丁 峰 ，孫珂煥 ，曹美群 ，吳正治*

1.暨南大學中西醫(yī)結合博士后流動站，廣東 廣州 510632；2.深圳市老年醫(yī)學研究所，廣東 深圳 518029；3.深圳市第二人民醫(yī)院，廣東 深圳 518029

原發(fā)性肝癌（以下簡稱肝癌）是臨床上常見的惡性腫瘤之一。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球癌癥統(tǒng)計報告2018》指出，中國是世界上癌癥發(fā)病率和死亡率全球第一的國家［1］。中國肝癌的發(fā)病率和死亡率均位列全國第五，每年我國死于肝癌的患者約為40萬人，而且近年來我國的肝癌患者數(shù)量仍在逐漸增加。原發(fā)性肝癌臨床上表現(xiàn)為為肝痛、乏力、納差、發(fā)熱、消瘦、黃疸等。中醫(yī)認為肝郁證為肝癌臨床常見的證型之一［2］，然而目前對肝郁證肝癌的研究進行的較少，其本質尚不明確。

近年來，唾液組學在口腔疾病和全身系統(tǒng)性疾病早期診斷領域備受關注［3-6］。與血清標本相比，唾液具有取樣方便、安全無創(chuàng)傷、成本低廉等優(yōu)點。因此，唾液在人體疾病早期診斷和預后監(jiān)測中具有巨大的潛力。隨著基因表達芯片、高通量測序技術、生物質譜等具有高靈敏度、高通量、高分辨率新技術的快速發(fā)展，研究人員已經在唾液中發(fā)現(xiàn)了多種臨床疾病的診斷標志物。然而目前的研究領域主要集中在口腔癌、頭頸癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等疾?。?-9］。國內外對肝癌早期診斷的研究主要基于血清和肝臟組織［10-12］，對肝癌唾液組學的研究還比較少見。本文采用同位素標記相對和絕對定量（isobar labeled relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術，對肝癌不同中醫(yī)證型進行唾液蛋白質譜分析，篩選肝郁證肝癌相關蛋白，從蛋白質組學角度探討肝郁證肝癌的發(fā)病機制。

1 實驗部分

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準 原發(fā)性肝癌的診斷及分期參照2001年第八屆全國肝癌學術會議制定并通過的原發(fā)性肝癌臨床診斷與分期標準［13］。

1.1.2 中醫(yī)辨證分型標準 在確定西醫(yī)臨床診斷為原發(fā)性肝癌的基礎上，參照文獻研究得出的肝郁證參考診斷標準：①胸脅作脹或痛，②精神抑郁，③煩躁易怒，④口苦，⑤胸悶，⑥善太息，⑦脈弦。以上7條同時具備4條或4條以上即可診斷為肝郁證［14］。未見以上癥狀者納入非肝郁證組。

1.2 排除標準

排除年齡在30歲以下；排除已接受過局部放化療治療或手術者；排除患有口腔局部及唾液腺炎癥患者；排除合并有其他系統(tǒng)嚴重原發(fā)性疾病患者；排除患有舍格倫綜合征或囊性纖維病患者。

1.3 唾液樣本

本次所收集的唾液樣本均來自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科臨床診斷為肝癌的患者，患者均簽署知情同意書。其中，肝郁證肝癌患者11例，男9例，女2例，平均年齡50.4歲，最大患者65歲，最小患者42歲。非肝郁證肝癌患者11例，男8例，女3例，平均年齡57.6歲，最大患者67歲，最小患者40歲。健康對照組11例，男5例，女6例，平均年齡53.2歲。

1.4 唾液樣本收集及處理

1.4.1 唾液樣本采集 樣本采集前一晚，患者睡前清水漱口3次，避免進任何食物或藥物。第二天早上起床后未進食前，采用非刺激性唾液采集方式取樣?；颊邔⑶? min內的唾液自然吞下后，專業(yè)人員開始操作收集唾液樣本。將消毒的無菌圓柱形棉花放入患者口中，當棉花積聚足夠量的唾液后，讓患者將棉花吐入提前置于冰浴的唾液離心管（15 mL）內。4℃下先靜置1 h，然后3 000 r/min離心10 min。冰浴上將收集的唾液分裝在1 mL的EP（eppendorf）管中，每管分裝 200 μL，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.4.2 唾液蛋白提取及定量 取出樣本，冰上解凍，樣本中加入適量裂解液（由2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素和質量分數(shù)0.1%chaps{3-［3-（膽酰胺丙基）二甲氨基［丙磺酸內鹽，3-［（3-cholamidopropyl）dimethy lammonio］propanes ulfonate}組成，渦旋混勻后超聲60 s，在室溫提取30 min。在4℃下15 000r/min離心20min，收集上清，分裝后置于-80℃冰箱保存。采用Bradford法對提取的蛋白進行定量，蛋白定量后分別將肝郁證組、非肝郁證組、健康對照組各11例樣本進行組內混合（每個樣本取等量蛋白混合）。每組混合后平均分為兩份，共6份。

1.4.3 蛋白酶切 分別從6組樣本蛋白溶液中取出100 μg蛋白于離心管中，加入4 μL還原試劑60 ℃反應 1 h，加入 2 μL Cysteine Blocking Reagent，室溫反應10 min。往10K的超濾管中加入還原烷基化后的蛋白溶液，12 000 r/min離心20 min，收集上清。加入100 μL溶解液，12 000 r/min離心20 min，并收集上清。在超濾管中加入2 μg胰蛋白酶37℃反應過夜；次日12 000 r/min離心20 min，收集酶解消化后的肽段溶液。超濾管中加入50 μL溶解液離心20 min，與上一步合并，共得到100 μL酶解后的樣品。

1.5 iTRAQ實驗

1.5.1 iTRAQ標記 每管iTRAQ試劑中分別加入150 μL異丙醇，渦旋振蕩后離心。取50 μL樣品轉移到新的離心管中，對6份肽段混合物進行iTRAQ標記，并等量混合。將標記后的樣品渦旋振蕩后離心，進行真空冷凍離心干燥后-80℃保存。1.5.2 LC-MS/MS分析 用100 uL流動相A溶解iTRAQ標記后的樣品，14 000 r/min離心20 min，收集上清液。用400 μg酶解好的牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）進行分離（柱溫45℃，檢測波長214 nm）。取100 uL準備好的樣本上樣，流速0.7 mL/min。用20 μL質量分數(shù)2%甲醇，質量分數(shù)0.1%甲酸復溶高pH反相分離得到的組份，12 000 r/min離心10 min，收集上清上樣，采取夾心法上樣，上樣體積10 μL，分離流速350 nL/min。

1.5.3 質譜數(shù)據(jù)處理 搜庫所用數(shù)據(jù)庫為UNIPROT Human數(shù)據(jù)庫，并由MALDI-TOF-TOF 4700型質譜完成質譜分析。質譜原始文件采用AB Sciex配套商用軟件Protein Pilot進行處理。

1.6 生物信息學分析

本研究鑒定的差異蛋白采用差異倍數(shù)＞1.5或＜0.67，以及p值＜0.05作為篩選標準。通過DAVID［15］數(shù)據(jù)庫對鑒定得到的顯著差異表達蛋白進行Gene Ontology（GO）功能注釋。GO功能分類包括三大類：生物學過程（Biological Process）、分子功能（Moleculer Function）以及細胞組分（Cellular Component）。同時，利用 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數(shù)據(jù)庫進行差異蛋白代謝通路富集分析。進一步應用STRING蛋白相互作用網絡數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）繪制差異蛋白相互作用網絡圖譜。

2 結果與討論

2.1 差異表達蛋白鑒定

健康對照組、肝郁組、非肝郁組（每組2個重復）共6組，經iTRAQ標記串聯(lián)質譜分析后，共同鑒定到的蛋白有1 296個。以差異倍數(shù)＞1.5或＜0.67為篩選標準，與健康對照組相比，肝郁組中具有顯著差異表達的蛋白390個，其中顯著上調的差異蛋白有201個，顯著下調的差異蛋白有189個；非肝郁組中具有顯著差異表達的蛋白231個，其中顯著上調的差異蛋白有133個，顯著下調的差異蛋白有98個。同時，對肝郁組和非肝郁組差異蛋白進行比較分析，得到在兩組中同時表達上調或下調的蛋白，以及在各組特異表達的蛋白，結果如圖1所示。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 GO功能分類 將肝郁組和非肝郁組中共同表達的130個差異表達蛋白進行GO功能分類，結果如圖2所示。在生物學進程方面，差異蛋白主要參與補體激活、視網膜穩(wěn)態(tài)、B細胞激活正調控、免疫反應、吞噬作用等生物學過程。在細胞組分方面，這些蛋白主要位于胞外區(qū)等。在分子功能方面，這些差異蛋白主要涉及抗原/受體結合、抗氧化劑活性、酶活性等方面。

圖1 肝郁組和非肝郁組差異蛋白比較Fig.1 Comparison of differentially expressed proteins between HCC group with and without liver-depression syndrome

將肝郁組中特異表達的260個差異表達蛋白進行GO功能分類，結果如圖3所示。在生物學進程方面，這些差異蛋白主要參與補體激活、多個信號轉導通路、蛋白質水解、免疫反應等。在細胞組分方面，這些蛋白主要位于胞外區(qū)等。在分子功能方面，這些差異蛋白主要涉及抗原/受體結合、內切酶活性、蛋白酶結合等。

2.2.2 KEGG代謝通路富集分析 KEGG代謝通路富集分析結果顯示，肝郁組和非肝郁組共同表達的差異蛋白主要富集在5條代謝通路（p＜0.05），見圖4（a）。同時，對肝郁組中特異表達的差異蛋白進行KEGG分析發(fā)現(xiàn)，這些差異蛋白主要富集在7條代謝通路（p值＜0.05），見圖4（b）。

2.2.3 STRING蛋白互作網絡圖譜構建 進一步應用STRING蛋白互作網絡數(shù)據(jù)庫，對肝郁證肝癌特異表達蛋白之間的相互作用進行預測，并繪制了蛋白相互作用網絡圖（圖5）。肝郁證肝癌蛋白相互作用網絡中存在2個主要的蛋白功能模塊，分別與蛋白酶體通路和補體途徑有關。

2.3 蛋白質組學研究與傳統(tǒng)肝癌中醫(yī)辨證分型

圖2 肝郁組和非肝郁組中共同表達的差異蛋白GO功能分類：（a）生物學過程，（b）分子功能，（c）細胞組分Fig.2 GO functional classification of differentially expressed proteins that were identified in both HCC groups：（a）biological process，（b）molecular function，（c）cellular component

圖3 只在肝癌肝郁組中特異表達的差異蛋白GO功能分類：（a）生物學過程，（b）分子功能，（c）細胞組分Fig.3 GO functional classification of differentially expressed proteins that were only identified in HCC group with liver-depression syndrome：（a）biological process，（b）molecular function，（c）cellular component

圖4（a）肝郁組和非肝郁組中共同表達的差異蛋白富集的代謝通路，（b）肝郁組中特異表達的差異蛋白富集的代謝通路Fig.4 （a）KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins that were identified in both HCC groups，（b）KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins that were specifically identified in HCC groups with liver-depression syndrome

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，西醫(yī)結合中醫(yī)辨證分型是我國肝癌治療的一大特點。近年來，隨著蛋白質組學檢測技術的快速發(fā)展，將蛋白質組學研究與傳統(tǒng)肝癌中醫(yī)辨證分型相結合，給傳統(tǒng)證候研究帶來了新的契機，有利于推動中醫(yī)藥的臨床研究［16］。目前已有研究報道利用表面增強激光解析電離飛行時間質譜（surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS）技術，檢測并發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證型原發(fā)性肝癌患者的血清蛋白質譜具有差異性［17-18］。

圖5 STRING蛋白相互作用網絡Fig.5 STRING protein-protein interaction network

原發(fā)性肝癌中醫(yī)證候錯綜復雜，肝氣郁結證為其中的一種常見證型［2］。肝郁證即肝氣郁結證，臨床表現(xiàn)為因情志不舒、氣機郁滯導致心情抑郁、情緒不寧、胸肋悶脹、易怒善哭等癥狀［19］。肝郁證的現(xiàn)代病證研究表明，肝郁證涉及神經系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等多系統(tǒng)、多器官的病理改變［20］。因此，肝郁證可涉及多種疾病，危害甚大，是中醫(yī)病癥研究的重點研究對象。本研究中，應用iTRAQ定量蛋白質組學技術篩選肝郁證肝癌和非肝郁證肝癌病人唾液樣本的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)肝郁證肝癌患者的唾液蛋白表達譜存在明顯差異。

2.4 肝郁證肝癌特異表達蛋白譜及代謝通路

對肝癌肝郁證和非肝郁證的差異蛋白表達譜進行分析，在肝郁證中一共鑒定到260個具有顯著差異表達的蛋白，包括124個上調蛋白和136個下調蛋白。KEGG代謝通路富集分析顯示，這些差異蛋白主要富集在泛素蛋白酶體通路、自噬溶酶體通路、黏附連接通路等。

2.4.1 自噬溶酶體通路 蛋白質合成和降解的平衡是細胞生存的一個重要條件，這種平衡的破壞會導致細胞癌變或死亡。真核細胞中存在兩條主要的蛋白質降解途徑：蛋白酶體通路和自噬溶酶體通路。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，廣泛存在蛋白酶體通路和自噬溶酶體通路的變異，且兩者之間可能存在互補代償關系［21］。自噬溶酶體通路負責降解受損或多余的蛋白質、器官、脂類等，從而維持體內代謝平衡［22］。自噬溶酶體通路作為細胞的一種自我保護機制，在維持細胞自我穩(wěn)態(tài)和促進細胞生存方面具有重要作用，若自噬未能清除冗余的蛋白質和受損的器官，則會導致DNA損傷的累積，從而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［23-24］。自噬的這種特點表明其在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著雙刃劍的作用，具有促進或抑制腫瘤發(fā)展的雙重作用。本研究發(fā)現(xiàn)，參與自噬溶酶體通路的基因，除了鞘脂激活蛋白原（Prosaposin，PSAP）表達上調外，其他基

因的表達量在肝郁證中均表現(xiàn)為下調（圖6），包括蠟樣脂褐質神經元蛋白5（ceroid-lipofuscinosis neuronal protein 5，CLN5），α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（alpha-N-acetylglucosaminidase，NAGLU）、醌還原酶（quinone reductase，CRYZ）、半胱氨酸蛋白酶 1（Cysteine protease 1，LGMN）、半乳糖苷酶α（Galactosidase Alpha，GLA）和甘露糖苷酶β（Mannosidase Beta，MANBA）。這些蛋白的表達下調可能意味著自噬能力的降低。在腫瘤發(fā)生的早期，自噬能力降低使得細胞增殖旺盛，同時DNA受損增加基因組的不穩(wěn)定性，進而導致腫瘤的發(fā)生［25］。因此，這些基因在肝郁證肝癌中的下調表達，提示它們可能與早期肝郁證肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。

2.4.2 泛素蛋白酶體通路 泛素蛋白酶體通路是細胞內蛋白質選擇性降解的重要途徑，在人體許多生理活動中起著非常重要的作用，包括轉錄因子調控、抗原提呈、細胞凋亡調控、細胞周期調控和腫瘤發(fā)生調控等［26］。其特殊的蛋白酶體裂解活性能上調或下調某些抑癌基因、轉錄因子或細胞周期素的表達，從而影響癌癥的發(fā)生發(fā)展［27］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，肝郁證肝癌特異表達的基因中，參與泛素蛋白酶體通路的基因多數(shù)表達量上調（圖7），包 括 PSMB1（Proteasome Subunit Beta 1）、PSMD2（Proteasome 26S Subunit，Non-ATPase 2）、PSMD6（Proteasome 26S Subunit，Non-ATPase 6）、PSME1（Proteasome Activator Subunit 1）和 PSMD1（Proteasome 26S Subunit，Non-ATPase 1）。PSMB1是組成20S蛋白酶體的亞基之一，介導泛素依賴的蛋白降解，如MHC-I類抗原的加工提呈等［28］。PSMD2、PSMD1和PSMD6是組成19S蛋白酶體的三個亞基。PSMD2在肺癌中表達量上調，且PSMD2高表達與預后差相關［29］。PSMD1在乳腺癌中表達量同樣上調，經研究發(fā)現(xiàn)PSMD1失活能夠抑制乳腺癌中抑癌基因p53蛋白降解，從而造成p53蛋白累積［30］。蛋白酶體激活因子PSME1為11S調節(jié)因子（PA28）α亞基的編碼基因，口腔鱗狀細胞癌中該基因表達量上調，且與易復發(fā)和預后差相關［31］。這些蛋白酶體亞基在多種惡性腫瘤中表達上調提示它們可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關。同時，STRING蛋白相互作用網絡顯示，肝郁證肝癌蛋白相互作用網絡中存在2個主要的蛋白功能模塊，泛素蛋白酶體通路上的PSMB1蛋白正是其中一個功能模塊上的核心蛋白。這表明PSMB1有可能成為肝郁證肝癌早期診斷的一個潛在標志物，值得開展進一步研究。

圖6 自噬溶酶體通路：粉色代表肝癌肝郁組中上調表達基因，黃色代表肝癌肝郁組中下調表達基因Fig.6 Lysosome pathway：pink represents up-regulated proteins in HCC group with liver-depression syndrome，yellow represents down-regulated proteins in HCC group with liver-depression syndrome

圖7 泛素蛋白酶體通路：粉色代表肝癌肝郁組中上調表達基因，黃色代表肝癌肝郁組中下調表達基因Fig.7 Proteasome pathway：pink represents up-regulated proteins in HCC group with liver-depression syndrome，yellow represents down-regulated proteins in HCC group with liver-depression syndrome

3 結 語

采用iTRAQ定量蛋白組學技術，從分子水平探討肝癌不同中醫(yī)證型間的差異，篩選出肝郁證肝癌與非肝郁證肝癌病人的唾液差異蛋白表達譜，建立了肝郁證肝癌特異的蛋白數(shù)據(jù)庫，并構建了蛋白相互作用網絡，將肝郁證肝癌蛋白譜進行了可視化展示。本研究結果顯示在肝癌肝郁證中表達異常的蛋白主要與蛋白質降解有關，同時系統(tǒng)評估了位于泛素蛋白酶體通路的蛋白酶體亞基在肝癌中的表達量變化，篩選了一個潛在的肝癌早期診斷標志物蛋白PSMB1，為肝癌防治和中醫(yī)辨證論治提供了依據(jù)。本項目不同中醫(yī)證型的病例數(shù)量相對較少，具有一定的局限性，進一步研究應擴大病例個數(shù)，并進行功能實驗驗證差異蛋白的可靠性，進一步揭示其證候本質和生物學機制。