曾 鵬，申 江，陳天及

( 1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306； 2.天津商業(yè)大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，天津 300134 )

活鮮魚在儲運(yùn)過程中通常應(yīng)用低溫，麻醉同充氧等方式提高存活率[1-2]。但是這些儲運(yùn)手段中水的存在極大影響了運(yùn)輸過程中的成本，因此水產(chǎn)品的無水儲運(yùn)成為研究新方向[3]。冰溫技術(shù)通過低溫馴化增加了生物體的低溫耐受性，在冰溫條件下活體新陳代謝降低，魚類處于休眠狀態(tài)，從而達(dá)到無水運(yùn)輸?shù)哪康腫4-5]。低溫麻醉可以有效的對魚類進(jìn)行麻醉，但會導(dǎo)致血液成分發(fā)生變化[6]。0～0.5 ℃被認(rèn)為是大西洋鮭(Salmosalar)低溫休眠的溫度下限[7]。

丁香油有效成分為丁香酚，作為食品添加劑，在用作麻醉劑時不需要停藥期[8]。在鯉魚(Cyprinuscarpio)、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)等魚類身上的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丁香油的半數(shù)致死質(zhì)量濃度比三卡因甲磺酸鹽要高，比美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用的麻醉劑三卡因甲磺酸鹽更安全[9]。丁香油在日本是可以使用的魚用麻醉劑，藥浴劑量為50～200 μg/L。鯽魚可以在37～80 mg/L丁香油質(zhì)量濃度下有效麻醉，隨著質(zhì)量濃度的增加，麻醉時間縮短，但復(fù)蘇時間延長[10]。

筆者通過比較丁香油麻醉和低溫誘導(dǎo)休眠對鯽魚(Carassiusauratus)生理的影響，及觀察離水后魚體在不同儲藏溫度和時間下的生理變化及應(yīng)激反應(yīng)，來討論休眠方式、溫度及時間對試驗(yàn)魚離水后儲藏的影響。根據(jù)離水儲藏過程中鯽魚的生理變化，使用數(shù)據(jù)回歸分析法探討影響鯽魚復(fù)蘇的主要因素。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鯽魚采自天津地區(qū)某養(yǎng)魚池，選取健康成魚，體表鱗片完整，體質(zhì)量(395.90±43.71) g。根據(jù)以往研究選取兩種休眠方式：由室溫(14 ℃)以1 ℃/h速率降溫至0 ℃誘導(dǎo)休眠；40 mg/L丁香酚浸浴2 min麻醉。

每組鯽魚100尾，分別以兩種休眠方式麻醉后，放置于聚乙烯周轉(zhuǎn)箱中，魚體下放置浸水吸水紙，以保持魚體濕潤，箱口遮蓋紙板，防止冷庫干耗。每種休眠方式組再隨機(jī)分為3組，分別放置于冰溫(0 ℃)儲藏及4、8 ℃控溫冷庫(溫度波動±0.2 ℃)中。自12 h起間隔12 h每組分別取出3尾取樣分析。

1.2 各組織取樣

血樣：心臟靜脈取血，使用肝素鈉小管采集樣品，低溫離心20 min(4 ℃，4000 r/min)，制備血清，-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

肝胰臟及腦組織樣品：組織分離后，稱量質(zhì)量后按1∶10加入50 mmol/L的磷酸鉀溶液(pH 7.0，包含0.5 mmol/L乙二胺四乙酸)研磨破碎，然后低溫離心20 min(4 ℃，4000 r/min)，取上清液離心30 min(4 ℃，12 000 r/min)，得去線粒體上清液及沉淀(線粒體)。-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 測試與分析

所有測試在取樣后一周內(nèi)進(jìn)行，皮質(zhì)醇、血糖、肝糖原及各項(xiàng)酶的測試均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行，以P<0.05表示差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析。以溫度和時間為自變量，進(jìn)行雙因素方差分析，探究溫度、時間對血液生理指標(biāo)的影響；由于離水后的儲藏是一個連續(xù)的變化過程，多類別邏輯有序回歸有助于克服使用單一結(jié)局作為因變量的不足。使用數(shù)據(jù)回歸分析法探討影響鯽魚復(fù)蘇的主要因素，對鯽魚離水儲藏后生存能力(以復(fù)蘇時間體現(xiàn))作為自變量進(jìn)行有序多分類回歸分析，以復(fù)水后恢復(fù)平衡的時間分組作為因變量。1組恢復(fù)平衡時間為0～5 min，2組恢復(fù)平衡時間5～20 min，3組恢復(fù)平衡時間20～30 min，4組30 min內(nèi)不能恢復(fù)平衡。以各項(xiàng)生理指標(biāo)、儲藏溫度、麻醉方式和離水時間作為自變量。其中誘導(dǎo)休眠的方式定義為分類變量：低溫休眠或丁香酚麻醉。

2 結(jié) 果

2.1 離水儲藏過程中試驗(yàn)魚糖代謝指標(biāo)變化

兩種休眠方式試驗(yàn)組均觀察到，鯽魚肝糖原水平均隨儲藏時間延長而差異顯著(P<0.05，表現(xiàn)為其在離水儲藏過程中消耗的趨勢，圖1)。丁香酚麻醉組肝糖原受到儲藏溫度影響，0 ℃貯藏組最高(P<0.05)。

圖1 休眠方式、溫度及時間對鯽魚肝胰臟糖原含量的影響(n=3) 不同大寫字母表示同一溫度不同時間組差異顯著(P<0.05); 不同小寫字母表示同一時間不同溫度組差異顯著(P<0.05)，下同.

兩組離水儲藏過程中鯽魚血糖水平均無明顯變化(圖2)。試驗(yàn)魚經(jīng)丁香酚麻醉后其血清皮質(zhì)醇含量在儲藏過程中無明顯變化，而低溫休眠魚體不同，其血清皮質(zhì)醇水平隨儲藏溫度及儲藏時間變化差異顯著(P<0.05)，4 ℃儲藏組水平較高，60 h后數(shù)值達(dá)到最高(圖3)。

圖2 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血糖濃度的影響(n=3)

圖3 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清皮質(zhì)醇濃度的影響(n=3)

2.2 離水儲藏過程中試驗(yàn)魚血清乳酸及腦丙二醛含量變化

低溫休眠組鯽魚血清乳酸水平受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，8 ℃儲藏條件下較高。試驗(yàn)魚在丁香酚麻醉后同樣受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，8 ℃儲藏條件下血清乳酸水平較高,同時其數(shù)值受到儲藏時間影響，表現(xiàn)為先升后降的趨勢(圖4)。腦丙二醛水平在兩種方式誘導(dǎo)休眠后，均受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，其中8 ℃儲藏條件下較高(圖5)。

圖4 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清乳酸濃度的影響(n=3)

圖5 休眠方式、溫度及時間對鯽魚腦丙二醛含量的影響(n=3)

2.3 離水儲藏過程中試驗(yàn)魚酶活力變化

兩組試驗(yàn)魚肝胰臟過氧化氫酶活力均受儲藏溫度影響顯著(P<0.05)，較高的儲藏溫度(4、8 ℃)導(dǎo)致肝胰臟組織過氧化氫酶活力升高(圖6)。而低溫休眠組鯽魚肝胰臟過氧化氫酶活力也受到了儲藏時間的影響，在試驗(yàn)開始時即12 h時最高，隨儲藏時間延長顯著降低(P<0.05)。

腦組織琥珀酸脫氫酶活力僅受儲藏時間影響顯著(P<0.05)，低溫休眠組腦組織琥珀酸脫氫酶活力在60 h達(dá)到最高值，同時丁香酚麻醉組腦組織琥珀酸脫氫酶活力在儲藏時間為48、60 h時較高(圖7)。

圖6 休眠方式、溫度及時間對鯽魚肝胰臟過氧化氫酶活力的影響(n=3)

圖7 休眠方式、溫度及時間對鯽魚腦琥珀酸脫氫酶活力的影響(n=3)

血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶受儲藏溫度及儲藏時間影響顯著(P<0.05)，兩者活力均隨儲藏時間延長及儲藏溫度升高而增加(圖8、圖9)。

2.4 數(shù)據(jù)回歸分析

平行線檢驗(yàn)結(jié)果為P=0.88>0.05，滿足平行線假設(shè)，表明自變量可以應(yīng)用有序邏輯回歸模型。各項(xiàng)參數(shù)與平衡時間的回歸模型見表1。其中儲藏時間、儲藏溫度、血清皮質(zhì)醇及肝糖原與平衡時間相關(guān),而休眠方式、血糖、血清乳酸、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶、腦丙二醛、腦琥珀酸脫氫酶與鯽魚離水儲藏后的復(fù)蘇時間無相關(guān)性。麻醉休眠方式對復(fù)蘇時間無明顯影響(P=0.86)，即采用低溫休眠和丁香酚麻醉后離水儲藏的鯽魚其復(fù)蘇時間無明顯區(qū)別。

圖8 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的影響(n=3)

圖9 休眠方式、溫度及時間對鯽魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的影響(n=3)

表1 休眠方式、溫度、時間及各項(xiàng)生理參數(shù)與平衡時間的有序回歸

3 討 論

3.1 麻醉及儲藏因素對生理機(jī)能的影響

對魚類脅迫反應(yīng)的研究結(jié)果指出，皮質(zhì)醇及血糖水平是反應(yīng)魚體生理狀態(tài)的重要指標(biāo)[11]。鯽魚血清皮質(zhì)醇水平在低溫休眠組逐漸升高，而在丁香酚麻醉后離水儲藏過程中皮質(zhì)醇水平無明顯變化。推測這是由于丁香酚能有效的緩解魚類應(yīng)激狀態(tài)，有研究觀察到羅非魚(Oreochromis)在丁香酚麻醉中及麻醉后，其皮質(zhì)醇含量明顯降低[12]。丁香酚可以降低大口黑鱸(Micropterussalmoides)運(yùn)輸時的應(yīng)激反應(yīng),在一定程度上降低大口黑鱸的生理生化變化,但長時間的運(yùn)輸后,丁香酚并不能抑制運(yùn)輸對魚體造成的傷害[13]。

運(yùn)輸、低溫等條件脅迫下，魚體由于受到應(yīng)激刺激導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)中促兒茶酚胺和皮質(zhì)醇的釋放[14]，進(jìn)而影響糖類及脂類的儲備，尤其是肝糖原的儲備，以滿足機(jī)體快速代謝需求[15]。本研究在試驗(yàn)過程中觀察到，脅迫過程中血糖無明顯變化，這同Dindia等[16]的研究結(jié)果一致。隨著鯽魚離水時間延長，肝糖原逐漸消耗，腦琥珀酸脫氫酶活力升高。這可能是由于在極端條件下，魚體通過調(diào)節(jié)不同代謝途徑的酶含量、轉(zhuǎn)換代謝途徑和改變組織細(xì)胞的分子組成等方式, 使魚體代謝和生理功能逐漸適應(yīng)[17]。

溫度影響質(zhì)膜的流動性，進(jìn)而改變新陳代謝物質(zhì)的運(yùn)輸，同時調(diào)控多項(xiàng)應(yīng)激介導(dǎo)的信號通路[18]。本研究顯示，較高的儲藏溫度導(dǎo)致腦丙二醛含量、乳酸含量及過氧化氫酶活力升高。丙二醛作為細(xì)胞膜氧化損傷的指示物，是脂質(zhì)過氧化作用中衍生的代謝物[19]。離水操作脅迫后的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)過氧化氫酶活力呈先升后降趨勢，丙二醛含量持續(xù)升高[20]。試驗(yàn)中低溫休眠組鯽魚肝胰臟過氧化氫酶活力隨儲藏時間延長而降低，這可能因?yàn)轸~體受外界刺激機(jī)體免疫機(jī)制受到刺激發(fā)揮作用,抗氧化酶活性升高，而當(dāng)達(dá)到機(jī)體的耐受極限后,酶活力反而會被抑制[21]。

血清中酶活力的變化能夠反映機(jī)體代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的狀況，以及組織結(jié)構(gòu)功能的不同狀態(tài)，是機(jī)體組織細(xì)胞膜完整性的一個重要標(biāo)志[22]。低溫脅迫下膜脂流動性和彈性減弱，膜脂的不對稱性增加，使得膜緊縮不均而造成膜的破損滲漏或通透性增加，胞內(nèi)溶質(zhì)外流入血液中[23]。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝胰臟細(xì)胞中，是肝胰臟損傷的重要指示酶?？赡苁怯捎陔x水儲藏中肝胰臟細(xì)胞造成損傷，從而使得肝胰臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液中，導(dǎo)致試驗(yàn)鯽魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力隨著儲藏時間延長及儲藏溫度升高而增加。

3.2 回歸結(jié)果分析

有序多分類回歸研究的因變量是有序的而且是多分類的,例如考察藥物對受試者作用，將效果區(qū)分為逐級遞進(jìn)，由無效、有效直至治愈。優(yōu)勢比為在其他條件不變的情況下，自變量每改變1個單位，事件發(fā)生比的變化率。優(yōu)勢比等于1，表示該因素對事件的發(fā)生不起作用；優(yōu)勢比大于1，表示該因素是危險(xiǎn)因素；優(yōu)勢比小于1，表示該因素是保護(hù)因素[24]。

儲藏溫度、肝糖原及儲藏時間的優(yōu)勢比大于1，表明隨著儲藏溫度升高，儲藏時間延長，離水儲藏的鯽魚復(fù)蘇時間延長；肝糖原的含量較大，相應(yīng)復(fù)蘇時間延長。血清皮質(zhì)醇優(yōu)勢比小于1，表明皮質(zhì)醇含量高的鯽魚其復(fù)蘇時間較短。

各項(xiàng)參數(shù)的優(yōu)勢比中，儲藏溫度影響較大，其值表示每升高1 ℃鯽魚復(fù)蘇時間延長一個等級的幾率增大1.42倍。儲藏時間的優(yōu)勢比為1.09，其值表示儲藏時間延長1 h，鯽魚復(fù)蘇時間延長一個等級的幾率增大1.09倍。儲藏溫度儲藏時間作為危險(xiǎn)因素，其數(shù)值的升高導(dǎo)致復(fù)蘇時間延長，即存活能力的下降。0 ℃儲藏較其他兩種儲藏溫度可以極大地提高鯽魚離水儲藏的存活能力。

肝糖原優(yōu)勢比為1.02，其值表示肝糖原的數(shù)值增加一個單位，鯽魚復(fù)蘇時間延長一個等級的幾率增大1.02倍。皮質(zhì)醇的結(jié)果顯示，皮質(zhì)醇的數(shù)值增加一個單位，鯽魚復(fù)蘇時間延長一個等級的幾率變?yōu)?.83。皮質(zhì)醇的水平升高同時肝胰臟糖原的消耗表明，鯽魚在離水儲藏過程需要維持一定的應(yīng)激反應(yīng)，同時減少生理功能的損傷，兩者的結(jié)果顯示，鯽魚正常生理功能的穩(wěn)定有助于提高其離水后的存活能力。