秦磊磊　李素媛　黃龍　江一飛　劉健　羅愛玲

摘要：通過對魔芋膳食纖維微生物項(xiàng)目檢測，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配方進(jìn)行優(yōu)化改良，使樣品稀釋后的黏度降低，提高樣品稀釋液流動性，增加樣品稀釋后的均勻性，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，甘油的濃度為30%～40%，NaCl的濃度為0.85%時所組成的稀釋液效果最佳，該樣品稀釋液保持良好流動性的時間能夠較好地滿足試驗(yàn)需要，使用該稀釋液配方進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目檢測時，具有較好的適用性。

關(guān)鍵詞：甘油;魔芋膳食纖維固體飲料;微生物;稀釋液選擇;適用性

中圖分類號：TS207.4? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）11-0107-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.11.027? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

The selection and applicability research on the diluent for konjac solid beverage microbiological item

QIN Lei-lei，LI Su-yuan，HUANG Long，JIANG Yi-fei，LIU Jian，LUO Ai-ling

（Three Gorges Public Inspection and Testing Center，Yichang 443000，Hubei，China）

Abstract： The standard diluent formula of the konjac dietary fiber microbial project was optimized to reduce the viscosity after dilution， improve the fluidity of the sample diluent， increase the uniformity of the sample dilution， ensure the accuracy of the test results. The applicability of the improved diluent was studied through comparative experiments. the diluent consisting of glycerol at the concentration of 30%～40% and NaCl at the concentration of 0.85% had the best effect， and the time of maintaining good fluidity of the diluent could meet the needs of the experiment. The diluent formula had a good applicability in the detection of related items.

Key words： glycerin; konjac dietary fiber solid drinks;microorganism;selection of diluent;applicability

魔芋又名蒟蒻，是天南星科魔芋屬多年生草本植物，中國魔芋種植面積較大[1]。湖北省為中國魔芋重要種植區(qū)，素有中國魔芋看湖北，湖北魔芋看鄂西的說法，是典型的小作物，大產(chǎn)業(yè)。魔芋富含大量的膳食纖維，因其獨(dú)特的保健功能被稱為“第七大營養(yǎng)素”[2]，具有良好的調(diào)節(jié)腸道、預(yù)防心血管疾病、控制體重、防治糖尿病、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功能[3]。魔芋膳食纖維具有良好的親水性、凝膠性，因此作為添加劑在食品工業(yè)中被廣泛使用[4]。魔芋膳食纖維固體飲料因其良好的功能性、沖調(diào)性與便利性受廣大人群所喜愛。

固體飲料是即沖即飲型食品，如果微生物超標(biāo)將會嚴(yán)重威脅到人們的身體健康和生命安全[5]，因此對固體飲料產(chǎn)品微生物進(jìn)行控制至關(guān)重要。但是魔芋膳食纖維親水性強(qiáng)、易凝膠，按照國家標(biāo)準(zhǔn)方法對其微生物衛(wèi)生指標(biāo)進(jìn)行檢測時，樣品稀釋后快速形成凝膠，稀釋液的均勻性與流動性極差，后續(xù)試驗(yàn)無法正常操作，不能獲得準(zhǔn)確真實(shí)的檢測數(shù)據(jù)，對產(chǎn)品的質(zhì)量安全控制評估造成了非常大的困難，產(chǎn)品的質(zhì)量存在一定的安全隱患。通過試驗(yàn)，添加一定比例的甘油，使魔芋膳食纖維稀釋液在一定時間內(nèi)保持較好的流動性，從而保證試驗(yàn)的順利進(jìn)行，同時確定了稀釋液中甘油的添加比例，并研究了改良后稀釋液的適用性。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

魔芋膳食纖維固體飲料;實(shí)驗(yàn)室自分離菌株1-32，魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品中分離;大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.c）CMCC44102，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.a）CMCC26003，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心;甘油，西隴科技;氯化鈉，西隴科技;平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，海博生物;菌落總數(shù)質(zhì)控樣品、大腸菌群質(zhì)控樣品、金黃色葡萄球菌質(zhì)控樣品，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價中心。

1.2? 設(shè)備

LRH-250型生化培養(yǎng)箱，廣東韶關(guān)醫(yī)療器械;BXM-50型滅菌鍋，博迅;Bio-ⅡA型生物安全柜;ME2002型電子天平，梅特勒DV2T型黏度計(jì)，博勒飛。

1.3? 方法

1.3.1? 黏度測定? 量取500 mL 30 ℃的生理鹽水注入500 mL燒杯中，然后將燒杯放入（30±1） ℃恒溫水浴槽，將攪拌器放入燒杯中開啟攪拌，調(diào)整轉(zhuǎn)速至150 r/min。稱取5.00 g待測樣品，緩緩加入燒杯中，攪拌1 h后停止，取出燒杯，用4號轉(zhuǎn)子測定，0.5 h重復(fù)一次，直至黏度值達(dá)到最大值并明顯開始下降[6]。

1.3.2? 改良稀釋液的配制? 分別稱取20、25、30、35、40 g甘油于燒杯中，加0.85%生理鹽水混勻后定容至100 mL，121 ℃、0.1 MPa滅菌15 min，取18 mL于燒杯中，加入2 g高黏度魔芋膳食纖維固體飲料，充分混勻，記錄稀釋液保持良好流動性時間，用不同濃度甘油-生理鹽水稀釋液代替蒸餾水按照“1.3.1”進(jìn)行魔芋膳食纖維固體飲料黏度測定，同時測定稀釋液黏度。

1.3.3? 菌種的制備? 將實(shí)驗(yàn)室自分離菌株1-32、大腸埃希氏菌CMCC44102、金黃色葡萄球菌CMCC26003分別轉(zhuǎn)入營養(yǎng)肉湯中[7]，36 ℃培養(yǎng)24 h，待菌種復(fù)蘇后營養(yǎng)瓊脂36 ℃培養(yǎng)24 h純化菌落，挑取單個菌落36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取新鮮培養(yǎng)物制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，并逐級稀釋至菌懸液濃度約為106、105、104、103、102、10 cfu/mL，備用，吸取上述相同濃度菌懸液各1 mL，充分混勻。

1.3.4? 驗(yàn)證

1）抑制性評價。分別使用25 mL 0%、30%、35%、40%甘油-生理鹽水無菌稀釋液代替樣品，加入225 mL相應(yīng)甘油濃度稀釋液中，接種1 mL混合菌懸液，每個接種水平做6平行，按照GB4789.2-2016[8]進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，檢測結(jié)果取對數(shù)，以稀釋液中甘油濃度為變量，使用Excel對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2）準(zhǔn)確度。稱取25 g滅菌魔芋膳食纖維固體飲料于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL甘油稀釋液，分別接種1 mL懸液，每個水平2平行[9]，采用GB4789.2-2016進(jìn)行菌落總數(shù)檢測。用25 mL無菌生理鹽水替代樣品加入225 mL無菌生理鹽水稀釋液作為參比對照;使用25 mL無菌甘油-生理鹽水稀釋液替代樣品加入225 mL相應(yīng)甘油濃度稀釋液作為樣品空白對照。檢測結(jié)果取對數(shù)，評價改良稀釋液結(jié)果與參比對照結(jié)果相對誤差。

3）質(zhì)控樣品試驗(yàn)。將西林瓶中凍干粉取出，與25 g滅菌膳食纖維固體飲料混勻，使用改良稀釋液沖洗西林瓶內(nèi)壁，合并沖洗液與剩余稀釋液，將凍干粉與魔芋膳食纖維固體飲料混合物加入混勻，此為樣品原液，按照質(zhì)控樣品說明書指定方法進(jìn)行檢測，最終結(jié)果轉(zhuǎn)化為西林瓶中菌落數(shù)總量（cfu）=原液菌濃度（cfu/mL）×225（mL）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 甘油對稀釋液黏度的影響

由于工藝及產(chǎn)品規(guī)格不同，魔芋膳食纖維中葡甘聚糖（Konjac glucomannan，KGM）含量不同，魔芋膳食纖維固體飲料黏度存在一定差異，測定6批次魔芋膳食纖維1%生理鹽水溶液黏度，黏度在1 800～37 500 MPa·s（表1）。

KGM含量超過5%時為KGM強(qiáng)凝膠[10]，KGM大分子中含有大量的羥基等親水性基團(tuán)，通過分子間作用力與水分子相結(jié)合[11]，添加一定濃度的甘油后稀釋液極性降低，KGM在甘油中溶解度降低，其主分子鏈未完全展開，沒有溶脹溶解[12]，葡甘聚糖與水分子間相互作用力減弱，形成凝膠時間有所延長。1% KGM 在一定甘油添加量的溶液中黏度顯著下降，因甘油本身具有一定黏性，甘油添加量超過25%后溶液本身黏度略有上升。稀釋液甘油濃度大于30%時，黏度37 500 MPa·s樣品10倍稀釋液保持良好流動性時間達(dá)10 min以上，可滿足微生物檢測需要，確定稀釋液配方為每100 mL稀釋液含甘油30～40 g、NaCl 0.85 g（表2）。

2.2? 抑制性評價

用產(chǎn)品中分離芽孢菌、大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌混合菌株污染樣品模擬產(chǎn)品菌相構(gòu)成，以稀釋液甘油濃度為變量，對不同濃度甘油稀釋液檢測結(jié)果進(jìn)行方差分析，檢測結(jié)果以10倍稀釋液為原液計(jì)，評估甘油添加量對不同接種水平試驗(yàn)結(jié)果的影響（表3）。表4方差分析顯示，102～105 cfu/g接種水平下，F(xiàn)值分別為1.626、1.507、1.486、0.934，當(dāng)給定α=0.05時，F(xiàn)0.95（3，20）=3.098，不同接種水平F值均小于F0.95（3，20），表明檢測魔芋膳食纖維固體飲料菌落總數(shù)時，不同甘油添加量之間無顯著差異，30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液與生理鹽水稀釋液檢測結(jié)果無顯著差異，按照標(biāo)準(zhǔn)流程檢測，適量甘油對產(chǎn)品菌相中芽孢菌、大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌無明顯抑制作用，可用以改良魔芋膳食纖維固體飲料微生物檢測用稀釋液。

甘油通常作為菌種保藏防凍劑使用，方光遠(yuǎn)等[13]使用85%甘油-生理鹽水-20 ℃保存枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、雞大腸桿菌，3株菌均保存4年仍有活力;鐘志宏等[14]將8份甘油與2份生理鹽水混勻后用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌等24株菌的冷凍保存。部分微生物可利用甘油作為碳源，甘油對細(xì)菌抑制作用較小，在檢測過程中，微生物在甘油稀釋液中接觸時間短，移取30%～35%甘油稀釋液1 mL注入20 mL培養(yǎng)基后培養(yǎng)物中甘油含量僅為0.015～0.020 g/mL，含量極低，經(jīng)過前期魔芋膳食纖維固體飲料產(chǎn)品菌相分析，產(chǎn)品優(yōu)勢菌為芽孢菌[15]，芽孢菌對環(huán)境有較強(qiáng)的抗性，且產(chǎn)品經(jīng)過高溫加工水分含量較低，通常以芽孢形式存在，與一定含量甘油短時間內(nèi)接觸不會被抑制或滅活，方差分析也證明一定濃度甘油稀釋液與生理鹽水稀釋液檢測結(jié)果無明顯差異。

2.3? 準(zhǔn)確度

分別使用5株來自樣品中分離的優(yōu)勢菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌人工污染樣品，對接種不同水平的樣品分別采用30%、35%、40%甘油-生理鹽水稀釋液進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，菌落總數(shù)以10倍稀釋液為原液計(jì)，菌落計(jì)數(shù)服從泊松分布，對檢測結(jié)果取對數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布數(shù)據(jù)[16]，檢測結(jié)果如表5所示。根據(jù)表5可知，接種水平在103～105 cfu/g時，使用不同濃度甘油稀釋液檢測結(jié)果與參比對照結(jié)果相對誤差僅兩組超過10%，具有較高的準(zhǔn)確性，接種水平為102 cfu/g時，42組試驗(yàn)中14組與參比對照相對誤差超過10%，檢測結(jié)果存在較大波動，主要原因是低接種水平微生物分布均勻性較差，樣品的加入也會導(dǎo)致樣品稀釋液終體積及取樣體積有所差異，取樣過程中誤差較大，且存在一定的隨機(jī)性。接種水平103～105 cfu/g時，不同甘油濃度稀釋液檢測結(jié)果也具有較好的一致性，甘油濃度變化對檢測結(jié)果無明顯影響。

樣品空白對照與參比試驗(yàn)結(jié)果相對誤差在103～105 cfu/g接種水平下均小于10%，102 cfu/g接種水平下，42組試驗(yàn)僅4組相對誤差超過10%，但仍在15%以內(nèi)（表6）。

2.4? 質(zhì)控樣品試驗(yàn)

分別使用30%、35%、40%甘油-生理鹽水稀釋液對質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表7。由表7可知，3個甘油稀釋液測定結(jié)果均在特性值區(qū)間范圍內(nèi)，符合質(zhì)量控制需求，稀釋液中添加一定量的甘油對質(zhì)控樣品檢測結(jié)果無影響，操作過程中，30%～40%甘油對質(zhì)控樣品中微生物抑制性影響不大。

3? 結(jié)論

稀釋液甘油含量>30%時，可在一定時間內(nèi)有效改善魔芋膳食纖維固體飲料10倍稀釋液的流動性，提高樣品的均勻性，滿足微生物項(xiàng)目檢測的時間要求。抑制性試驗(yàn)表明，102～105 cfu/g接種水平下，不同濃度甘油-生理鹽水稀釋液檢測菌落總數(shù)結(jié)果無顯著差異，采用質(zhì)控樣品驗(yàn)證時，實(shí)測值均能在特性值區(qū)間，滿足質(zhì)量控制要求，對比試驗(yàn)中，接種水平103～105 cfu/g時，30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液檢測結(jié)果與參比試驗(yàn)均有較好的一致性，回收水平較高，102 cfu/g接種水平時，部分試驗(yàn)組結(jié)果與參比試驗(yàn)結(jié)果相對誤差較大，考慮參比對照試驗(yàn)中未加入魔芋膳食纖維，稀釋液體系存在一定差異，且低菌含量水平下，取樣造成誤差較大，但通過改良稀釋液樣品空白與參比試驗(yàn)結(jié)果，在不添加樣品情況下，低接種水平改良稀釋液樣品空白與參比試驗(yàn)結(jié)果相對誤差明顯降低，說明低接種水平下，主要誤差來源于稀釋液體系的差異，受甘油的影響不大，綜合考慮，30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液在低污染水平下也具有一定的適用性。

30%～40%甘油-生理鹽水稀釋液均能有效解決稀釋液凝膠速度快的問題，且具有良好的適用性，能夠滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制需求。考慮試驗(yàn)成本，改良稀釋液配方可為每100 mL稀釋液含甘油30 g、NaCl 0.85 g。由于檢驗(yàn)人員操作熟練程度不同，不同批次魔芋膳食纖維固體飲料葡甘聚糖含量有一定差異，凝膠速度有所不同，建議在試驗(yàn)前通過預(yù)試驗(yàn)確定最佳甘油添加比例，40%甘油-生理鹽水稀釋液對凝膠形成的延緩時間基本能夠滿足目前大多數(shù)產(chǎn)品檢測需要，但不排除有更高黏度樣品存在，當(dāng)甘油添加量超過40%時，需重新對改良稀釋液適用性進(jìn)行評估。

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