湯榮成，齊紅莉,2，王紅宇，鄭曉楠，李雪菡，王 茜

( 1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.中國(guó)海洋大學(xué)，海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，原生動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003 )

近年來(lái)，在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物的養(yǎng)殖中(魚類、甲殼類、藻類和海參等)，由纖毛蟲所導(dǎo)致的病害的發(fā)生范圍及危害程度均呈遞增趨勢(shì)[1-2]。褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)廣泛分布于半咸水和海水水域中，具有易培養(yǎng)、繁殖快、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，是理想的生物餌料[3-4]。在其培養(yǎng)過程中也經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)纖毛蟲病害，經(jīng)人工鑒定有海洋尾絲蟲(Uronemamarinum)和黃色偽角毛蟲(Pseudokeronopsisflava)[5-6]。海洋尾絲蟲屬盾纖目、尾絲蟲屬[5]，黃色偽角毛蟲屬腹毛亞綱、偽角毛蟲屬[6]。有關(guān)海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲的研究報(bào)道較多集中于形態(tài)分類學(xué)觀察及細(xì)胞發(fā)生[7-8]，關(guān)于其生態(tài)學(xué)方面的研究較少。藥物對(duì)纖毛蟲的毒性研究，國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，但多集中于腹毛類[9]、游仆類[10]、車輪蟲[11]等。硫酸鋅和三氯異氰尿酸作為常見的漁藥，其對(duì)水生生物毒性的研究報(bào)道較多集中于藻類、浮游動(dòng)物、魚類等方面[12-14]，目前關(guān)于硫酸鋅和三氯異氰尿酸對(duì)海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲急性毒性的研究尚未見報(bào)道。

筆者以褶皺臂尾輪蟲大規(guī)模培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲為研究對(duì)象，研究硫酸鋅與三氯異氰尿酸對(duì)褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲的急性毒性，以期為褶皺臂尾輪蟲的培養(yǎng)過程中海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲的暴發(fā)提供相應(yīng)的治理方法，同時(shí)也填補(bǔ)海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲的毒理學(xué)研究空白。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源及種群培養(yǎng)活化

褶皺臂尾輪蟲取自天津極地海昌海洋館的餌料培養(yǎng)室，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)經(jīng)鏡檢分離后進(jìn)行單克隆純種培養(yǎng)，鹽度30、pH 8.0±0.2、溶解氧5 mg/L，培養(yǎng)在溫度25 ℃、光照度2000 lx、光照周期14L∶10D的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲均取自天津市極地海洋館褶皺臂尾輪蟲培養(yǎng)池，經(jīng)活體觀察和蛋白銀染色鑒定到種，顯微分離純種并單克隆培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同褶皺臂尾輪蟲培養(yǎng)條件。

人工海水的配制：氯化鈉30.00 g、硫酸鎂3.00 g、氯化鈣0.72 g、氯化鉀0.259 g、碳酸氫鈉0.084 g、硼酸0.144 g、生石灰0.120 g、蒸餾水1000 g，經(jīng)0.22 μm的濾膜抽濾和高溫滅活后使用。

1.2 方法

采用水生生物毒性試驗(yàn)方法[15]，先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置正式試驗(yàn)的6個(gè)質(zhì)量濃度組(包括空白對(duì)照組和5個(gè)質(zhì)量濃度梯度組)。具體質(zhì)量濃度為：硫酸鋅對(duì)褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲、黃色偽角毛蟲的藥物質(zhì)量濃度分別為0.00、2.00、2.60、3.40、4.40、6.00 mg/L，0.00、1.80、2.40、3.20、4.40、5.60 mg/L和100.00、200.00、400.00、800.00、1000.00 mg/L；三氯異氰尿酸對(duì)褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲的藥物質(zhì)量濃度分別為0.00、0.30、0.60、0.80、0.90、1.00 mg/L，0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L和0.00、0.40、0.60、1.00、1.20、1.60 mg/L。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，每孔中加入3 mL鹽度30的人工海水，褶皺臂尾輪蟲和黃色偽角毛蟲接種密度為10個(gè)/mL、海洋尾絲蟲接種密度為200個(gè)/mL，試驗(yàn)開始連續(xù)觀察6 h，隨后每隔12 h觀察計(jì)數(shù)1次。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

急性毒性試驗(yàn)半致死質(zhì)量濃度采用概率單位法[15]，通過作圖分析獲得。用SPSS 20.0和Excel 2016作圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)觀察

經(jīng)硫酸鋅處理后，褶皺臂尾輪蟲運(yùn)動(dòng)速度受到一定的影響，硫酸鋅質(zhì)量濃度2.60 mg/L以下的試驗(yàn)組24 h時(shí)只有少部分褶皺臂尾輪蟲運(yùn)動(dòng)速度下降，但并未引起死亡；3.40 mg/L以上試驗(yàn)組褶皺臂尾輪蟲運(yùn)動(dòng)速度受到明顯的影響，6.00 mg/L試驗(yàn)組現(xiàn)象最為明顯，12 h時(shí)大部分褶皺臂尾輪蟲貼附于六孔板底部，運(yùn)動(dòng)緩慢，24 h死亡率為77.8%，72 h時(shí)全部死亡(圖1a)。

海洋尾絲蟲暴露于不同質(zhì)量濃度的硫酸鋅溶液，12 h時(shí)海洋尾絲蟲大量死亡，12 h時(shí)1.80、2.40、3.20、4.40、5.60 mg/L試驗(yàn)組的死亡率分別為39.0%、46.5%、53.2%、55.6%、66.0%；24 h時(shí)1.80、2.40、3.20、4.40、5.60 mg/L試驗(yàn)組的死亡率為46.0%、58.0%、60.0%、67.0%、70.0%；48 h時(shí)所有試驗(yàn)組海洋尾絲蟲數(shù)量均出現(xiàn)增長(zhǎng)的現(xiàn)象(圖1b)。

黃色偽角毛蟲對(duì)硫酸鋅很不敏感，12 h時(shí)質(zhì)量濃度100.00 mg/L以下的試驗(yàn)組對(duì)黃色偽角毛蟲影響較小，200.00 mg/L以上的試驗(yàn)組蟲體才出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，蟲體變短變粗，游動(dòng)能力下降；24 h時(shí)100.00、200.00、400.00、800.00、1000.00 mg/L試驗(yàn)組的死亡率分別為33.0%、47.0%、60.0%、75.0%、90.0%；36 h 1000.00 mg/L試驗(yàn)組全部死亡(圖1c)。

褶皺臂尾輪蟲經(jīng)三氯異氰尿酸處理后，質(zhì)量濃度組0.30 mg/L以下的試驗(yàn)組中輪蟲運(yùn)動(dòng)速度受到一定影響；質(zhì)量濃度0.60 mg/L以上的試驗(yàn)組中輪蟲運(yùn)動(dòng)速度明顯下降；24 h時(shí)0.30、0.60、0.80、0.90、1.00 mg/L試驗(yàn)組的死亡率分別為37.0%、60.0%、83.0%、87.0%、90.0%；1.00 mg/L試驗(yàn)組36 h全部死亡(圖2a)。

三氯異氰尿酸作用于海洋尾絲蟲后，所有試驗(yàn)組的海洋尾絲蟲異?；钴S，游泳速度明顯變快，同時(shí)蟲體會(huì)發(fā)生破裂，12 h時(shí)0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L試驗(yàn)組海洋尾絲蟲死亡率分別為38.1%、38.6%、52.3%、68.2%、75.6%；24 h時(shí)0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/L試驗(yàn)組海洋尾絲蟲死亡率分別為40.0%、48.0%、61.0%、80.0%、82.0%；0.50 mg/L試驗(yàn)組48 h全部死亡(圖2b)。

在前12 h，三氯異氰尿酸質(zhì)量濃度小于0.60 mg/L的試驗(yàn)組中黃色偽角毛蟲蟲體無(wú)明顯的變化，質(zhì)量濃度大于1.20 mg/L的試驗(yàn)組中黃色偽角毛蟲蟲體會(huì)收縮變小，運(yùn)動(dòng)速度變慢；24 h時(shí)0.40、0.60、1.00 mg/L試驗(yàn)組數(shù)量開始增多，最大質(zhì)量濃度1.60 mg/L試驗(yàn)組，24 h時(shí)黃色偽角毛蟲死亡率為70%，60 h時(shí)黃色偽角毛蟲數(shù)量開始增多(圖2c)。

2.2 急性毒性試驗(yàn)

采用概率單位分析法，24 h硫酸鋅對(duì)褶皺臂尾輪蟲的死亡率概率單位(y)與所加藥物質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)(x)的線性回歸方程：y=4.9155x+1.7895，r2=0.9727；24 h半致死質(zhì)量濃度為4.499 mg/L。

硫酸鋅對(duì)海洋尾絲蟲的急性毒性線性回歸方程：12 h，y=1.3134x+4.3934，r2=0.9725；24 h，y=1.2273x+4.6452，r2=0.9365；12 h和24 h半致死質(zhì)量濃度分別為2.896 mg/L和1.946 mg/L。

硫酸鋅對(duì)黃色偽角毛蟲急性毒性線性回歸方程：12 h，y=2.3089x-0.8295，r2=0.9300；24 h，y=1.5160x+1.4455，r2=0.9093，12 h和24 h半致死質(zhì)量濃度分別為334.808 mg/L和221.135 mg/L。

褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲對(duì)硫酸鋅的耐受性順序?yàn)辄S色偽角毛蟲>褶皺臂尾輪蟲>海洋尾絲蟲。

24 h三氯異氰尿酸對(duì)褶皺臂尾輪蟲急性毒性線性回歸方程：y=3.1487x-3.2301，r2=0.9519；24 h半致死質(zhì)量濃度為0.412 mg/L。

三氯異氰尿酸對(duì)海洋尾絲蟲急性毒性線性回歸方程：12 h，y=1.4715x+1.5709，r2=0.8181；24 h，y=1.7859x+1.0323，r2=0.8912；12 h和24 h半致死質(zhì)量濃度分別為0.519 mg/L和0.167 mg/L。

三氯異氰尿酸對(duì)黃色偽角毛蟲急性毒性線性回歸方程：12 h，y=2.0827x-2.2555，r2=0.9716；24 h，y=4.0597x-7.6114，r2=0.9565；12 h和24 h半致死質(zhì)量濃度分別為3.044 mg/L和1.255 mg/L。

褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲對(duì)三氯異氰尿酸的耐受性順序?yàn)辄S色偽角毛蟲>褶皺臂尾輪蟲>海洋尾絲蟲。

圖1 硫酸鋅對(duì)褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲的急性毒性作用a.褶皺臂尾輪蟲； b.海洋尾絲蟲； c.黃色偽角毛蟲.

圖2 三氯異氰尿酸對(duì)褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲的急性毒性作用a.褶皺臂尾輪蟲； b.海洋尾絲蟲； c.黃色偽角毛蟲.

3 討 論

硫酸鋅常被用于驅(qū)殺養(yǎng)殖水體中的纖毛蟲[16]。本研究表明硫酸鋅對(duì)褶皺臂尾輪蟲、海洋尾絲蟲和黃色偽角毛蟲24 h半致死質(zhì)量濃度分別為4.499、1.946 mg/L和221.135 mg/L，有研究得出鋅離子對(duì)褶皺臂尾輪蟲的24 h半致死質(zhì)量濃度為3.940 mg/L，95%置信區(qū)間為3.404～4.549 mg/L[17]，本試驗(yàn)結(jié)果與之相一致，說(shuō)明褶皺臂尾輪蟲對(duì)鋅離子并未產(chǎn)生抗藥性。硫酸鋅對(duì)海洋尾絲蟲24 h半致死質(zhì)量濃度要高于硫酸鋅在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的防治用量(1.00 mg/L)，低于硫酸鋅對(duì)褶皺臂尾輪蟲24 h半致死質(zhì)量濃度，高于硫酸鋅對(duì)褶皺臂尾輪蟲的安全質(zhì)量濃度，所以當(dāng)使用硫酸鋅治療褶皺臂尾輪蟲養(yǎng)殖中出現(xiàn)的海洋尾絲蟲病害時(shí)，需要充分控制用藥量，注意重復(fù)施藥的時(shí)間，因?yàn)槭┧幒?4 h，硫酸鋅對(duì)海洋尾絲蟲能起到有效的殺滅作用，48 h后作用不明顯，這與實(shí)際養(yǎng)殖過程中使用漁藥硫酸鋅時(shí)需要隔日重復(fù)用藥一次相一致。本試驗(yàn)研究得出黃色偽角毛蟲對(duì)硫酸鋅的耐藥性要強(qiáng)于褶皺臂尾輪蟲，推測(cè)可能為部分原生動(dòng)物對(duì)藥物的耐藥性強(qiáng)于高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的動(dòng)物。邱彥濤[18]研究表明，高錳酸鉀質(zhì)量濃度為2.00 mg/L時(shí)，寡毛雙眉蟲(Diophrysoligothrix)可以正常存活；謝欽銘等[19]研究表明，高錳酸鉀對(duì)褶皺臂尾輪蟲的24 h半致死質(zhì)量濃度為0.873 mg/L。由此可見，高錳酸鉀對(duì)褶皺臂尾輪蟲和寡毛雙眉蟲的毒性結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相類似。此外生物對(duì)藥物的耐受性還與pH、溫度、生活方式等有關(guān)，如Boersma等[20]研究表明，溫度升高雜食性浮游生物將從掠食性轉(zhuǎn)向食草性。