1可能作為自交不親和關(guān)鍵元件SRK的下游信號元件抑制生長素反應(yīng)增強(qiáng)SI[37-38]。PID (PINOID)過表達(dá)植株中PIN蛋白極性定位發(fā)生變化, 植物體內(nèi)生長素濃度梯度紊亂, 胚胎和幼苗根發(fā)育嚴(yán)重缺陷, 與磷酸酶PP2A (protein phosphatase 2A)功能缺失突變體表型類似。PID蛋白激酶與磷酸酶PP2A以相反的方式調(diào)節(jié)PIN蛋白的磷酸化與去磷酸化, 改變PIN親水環(huán)磷酸化位點(diǎn)的氨基酸序列, 可以破壞PIN蛋白的極性定位, 從而影響生長素的極性運(yùn)輸[39]?？偠灾? 植物體內(nèi)生長素極性運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)可通過調(diào)控PIN蛋白的量或定位實(shí)現(xiàn)對生長素濃度分布的精細(xì)調(diào)控。

、、、、、、、和在自花授粉后柱頭中表達(dá)量較高, 且在自花授粉后顯著下調(diào)表達(dá), 表明在自花授粉后未知生長素信號反應(yīng)蛋白反饋抑制家族極性運(yùn)輸生長素, 導(dǎo)致柱頭乳突細(xì)胞內(nèi)生長素含量降低, 生長素含量與自交不親和性呈負(fù)相關(guān), 最終激活SRK下游未知信號通路導(dǎo)致自交不親和反應(yīng)。

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Characteristics and expression analysis offamily genes in

WANG Yu-Kui1,**, ZHANG He-Cui1,**, BAI Xiao-Jing1, LIAN Xiao-Ping2, SHI Song-Mei2, LIU Qian-Ying1, ZUO Tong-Hong1, and ZHU Li-Quan1,*

1College of Agriculture and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2College of Horticulture and Gardening, Southwest University, Chongqing 400100, China

In order to explore the number and expression of thegene family participating in self-incompatibilty of, their expression after self-pollination and cross-pollination were detected by transcriptome analysis, and the corresponding gene structure, phylogenetic tree and expression patterns of the family were further analyzed by bioinformatics. This gene family contained 5-9 exons and 4-8 introns. The amino acid of the encoding protein residues were between 350 and 650 and had molecular weights ranging from 38 kD to 70 kD. Except that BoPIN5 and BoPIN8 did not contain internal hydrophilic cytoplasmic regions, the remaining six BoPINs proteins contained a hydrophobic region at both ends and an internal hydrophilic ring, showing they located on membrane. The evolutionary analysis indicated thatwere closely related to theand thegene family. Chromosome localization analysis indicated that,,, andmembers of the family were linked to S-loucs to different degrees. Tissue-specific expression analysis indicated that,,,,,,,, andhad higher expression levels in the stigma. Data expression profiling and fluorescence quantitative analysis indicated that six of the eightgenes were down-regulated after self-pollination. All these results indicate that six members of the eightgene family members on the membrane may participate in the self-incompatibility response ofin a negative regulatory manner.

; auxin; self-pollination; BoPINs family; self-incompatibility

2018-10-15;

2019-04-15;

2019-04-26.

10.3724/SP.J.1006.2019.84129

朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 023-68250794

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

E-mail: wangyuk0808@163.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572127)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(XDJK2017C023)項(xiàng)目資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31572127) and the Basic Research Fund of the Central University (XDJK2017C023).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190426.0914.002.html